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LncRNA BCAR4-乳腺癌遷移、侵襲和化療耐藥的靶點(diǎn)

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2024-06-07
我們的發(fā)現(xiàn)為BCAR4的致癌作用提供了見解,并暗示BCAR4作為一種潛在的診斷生物標(biāo)志物和一種有前途的治療藥物......


乳腺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥已成為成功治療患者的障礙。lncRNAs被認(rèn)為是癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要參與者。LncRNA BCAR4在乳腺癌患者組織和血漿中顯著升高,并在乳腺癌細(xì)胞系中上調(diào)。BCAR4上調(diào)與TNM分期相關(guān),手術(shù)切除乳腺腫瘤后BCAR4下調(diào)。BCAR4的沉默抑制了乳腺癌細(xì)胞的集落形成、遷移、侵襲和異種移植瘤的生長(zhǎng),并促進(jìn)了化療敏感性。在機(jī)制上,BCAR4通過MAPK通路的miR-644a-CCR7軸促進(jìn)乳腺癌的遷移和侵襲。BCAR4通過與miR-644a結(jié)合并下調(diào)miR-644a,間接促進(jìn)ABCB1表達(dá),誘導(dǎo)乳腺癌化療耐藥。我們的發(fā)現(xiàn)為BCAR4的致癌作用提供了見解,并暗示BCAR4作為一種潛在的診斷生物標(biāo)志物和一種有前途的治療藥物,可以抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移和抑制化療耐藥。本文于20231月發(fā)表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”IF=12.658)上。


技術(shù)路線



結(jié)果

1BCAR4在乳腺癌組織和血漿樣本中顯著上調(diào)

我們從TCGA數(shù)據(jù)庫和StarBase V3.0中檢測(cè)了BCAR4在乳腺癌組織中的表達(dá)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中,BCAR41097個(gè)乳腺癌組織中表達(dá)高于114個(gè)非癌性乳腺組織(1A)。在StarBase V3.0中觀察到類似的結(jié)果(1B)。接著,我們檢測(cè)了80例乳腺癌患者和80例健康對(duì)照組的血漿樣本中BCAR4的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)乳腺癌血漿樣本中BCAR4水平明顯升高(1C) III期和IV期的BCAR4水平明顯高于I期和II(1D)。此外,我們分析了20對(duì)乳腺癌患者術(shù)前和術(shù)后血漿樣本。術(shù)后血漿樣本中BCAR4水平顯著降低(1E)。最后,我們檢測(cè)了BCAR4在不同乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。BCAR4MDA-MB-231MCF-7中均有高表達(dá)(1F),因此我們選擇了這兩個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果表明BCAR4在乳腺癌腫瘤和血漿樣本中顯著上調(diào)。



2BCAR4的下調(diào)抑制乳腺癌的遷移、侵襲和DOX耐藥

為探討BCAR4在乳腺癌中的作用,將BCAR4 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7MDAMB-231細(xì)胞。RT-qPCR檢測(cè)顯示,BCAR4 siRNA (si-1#si-2#si-3#)顯著抑制BCAR4的表達(dá),其中si-2#的抑制作用最大(2AE)Transwell檢測(cè)顯示si-2#降低了MCF-7MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲(2BCDFGH)。傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明,抑制BCAR4可減少乳腺癌細(xì)胞的遷移(2IJ)si-2#可顯著減少乳腺癌細(xì)胞中的菌落數(shù)量(2KL)。此外,抑制BCAR4可降低MCF-7MDA-MB-231細(xì)胞中DOX50%抑制濃度(IC50)(2MN)western blot檢測(cè)顯示,抑制BCAR4可下調(diào)ABCB1和兩種間充質(zhì)標(biāo)志物(VimentinVEGF)的表達(dá),并上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)(2O)。綜上所述,這些結(jié)果支持BCAR4的下調(diào)可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、化療耐藥、還有潛在的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。



3BCAR4下調(diào)miR-644a的表達(dá)

為了研究BCAR4促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展的潛在機(jī)制,我們尋找了與BCAR4結(jié)合的miRNA。在StarBase V3.0中預(yù)測(cè)miR-644a會(huì)與BCAR4相互作用(3A)HEK-293TMDA-MB-231MCF-7中的熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,過表達(dá)miR-644a會(huì)抑制BCAR4野生型(WT)構(gòu)建物的熒光素酶活性,但在突變型(MUT,圖3BDF)中不會(huì)。下調(diào)miR-644a會(huì)顯著增加WT BCAR4的熒光素酶活性,但在MUT中不會(huì)(3CEG)BCAR4的下調(diào)導(dǎo)致MCF-7MDA-MB-231細(xì)胞中miR-644a顯著上調(diào)(3H)。此外,80例乳腺癌患者血漿樣本中miR-644a水平低于健康對(duì)照組(3I)80例乳腺癌患者血漿中BCAR4miR-644a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(3J)。與非癌乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100相比,miR-644a在不同的乳腺癌細(xì)胞中也被下調(diào)(3K)。這些結(jié)果表明BCAR4在乳腺癌中直接結(jié)合并負(fù)調(diào)控miR-644a



