m6A修飾與包括膽管癌(CCA)在內的人類癌癥的進展有關。METTL16最近被鑒定為一種新的RNA甲基轉移酶，負責m6A修飾，盡管METTL16在CCA中的作用尚未被研究。本研究旨在探討RNA甲基轉移酶METTL16在CCA中的作用及其機制。我們觀察到METTL16在人CCA組織中的表達明顯增加。METTL16的缺失可顯著抑制CCA細胞增殖，降低腫瘤進展。PRDM15被鑒定為CCA細胞中METTL16的關鍵靶點。從機制上講，我們的數據表明METTL16通過依賴YTHDF1的翻譯調節PRDM15蛋白的表達。我們觀察到恢復PRDM15的表達可以挽救METTL16缺失導致的CCA細胞增殖/集落形成缺陷。我們隨后的分析顯示，METTL16-PRDM15信號調節CCA細胞中FGFR4的表達。我們觀察到PRDM15蛋白與FGFR4啟動子相關，以調節其表達。此外，我們發現在CCA細胞中，組蛋白乙酰轉移酶p300與轉錄因子YY1共同作用，通過組蛋白H3賴氨酸27 (H3K27)乙?；{節METTL16基因的表達。本研究描述了一種新的METTL16-PRDM15-FGFR4信號軸，它對CCA生長至關重要，可能具有重要的治療意義。我們發現，METTL16的缺失顯著抑制了CCA細胞的增殖并降低了腫瘤的進展。本文于2023年10月發表于“Journal of Experimental & Clinical Cancer Research”（IF=11.3）上。

技術路線

結果

1）METTL16在CCA中上調

       我們分析了METTL16在CCA和非腫瘤組織樣本中的表達。我們的分析表明，在TCGA-膽管癌(TCGA-CHOL)(圖1A)和GSE107943(圖1B)數據集中，與匹配或未匹配的非腫瘤組織相比，METTL16在CCA組織中的表達上調。對GSE107101數據集的分析顯示，與原發性CCA組織相比，晚期CCA組織中METTL16的表達水平更高(圖1C)。對TCGA-CHOL數據集中現有臨床數據的患者進行進一步的生存分析表明，CCA組織中METTL16的高表達往往與患者生存率較差相關(圖1D)。通過對人CCA組織中METTL16進行免疫組化(IHC)染色，我們觀察到METTL16在CCA中的表達明顯高于正常膽管上皮(圖1E和1F)。這些臨床分析表明METTL16在CCA中具有潛在的致癌作用。

2）METTL16的缺失抑制CCA細胞生長

       為了確定METTL16在CCA細胞中的功能作用，我們使用兩組siRNA在兩種人類CCA細胞系(CCLP1和HuCCT1)中敲低METTL16。Western blot分析證實了令人滿意的敲除效果(圖2A)。我們觀察到，METTL16的敲除導致CCA細胞增殖和集落形成能力顯著下降(圖2B和2C)。同時，我們使用CRISPR/Cas9基因編輯方法刪除了CCLP1和HuCCT1細胞中METTL16的表達(圖2D)。與siRNA敲低結果一致，CRISPR/Cas9導致METTL16的缺失也顯著降低了CCA細胞的增殖和集落形成(圖2E和2F)。這些結果證明了METTL16在體外CCA細胞生長中的重要作用。然后，我們將CRISPR/cas9介導的METTL16敲除和對照CCA細胞皮下接種NOD/SCID小鼠。如圖3A至3F所示，在這種異種移植腫瘤模型中，METTL16的缺失顯著抑制了CCA的生長。同時，我們采用了一種單獨的CCA異種移植模型，將人CCA細胞接種到NOD/SCID小鼠的肝臟中。我們觀察到，當腫瘤細胞接種到肝臟中時，METTL16缺失也顯著抑制了CCA的生長(圖3G-3I)。綜上所述，這些發現證明了METTL16在體內對CCA生長的重要作用。

