N7 -甲基鳥苷(m7G)是一種最常見的RNA表觀修飾，常位于真核生物mRNA的5’帽和內部位置，或所有物種的rRNA和tRNA內部。m7G修飾通過影響各種RNA分子的代謝，包括mRNA、tRNA、microRNA和核糖體RNA。越來越多的證據表明，m7G在人類疾病的發展中發揮著關鍵作用。目前m7G中標的項目越來越多，但又不會像其他熱點一樣被研究的很泛濫，因此不失為基金申請的好方向。下圖為22年部分m7G中標項目的題目： 

       METTL1介導的N7-甲基鳥苷tRNA修飾的失調可以促進腫瘤發生。在這里，作者報告說，這種修飾調節了自噬途徑的mTOR和負調節因子中蛋白質的翻譯，導致食管鱗狀細胞癌的進展。

       在這項研究中作者證明METTL1和WDR4表達水平在ESCC中顯著上調，并與ESCC不良預后相關。此外，METTL1和WDR4在體外和體內通過tRNA m7G甲基轉移酶活性促進ESCC進展。從機制上來講，從機制上講，METTL1或WDR4敲低可導致m7G修飾的tRNA表達減少，并減少在RPTOR/ULK1/自噬途徑中富集的致癌轉錄物的翻譯。我們的研究證明提供了tRNA的m7G修飾失調在ESCC中的致癌功能，并且提示靶向METTL1以及其下游信號軸可能是ESCC治療的一個潛在靶點。該研究于22年5月發表于《Nature Communication》 IF：16.6

技術路線

1.METTL1/WDR4 在 ESCC 中上調，并與 ESCC 預后不良相關

       在ESCC病人樣本中檢查了METTL1 / WDR4的表達，數據顯示與鄰近正常組織相比，食管鱗狀細胞癌腫瘤組織的METTL1/WDR4 和 m7G修飾顯著升高（圖1A和B）。此外，免疫組化（IHC）染色顯示，食管腫瘤組織中METTL1的表達高于鄰近正常組織（圖1C和D）。此外，METTL1的表達與高腫瘤分級和分期顯著相關 （1F-H）。接著研究了METTL1表達與ESCC患者預后的關系,生存分析表明，METTL1高表達與較差的總生存期和無病生存狀態相關（圖1I和J）。同樣，WDR4在ESCC中也上調，并與ESCC患者的不良預后相關（圖1K和L）。總的來說，數據顯示，METTL1和WDR4在ESCC中顯著上調，并與ESCC進展和預后不良相關。

2.敲低METTL1 在異種移植模型中抑制ESCC進展

       ESCC中METTL1表達的升高，因此作者認為METTL1在ESCC進展中起著促進的功能。為了驗證這一假設，首先在 KYSE150和KYSE30著兩種ESCC 細胞中使用敲低METTL30， 發現敲低METTL1后能夠抑制K150和K30細胞增殖（圖2B）和集落形成能力（圖2C和D）的。此外，流式分析顯示，敲低METTL1能夠導致 ESCC 細胞凋亡水平增加（圖2E和F）。接著利用異種移植小鼠模型探討了METTL1在體內ESCC進展中的作用，與對照組相比，敲低METTL1組小鼠腫瘤生長明顯減緩并且腫瘤大小和重量減小（圖2G-I）。免疫組化結果顯示，敲低METTL1組的腫瘤中，Ki67水平下降，證明METTL1敲低后降低了ESCC在體內的增殖活性（圖2J和K）。綜上所述，研究揭示了METTL1在體外和體內ESCC進展中的基本功能，即METTL1與ESCC發展呈現正相關。

3.METTL1在ESCC中調控m7G tRNA修飾、tRNA表達和mRNA翻譯

       為了研究METTL1在ESCC進展中功能的分子機制，作者使用之前TRAC-seq 方法(tRNA還原和切割測序)，利用METTL1缺失和對照ESCC細胞分析了總的tRNA m7G修飾水平。在TRACseq數據庫中鑒定了19個m7G修飾的tRNA，這些tRNA在可變環中具有“ABGWY”序列(圖3A)。METTL1缺失顯著降低了tRNA的m7G修飾水平(圖3B和C)。RNA質譜分析同樣也證實了METTL1敲除的細胞中tRNA m7G修飾水平的降低(圖3d)。此外，METTL1的缺失降低了大多數m7g修飾的trna的表達水平，而非m7g修飾的trna的表達幾乎沒有受到影響此外(圖3E和F)。與tracseq數據一致，m7G northwestern和northern實驗證實，METTL1敲除細胞中m7G修飾水平降低，m7G修飾trna表達減少（圖3G）。此外，野生型METTL1而非其無催化活性的突變體的過表達增加了總m7G tRNA修飾水平和m7G修飾tRNA的表達，證明了METTL1通過其tRNA m7G甲基轉移酶活性調控tRNA修飾和表達（圖3H）。同樣，抑制WDR4導致m7G修飾水平降低，在K150和K30 ESCC細胞中，過表達WDR4增加了m7G tRNA修飾和m7G修飾的tRNA表達(圖3I和J)。這些數據均表明了METTL1/WDR4在調節tRNA m7G修飾和表達中的重要功能。

