肝纖維化是肝臟對各種損傷的傷口愈合反應，與嚴重的發病率和死亡率有關。目前，除肝移植外，尚無治療肝纖維化的有效方法。在肝損傷期間，靜止的肝星狀細胞(HSC)被激活并轉分化為α -平滑肌肌動蛋白(a-SMA)陽性的肌成纖維細胞，這是纖維化肝臟中膠原生成細胞的主要貢獻者。最近，包括有氧糖酵解在內的代謝重編程已成為HSC激活的一個關鍵特征，有證據表明，抑制有氧糖酵解可阻止HSC激活。盡管觀察到在HSC激活過程中有氧糖酵解的增強會增加乳酸的產生，但乳酸與HSC激活相關的潛在機制仍然難以捉摸。該文章就該問題進行了詳細的闡述，于2023年9月發表在《Cell Metabolism》,IF=29。

技術路線

主要研究結果

1、HK2的催化活性誘導組蛋白乙酰化，但不誘導組蛋白乙酰化

       為了探討HK2的表達及其催化活性是否影響組蛋白乳酸化，作者使用了中國倉鼠卵巢(CHO)細胞MI5-4（HK基因表達不可見且HK活性有限的）。作者在這些細胞中表達野生型(WT) HK2或激酶死亡突變型(SA) HK2。在突變體中，丙氨酸取代了催化活性所需的氨基末端和羧基末端的絲氨酸殘基(S155A/S603A)。如圖1A所示，在MI5-4 CHO細胞中，WT和SA HK2的表達水平相同。然而，細胞外酸化率(ECAR)測量顯示，糖酵解活性僅在WT HK2細胞中顯著增加(圖1B和1C)。WT HK2細胞的糖酵解活性也導致乳酸產生和細胞乳酸水平的顯著誘導(圖1D)。為了確定HK2誘導的乳酸生成是否足以促進細胞中組蛋白的乳酸化，作者檢測了H3K18la。賴氨酸殘基也被乙酰化(H3K18ac)。有趣的是，H3K18la在空載體(EV)和SA HK2細胞中幾乎檢測不到，但在WT HK2細胞中卻高度升高，而H3K18ac無論HK2表達如何都可以檢測到，在WT HK2細胞中略有降低(圖1E)。除了H3K18la外，作者發現H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la也僅在WT HK2細胞中升高。作者還觀察到，在WT HK2細胞中，非組蛋白的乙酰化程度大多升高，而在WT HK2細胞中，盡管細胞乙酰輔酶a水平較高，但大多數非組蛋白的乙酰化程度沒有增加，甚至降低。為了進一步闡明H3K18la和H3K18ac的潛在功能意義，作者接下來進行了一種新的全基因組免疫檢測CUT&Tag。對H3K18la和H3K18ac的全基因組分布分析表明，這兩種組蛋白修飾主要位于啟動子區域(圖1F)。與作者的免疫印跡實驗結果一致，作者還觀察到，在WT HK2中，H3K18la峰在轉錄起始位點(tss)附近增加，但H3K18ac峰沒有增加H3K18ac峰甚至略有下降(圖1G)。為了確定H3K18la和H3K18ac調控的潛在候選基因，作者首先比較了相同基因啟動子區域的組蛋白修飾水平。在WT HK2細胞中，大多數基因標記為H3K18la升高，而H3K18ac未被顯著誘導(圖1H和1I)。只有在WT HK2細胞中，這些基因的H3K18ac均未升高。因此，雖然HK2的表達，通過增加糖酵解，可以增加乳酸和乙酰輔酶a的水平，但它只影響組蛋白的乳酸化。