3）PRDM15是METTL16的直接靶點

       為了確定METTL16在CCA中致癌作用的潛在下游靶點，我們在人CCA細胞(CCLP1和HuCCT1)中進行了m6A甲基化RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)。通過分析m6A RNA-seq數據，我們鑒定出80個具有m6A RNA修飾的基因，這些基因在METTL16敲除后在這兩個細胞系中至少減少了1.5倍(圖4A(a))。對鑒定基因的GO富集分析顯示，在涉及甲基轉移酶活性的生物過程中存在富集(圖4A(b))。所鑒定的基因包括PRDM15、SETD5、KMT2D和NSD2，與正常組織相比，這些基因在CCA中的表達均上調。與對照細胞相比，METTL16缺失的細胞中與這4個基因相關的m6A峰的讀數降低(圖4A(c))。MeRIP-qPCR證實CCLP1和HuCCT1細胞中METTL16缺失后m6A水平顯著降低(圖4A(d))。Western blotting分析顯示，METTL16缺失降低了PRDM15的蛋白表達，而不影響SETD5、KMT2D和NSD2的蛋白水平(圖4B，C)。因此，PRDM15是CCA細胞中METTL16的直接靶點。敲低YTHDF1，而不敲低YTHDF3，會降低CCA細胞中PRDM15蛋白的表達(圖4D)。這些發現表明，YTHDF1在CCA細胞中調節PRDM15蛋白的表達。我們隨后進行了RIP實驗。數據顯示，YTHDF1蛋白能夠在CCA細胞中結合PRDM15 mRNA。值得注意的是，METTL16的缺失顯著降低了YTHDF1蛋白與PRDM15 mRNA之間的相互作用(圖4E)。為了進一步確定YTHDF1在PRDM15翻譯中的作用，我們進行了核糖體免疫沉淀試驗。如圖4F所示，在對照細胞中，核糖體積累了PRDM15 mRNA，而在YTHDF1缺失的細胞中，PRDM15 mRNA的核糖體占用率顯著降低。這些結果表明，在CCA細胞中，METTL16通過RNA m6A修飾和YTHDF1依賴的翻譯機制調控PRDM15。

4）PRDM15參與METTL16介導的CCA細胞生長

       為了證明PRDM15在CCA中的功能作用，我們分析了PRDM15缺失后CCA細胞的細胞增殖和集落形成能力。我們的數據顯示，PRDM15的缺失顯著抑制了CCA細胞的增殖和集落形成能力(圖5A-5C)。基于這些結果，我們在METTL16缺失的CCA細胞中進行了PRDM15強制過表達的拯救實驗。我們觀察到，PRDM15的恢復能夠部分修復METTL16缺失引起的CCA細胞增殖/集落形成缺陷(圖5D-5F)。這些結果表明，PRDM15是CCA細胞中METTL16在功能上的重要靶點。

5）METTL16誘導的PRDM15調控FGFR4的表達

       由于PRDM15是一種轉錄調節因子，我們試圖進一步確定METTL16誘導的PRDM15在CCA細胞中的潛在下游靶點。為此，我們比較了CCA細胞中METTL16調控的基因(來自我們的RNA-Seq數據)與PRDM15正相關的基因(來自TCGA-CHOL數據庫)。這種方法鑒定出19個METTL16調控的基因，它們在CCA中與PRDM15呈正相關(圖6A)。在已鑒定的19個基因中，我們選擇關注FGFR4，該基因已被充分證明在CCA中發揮重要作用。為了確定PRDM15對FGFR4表達的影響，我們分析了PRDM15缺失的CCA細胞中FGFR4的mRNA和蛋白表達。我們的數據顯示，PRDM15的缺失降低了FGFR4的mRNA和蛋白質水平(圖6B和6C)。接下來，我們評估了FGFR4是否可能是PRDM15的直接靶點。為此，我們進行了轉錄因子結合譜分析，以尋找FGFR4基因啟動子中可能的PRDM15結合位點。這項工作鑒定出了FGFR4啟動子中三個推測的PRDM15結合位點(圖6D)。基于這些信息，我們進行了ChIP-qPCR檢測，以確定其與FGFR4基因啟動子的關聯。我們的實驗結果證實了PRDM15與CCA細胞中FGFR4基因啟動子的結合(圖6D)。為了進一步驗證METTL16-PRDM15對FGFR4的調控，我們檢測了METTL16缺失細胞中FGFR4的表達。我們的數據顯示，METTL16的缺失導致FGFR4表達的減少，而這種影響被PRDM15的強制過表達逆轉(圖6E)。與METTL16介導的PRDM15-FGFR4調節一致，我們的數據顯示，METTL16被其GapmeR反義寡核苷酸(ASO)消耗后，降低了CCA細胞中PRDM15和FGFR4的蛋白水平(圖6F)。此外，我們發現聯合使用FGFR4抑制劑BLU-554和METTL16 GapmeR ASO表現出更強的腫瘤抑制作用(圖6G)。