       tRNA在mRNA翻譯中起作用，我們接下來確定了METTL1對ESCC細胞mRNA翻譯的影響。多聚體分析顯示，METTL1敲低細胞的mRNA翻譯活性降低，多核糖體峰值降低(圖3K)。此外，嘌呤霉素攝入測定也證實，METTL1敲低會降低ESCC細胞的mRNA翻譯活性(圖3L)。在METTL1缺失的細胞中，重新表達野生型METTL1而不是其突變體恢復了mRNA的翻譯效率，證明m7G的催化功能對METTL1促進mRNA翻譯至關重要。總的來說，我們的數據表明，mettl1介導的m7G tRNA修飾對ESCC中tRNA的表達和mRNA翻譯至關重要。

       為了研究m7G修飾異常而導致的翻譯異常所產生的影響，使用METTL1敲除和對照ESCC細胞進行了多聚核糖體測序(圖3M)。為了研究mRNA翻譯與tRNA m7G修飾之間的聯系，計算了測序結果當中mRNA上的 m7G 修飾的 tRNA 所對應的密碼子的數量。結果顯示，mRNA上m7G修飾的 tRNA 所對應的密碼子越多，翻譯效率（Translation efficiencies, TE）也就越低。(圖3N)。Go分析和KEGG信號通路分析顯示TE-down mRNA在自噬生物學過程和mTOR信號通路中顯著富集（圖3O和P）。值得注意的是，與其他檢測到的mrna相比，那些te降低、參與自噬生物學過程或mTOR信號通路的mRNA被m7G修飾的tRNA解碼的密碼子數量更多(圖3Q)。接下來，我們確定了METTL1在調節自噬負調控基因和mTOR信號通路基因表達中的功能。我們的數據顯示，METTL1缺失降低了它們的蛋白質表達，但對它們的mRNA影響很小(圖3R和S)。此外qPCR實驗進一步證實，在METTL1缺失的細胞中，編碼mTOR關鍵成分的RPTOR (mTOR復合物1的調控相關蛋白)的翻譯效率顯著降低(圖3T)。因此，我們隨后測定了METTL1敲除細胞中pULK1和自噬標志物微管相關蛋白輕鏈3 LC3-II和LC3-I的水平。在氯喹(CQ)處理和未處理的K150和K30細胞中，METTL1缺失降低了pULK1水平，增加了LC3-II/LC3-I的比率(圖3U和V)，表明METTL1敲除的ESCC細胞中自噬水平增加。這些數據表明，翻譯損傷發生在細胞死亡和自噬之前，表明METTL1敲低降低mRNA翻譯，從而導致ESCC細胞死亡和自噬。綜上所述，我們的數據表明，METTL1以m7G相關密碼子依賴的方式促進mTOR信號相關基因的翻譯和自噬途徑的負調控。

4.在ESCC中，RPTOR是METTL1的重要下游靶點

       我們進一步發現，在METTL1缺失的ESCC細胞中，重新表達RPTOR恢復了增殖和集落形成能力（圖4 A- D），此外，RPTOR過表達增加了ULK1磷酸化水平，降低了METTL1缺失細胞中LC3-II/LC3-I的比例，消除了ESCC細胞的自噬通量(圖4E-H)。總的來說，這些數據揭示了RPTOR是METTL1的重要下游靶點，并進一步支持了METTL1介導的tRNA m7G修飾通過調控RPTOR促進ESCC進展。因為RPTOR可以在METTL1敲低的ESCC細胞中挽救ULK1的磷酸化水平并減少自噬，接下來在METTL1缺失的ESCC細胞中敲低ULK1，以確定METTL1和RPTOR是否通過調節ULK1介導的自噬來促進ESCC的進展(圖4I)。結果表明，抑制ULK1可以挽救METTL1缺失的ESCC細胞的生長(圖4J)，進一步證明METTL1和RPTOR通過ULK1調節ESCC的進展。此外，自噬通量檢測顯示，敲低ULK1可以消除METTL1缺失的ESCC細胞中增加的自噬通量(圖4K-M)。總的來說，我們的數據揭示了RPTOR/自噬軸在介導METTL1在ESCC進展中的功能中的重要作用。