4BCAR4在乳腺癌細(xì)胞中通過miR-644a下調(diào)促進(jìn)遷移、侵襲和化療耐藥性

我們用BCAR4 siRNA + miR-644a inhibitor轉(zhuǎn)染MCF-7MDA-MB-231細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞中,miR-644a抑制逆轉(zhuǎn)了BCAR4沉默導(dǎo)致的集群形成減少(4A, B)。傷口愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,共轉(zhuǎn)染miR-644a抑制劑逆轉(zhuǎn)了BCAR4 siRNA介導(dǎo)的MCF-7MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲減少(4C-4F)。此外,BCAR4沉默降低了細(xì)胞活力和DOXIC50,這在MDA-MB-231細(xì)胞中被miR-644a抑制劑逆轉(zhuǎn)(4G)。此外,在MCF-7MDA-MB-231細(xì)胞中,miR-644a抑制劑逆轉(zhuǎn)了BCAR4抑制導(dǎo)致的ABCB1VimentinVEGF的下調(diào)以及E-cadherin的上調(diào)(4H)。這些結(jié)果表明,BCAR4促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和化療耐藥性,至少部分是通過miR-644a的下調(diào)實(shí)現(xiàn)的。



5MiR-644a直接靶向CCR7,通過MAPK信號(hào)調(diào)節(jié)遷移和侵襲

我們將miR-644a模擬物和抑制劑引入MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行功能增益和功能損失研究。集落形成實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)染miR-644a mimicMDA-MB-231細(xì)胞形成的集落比對(duì)照細(xì)胞少。相反,轉(zhuǎn)染miR-644a inhibitorMDA-MB-231細(xì)胞的菌群數(shù)量明顯高于對(duì)照細(xì)胞(5A)。過表達(dá)miR-644a顯著抑制細(xì)胞遷移和侵襲,而抑制miR-644a則促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲(5B, C)。轉(zhuǎn)染miR-644a mimicMDAMB-231細(xì)胞存活率和對(duì)DOXIC50降低,而miR-644a inhibitor則顯示相反的結(jié)果(5D)。根據(jù)TargetScanmiRTarBasemiRDB的預(yù)測(cè),13個(gè)候選基因的3'UTR具有miR-644a結(jié)合位點(diǎn)(5E)。我們專注于CCR7基因(5E)CCR7及其配體CCL19通過觸發(fā)PI3K/AKTMAPKJAK/STAT3等多種信號(hào)通路,調(diào)控乳腺癌細(xì)胞EMT進(jìn)程,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移過程。在TCGA數(shù)據(jù)集中,與非癌性乳腺組織(5F)。值得注意的是,CCR7I期、II期和III期的表達(dá)較高(5G)。特別是,當(dāng)將乳腺腫瘤按分子亞型進(jìn)行分層時(shí),CCR7在腔內(nèi)、HER2陽性、三陰性腫瘤中的表達(dá)明顯高于非癌性乳腺組織(5H)。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-644a負(fù)向調(diào)控CCR7 WT 3’UTR的熒光素酶活性,但對(duì)突變體沒有影響(5I)。相反,當(dāng)miR-644a被抑制時(shí),含有野生型3’UTRHEK-293T細(xì)胞中熒光素酶活性明顯升高(5J)。在MDA-MB-231細(xì)胞中,過表達(dá)miR-644a顯著下調(diào)ABCB1VimentinVEGFCCR7p-ERKp-p38,上調(diào)E-cadherin。抑制miR-644a對(duì)這些蛋白水平有相反的影響(5K)。此外,在共轉(zhuǎn)染miR-644a抑制劑的MDA-MB-231細(xì)胞中,BCAR4抑制導(dǎo)致的CCR7p-ERKp-p38的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)(5L)。



6)下調(diào)BCAR4可減少體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

為了評(píng)估BCAR4下調(diào)是否會(huì)減少體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,我們將MDA-MB-231細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠的乳腺脂肪墊中。用體內(nèi)BCAR4 siRNA或?qū)φ战M治療異種移植腫瘤3周。我們發(fā)現(xiàn),siBCAR4治療小鼠的腫瘤發(fā)展比對(duì)照組慢(6AB)。肺和肝臟活檢顯示si-BCAR4小鼠的肺和肝臟轉(zhuǎn)移較少(6CD)。此外,免疫組織化學(xué)分析表明si-BCAR4可明顯提高E-cadherin的表達(dá),抑制CCR7VEGFVimentin的表達(dá)(6E)。這些結(jié)果表明,下調(diào)BCAR4可通過提高體內(nèi)CCR7的表達(dá),顯著降低乳腺癌的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。


 

結(jié)論:

我們發(fā)現(xiàn)BCAR4通過miR-644a-CCR7軸和MAPK通路加速乳腺癌的遷移和侵襲。BCAR4還上調(diào)ABCB1以誘導(dǎo)乳腺癌的化療耐藥。這些發(fā)現(xiàn)表明BCAR4是乳腺癌轉(zhuǎn)移和耐藥的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。


參考文獻(xiàn):

Wu T, Li X, Yan G, Tan Z, Zhao D, Liu S, Wang H, Xiang Y, Chen W, Lu H, Liao X, Li Y, Lu Z. LncRNA BCAR4 promotes migration, invasion, and chemo-resistance by inhibiting miR-644a in breast cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jan 10;42(1):14. doi: 10.1186/s13046-022-02588-8.