圖1、在MI5-4 CHO細胞中，HK2表達誘導糖酵解、乳酸生成和組蛋白乳酸化

2、H3K18la標記基因參與基因表達調控和多種代謝過程

       為了研究HK2表達和乳酸如何通過組蛋白乳酸化影響全局基因表達，作者首先通過外源性乳酸處理優化組蛋白乳酸化水平。作者發現，在EV細胞中，10 mM乳酸處理24小時，誘導的H3K18la水平與WT HK2細胞相當(圖2A)。接下來，作者進行RNA測序(RNA-seq)來比較對照細胞(EV)、WT HK2細胞和乳酸處理的對照細胞(EV + Lac)的轉錄組。作者的差異表達基因(DEG)分析顯示，外源性乳酸處理改變基因表達的模式與在WT HK2細胞中觀察到的相似，通常上調1109個基因(WT HK2為68.5%，EV + Lac為62.7%)，下調1532個基因(WT HK2為75.6%，EV + Lac為75.0%)(圖2B, 2C)。接下來，作者確定了493個被HK2和乳酸處理上調的基因，這些基因在其啟動子區域也被H3K18la標記(圖2D)。在作者對基因本體(GO)生物過程(GOBP)術語的分析中，H3K18la標記的基因參與了基因表達、RNA和蛋白質代謝過程以及蛋白質修飾過程的調控(圖2E)。通過qPCR證實，在EV、WT HK2、SA HK2和EV + Lac細胞中，選擇了富含GOBP項的基因表達，包括冠層FGF信號調節因子2 (Cnpy2)、轉錄延伸因子Supt4a、富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子11 (Srsf11)、線粒體轉錄拯救因子1 (Mtres1)、金屬蛋白酶組織抑制劑1 (Timp1)和富含小脯氨酸蛋白1a (Sprr1a)。此外，在所選基因的啟動子處驗證了H3K18la和H3K18ac峰，在WT HK2細胞中觀察到H3K18la峰明顯增加，H3K18ac峰略有下降(圖2G)。為了進一步證明HK2表達與組蛋白乳酸化之間的關系，作者生成了表達誘導HK2的MI5-4細胞。根據ECAR和耗氧率(OCR)的升高，證實了誘導HK2表達引起的糖酵解活性。與作者關于HK2組成表達的研究結果一致，作者觀察到誘導可誘導的HK2表達也誘導了H3K18la，同時誘導了基因表達，而將HK2表達降低到基礎水平則消除了這種作用。綜上所述，這些結果表明HK2表達可提高糖酵解活性和乳酸生成，從而通過H3K18la影響基因表達。

圖2、HK2/ h3k18la特異性基因參與MI5-4 CHO細胞的基因表達和多種代謝過程的調控

3、H3K18la在活化的小鼠和HSC中被誘導

       最近的研究表明，在慢性炎癥和纖維化過程中，糖酵解的增強不僅局限于癌細胞，也發生在肝、肺和腎臟的成纖維細胞和肌成纖維細胞中。肝損傷后，靜止的HSC被激活，成為纖維化肝臟中肌成纖維細胞的主要群體。盡管大量研究表明，通過誘導各種糖酵解酶，HSC的激活伴隨著乳酸的產生，但乳酸是如何與HSC的激活聯系在一起的仍是未知的。基于上述在MI5-4 CHO細胞中的發現，作者假設在HSC激活過程中，產生HK2的乳酸可能通過組蛋白乳酸化影響基因表達。為了驗證這一假設，作者首先在CCl4注射或膽管結扎(BDL)引起的小鼠肝纖維化模型中證實了HK2的表達。作者觀察到，在纖維化肝臟中，HK2的表達主要與表達a- SMA的肌成纖維細胞共定位。隨后，作者用其他HSC激活誘導基因(Col1a1和Timp1)評估了HK2的mRNA水平，并觀察到纖維化肝臟中HK2與HSC激活誘導的基因表達水平呈正相關。接下來，作者從小鼠肝臟中分離原代HSC。作者的免疫印跡分析顯示，在注射ccl4的小鼠肝臟的原代HSC中，HK2的表達被強烈誘導，而在健康肝臟的HSC中已經表達的HK1，僅在活化的HSC中被輕微誘導(圖3A)。同樣，在靜止的HSC中檢測不到HK2的表達，但在培養3天和7天的小鼠原代HSC中，作者觀察到HK2的強烈表達和a-SMA的表達(圖3B)。在ccl4注射小鼠肝臟的原代HSC、BDL小鼠肝臟的HSC(公開可訪問的RNA-seq數據集GEO: GSE154170)和體外培養7天的HSC(公開可訪問的微陣列數據集GEO: GSE34949)中，也驗證了HK2而非HK1的強誘導作用。然而，肝臟中主要的HK亞型，葡萄糖激酶(GCK)，在小鼠原代肝細胞中表達，而在靜止和激活的HSC中不表達(圖S3K)。接下來，對ECAR、乳酸生成和細胞乳酸水平的測量顯示，活化的HSC中糖酵解活性明顯升高(圖3C)，導致體內和體外活化過程中H3K18la誘導(圖3D和3E)。重要的是，除了H3K18la外，H3K9la、H3K14la、H4K8la和H4K12la在體外激活的HSC中也被誘導表達。與H3K18la不同，H3K18ac存在于靜止的HSC中，其水平在體內激活的HSC中保持不變，但在體外激活時被抑制，這表明HSC激活可能需要H3K18la而不需要H3K18ac。與組蛋白乳酸化和乙酰化一致，作者還發現非組蛋白乳酸化主要在體外活化的HSC中升高，但乙酰化主要降低。為了在人類臨床環境中加強作者的發現，作者對肝硬化患者的人肝組織進行了雙重免疫熒光染色。患者肝臟免疫染色顯示，82.9%±3.1%的a-SMA+細胞表達HK2, 63.0%±5.2%的細胞表達H3K18la, 78.2%±3.6%的COL1a1+細胞表達HK2, 66.6%±5.1%的細胞表達H3K18la(圖3F)，支持HSC活化與HK2表達和H3K18la存在的聯系。總之，這些結果表明，誘導的HK2表達和糖酵解活性可能通過H3K18la在小鼠和人活化的HSC中發揮作用。