5.敲除 METTL1抑制ESCC腫瘤發生

       為了在體內直接探索m7G tRNA修飾在ESCC腫瘤發生中的作用，構建組織特異性Mettl1敲除小鼠模型。在使用他莫昔芬誘導Mettl1敲除后，Mettl1敲除和對照小鼠分別使用DNA烷基化劑二乙基亞硝胺(DEN)和多激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib)誘導ESCC發生腫瘤32(圖5A)。經DEN處理8周，索拉非尼處理12周后，發現對照組小鼠食管發生了明顯的病理變化，而Mettl1敲除小鼠的病變面積和ESCC數量明顯減少(圖5A-E)。組織學分析顯示，Mettl1敲除小鼠腫瘤中METTL1和Ki67染色水平降低(圖5F和G)。我們還發現，Mettl1敲除降低了小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾，降低了RPTOR蛋白水平(圖5H-J)，這些數據支持METTL1和m7G tRNA修飾在體內調節RPTOR mRNA的翻譯和RPTOR下游靶點的活性。值得注意的是，敲除組腫瘤中LC3蛋白水平明顯高于對照組(圖5L和M)，表明Mettl1敲除導致體內自噬增加。總之，這些結果支持METTL1介導的m7G tRNA修飾在促進ESCC體內腫瘤發生中的關鍵功能。

6.METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾促進ESCC進展

       為了進一步加強m7G tRNA修飾與ESCC進展之間的功能聯系，我們進行了功能獲得研究(圖6A)。我們的數據顯示，強制表達野生型METTL1而非其催化死突變體可以促進ESCC細胞的生長和集落形成(圖6B-E)。此外，過表達METTL1而非其突變體上調RPTOR蛋白表達，減少細胞凋亡和自噬(圖6F-I)。總的來說，我們的數據顯示tRNA m7G的催化功能對于METTL1調節靶表達和ESCC進展至關重要。然后，我們在ESCC細胞中過表達WDR4，以進一步證實m7G tRNA修飾促進ESCC進展的結論。我們的數據顯示，過表達WDR4可以穩定METTL1蛋白的表達，并增加下游靶點RPTOR的表達(圖6J)。METTL1調節tRNA m7G修飾、tRNA表達和致癌mRNA翻譯。ESCC細胞生長和集落形成(圖6K-M)。這些數據支持WDR4是促進ESCC進展的重要癌基因。總之，我們的研究結果有力地支持了METTL1/WDR4介導的m7G tRNA修飾在ESCC進展調控中的重要致癌功能。

7.METTL1促進體內ESCC原位瘤的發生

       我們進一步建立了METTL1條件敲除蛋白小鼠模型，并誘導ESCC腫瘤發生，探討METTL1在ESCC腫瘤發生中的作用。DEN/sorafenib治療18周后(圖7A)， METTL1敲除小鼠的食道出現了大量的腫瘤，而對照組小鼠的食道只發生了少量和較小的病變(圖7B和C)。此外，敲除小鼠的異常增生和鱗狀細胞癌的數量明顯高于對照組(圖7D和F)。組織學分析顯示cKI小鼠腫瘤中METTL1表達水平較高增殖活性高于對照小鼠(圖7G和H)。我們進一步發現，與對照小鼠相比，敲除小鼠腫瘤中m7G tRNA修飾和m7G修飾tRNA的表達升高(圖7I)。此外，在METTL1 cKI小鼠腫瘤中，RPTOR蛋白水平升高，而mRNA水平未見升高(圖7J-M)。綜上所述，這些結果揭示了METTL1m7G tRNA修飾促進了ESCC在體內的腫瘤發生和發展。

結論

       總的來說作者認為tRNA m7G修飾可以通過調控細胞自噬最終促進ESCC的發生。METTL1可能是ESCC患者的一個有希望的治療靶點

實驗方法

免疫組化，免疫熒光染色，qRT-PCR ，Western blot，Northwestern blot，Northern blot，多核糖體分析，TRAC-seq，多核糖體測序，ribo-seq，自噬通量檢測，流式檢測凋亡細胞，克隆形成，細胞增殖，小鼠皮下成瘤，小鼠基因敲除

參考文獻

Han H, Yang C, Ma J, et al. N7-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis. Nat Commun. 2022;13(1):1478. Published 2022 Mar 18.