6）H3K27ac介導METTL16表達的調控

       鑒于METTL16在CCA細胞中的表達顯著增加及其致癌作用，我們進一步研究了METTL16在CCA細胞中的表達上調機制。我們使用UCSC基因組瀏覽器分析了METTL16啟動子。分析顯示，METTL16基因的啟動子區域高度富集了組蛋白H3賴氨酸27乙?；?H3K27ac)(圖7A)。這一觀察結果表明，METTL16的表達可能在轉錄水平上受到組蛋白乙?；目刂?。通過使用抗H3K27ac進行ChIP-qPCR檢測，我們在CCA細胞的METTL16啟動子處發現了H3K27ac的增加(圖7B)。由于p300(也稱為EP300)和CBP是組蛋白乙酰化所必需的，我們使用抗p300和抗CBP分別進行了ChIP-qPCR檢測；這些研究的結果證實了METTL16啟動子上p300的富集，而不是CBP的富集(圖7C)?；谶@些結果，我們用p300抑制劑C646處理CCA細胞進行了進一步的實驗。我們的數據顯示，用p300抑制劑C646處理CCA細胞顯著降低了METTL16啟動子處的H3K27ac和p300富集(圖7D和7E)。相應地，C646處理也降低了CCA細胞中METTL16 mRNA和蛋白水平(圖7F和7G)。這些發現表明，在CCA細胞中，p300介導的組蛋白H3賴氨酸27乙?；{節了METTL16的表達。

7）YY1與p300合作調控METTL16的表達

       由于p300通常被轉錄因子募集到靶基因啟動子，我們進一步研究了可能與p300協同調節CCA細胞中METTL16表達的轉錄因子。通過分析BioGrid預測的p300相互作用因子和SwissRegulon預測的METTL16推定轉錄因子，我們檢測到這兩個數據集中共有13個轉錄因子(圖8A)。通過分析TCGA數據庫中METTL16與CCA組織中鑒定的轉錄因子之間的相關性，我們發現CCA組織中有5個轉錄因子與METTL16呈正相關，包括SP1、SP3、TBL1XR1、YY1、和ZBTB3(圖8B)。與非腫瘤組織相比，上述五種轉錄因子在CCA中升高(圖8C)，但在CCA中只有YY1的表達與患者生存相關(圖8D)?；谶@些分析，我們進行了進一步的實驗來證明YY1和P300在CCA細胞中的相互作用。如圖8E所示，免疫沉淀法證實p300與YY1在CCLP1和HuCCT1細胞中存在關聯。通過對JASPAR數據庫的分析，我們在METTL16的啟動子區域發現了兩個YY1結合位點(圖8F)。通過ChIP-qPCR檢測，我們發現YY1能夠結合METTL16啟動子上的這兩個位點。此外，我們觀察到用p300抑制劑C646處理CCA細胞可顯著降低YY1與METTL16啟動子的結合(圖8F)。綜上所述，YY1與p300共同調控CCA細胞中METTL16基因的表達。

結論

       我們的實驗發現揭示了一種新的METTL16-PRDM15-FGFR4信號軸，它與CCA有重要關系，可能作為新的治療靶點。

實驗方法

qRT?PCR，Western blot，IHC，RIP，m6A測序，免疫沉淀，MeRIP-qPCR，ChIP，動物實驗。

參考文獻

Liu N, Zhang J, Chen W, Ma W, Wu T. The RNA methyltransferase METTL16 enhances cholangiocarcinoma growth through PRDM15-mediated FGFR4 expression. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Oct 11;42(1):263. doi: 10.1186/s13046-023-02844-5.