圖3、在HSC活化過程中，HK2/H3K18la被誘導并調控基因表達

4、H3K18la富集于活化HSC中誘導的基因的啟動子區域

       為了進一步確定H3K18la在HSC激活過程中是否在基因表達中發揮作用，作者對剛從健康肝臟分離或培養6天的小鼠原代HSC進行了全基因組的CUT&Tag。有趣的是，活化的HSC中的H3K18la主要分布在啟動子區域(42.5%)，而H3K18ac在啟動子區域的分布程度要小得多(27.4%)，甚至低于包含子(28.2%)和遠端基因間區域(34.5%)(圖3G)。這些發現表明，H3K18la，而不是H3K18ac，在HSC激活過程中，在基因表達的誘導中起主要作用。通過分析啟動子區域，作者確定了4070個基因為H3K18la標記的候選基因，117個基因共享H3K18la和H3K18ac，只有20個基因為H3K18ac標記的候選基因(圖3H)。因此，激活的HSC中的絕大多數基因在啟動子區域被H3K18la標記。為了鑒定活化HSC中H3K18la標記的基因，作者對培養6天的原代HSC進行了RNA-seq，結果顯示，在活化過程中，1677個基因顯著上調，1505個基因顯著下調(圖3I)。最后，作者鑒定出1126個基因在啟動子區域被H3K18la誘導而上調(圖3J)。GOBP term分析顯示，這些H3K18la標記的基因參與了細胞粘附、遷移和傷口愈合(圖3K)，提示H3K18la可能調控代表HSC主要特征的關鍵基因。

5、HK2基因缺失通過降低H3K18la來抑制HSC的激活，而H3K18la可以通過外源性乳酸而不是醋酸鹽的補充來恢復

       鑒于作者的研究結果，激活的HSC通過誘導糖酵解以及HK2表達和H3K18la進行代謝重編程，作者推測HK2消融通過抑制H3K18la來阻礙HSC的激活。為了驗證作者的假設，作者從HK2f/f小鼠的肝臟中分離出原代HSC，并通過暴露于表達Cre重組酶與eGFP融合的腺病毒(Ad-GFP-Cre)進行基因缺失，然后培養6天。HSC中HK2缺失使ECAR、乳酸生成和細胞乳酸水平降低約60%(圖4A-4C)。OCR也顯著降低，表明HK2的表達促進了HSC激活時糖酵解的主要部分，以提供丙酮酸，丙酮酸在細胞呼吸發生的線粒體中被還原為乳酸并氧化。此外，這種由HK2缺失引起的代謝擾動抑制了a-SMA的表達和增殖，但沒有引起細胞死亡(圖4D)。正如預期的那樣，腺病毒Cre轉導不影響WT原代HSC的激活(圖4D)。在確定了HK2消融對糖酵解活性和HSC激活的影響后，作者接下來檢測了H3K18la和H3K18ac的水平。有趣的是，HK2缺失細胞的H3K18la和H3K18ac水平低于活化的HSC，但外源性乳酸處理恢復了H3K18la，而H3K18ac進一步降低(圖4E)。與此一致的是，CUT&Tag結果的熱圖分析顯示，激活小鼠原代HSC中，H3K18la在基因的TSSs附近被顯著誘導，通過HK2缺失而減弱，在添加乳酸后恢復(圖4F)。相比之下，H3K18ac在活化的HSC中減少，并通過HK2缺失和乳酸處理進一步減少(圖4F)。為了進一步研究H3K18la標記的基因是否依賴于HK2的表達以及乳酸處理，作者比較了活化的WT型HSC和活化的HK2敲除(KO)型HSC中H3K18la標記的基因的表達。作者發現，在活化的HK2-KO細胞中，下調基因增加了大約3倍(圖4G)。乳酸處理逆轉了大多數依賴于HK2表達的基因的表達(圖4H)。GOBP term分析顯示，這些依賴于HK2/H3K18la和乳酸處理的真實基因與細胞粘附、遷移、細胞外基質組織和TGF-b受體信號通路有關，表明HK2/H3K18la在調節HSC激活誘導基因中起關鍵作用。事實上，在活化的HSC中，H3K18la峰在關鍵誘導基因的啟動子處高度富集，而在靜止和HK2-KO細胞中則沒有，但在HK2-KO細胞中，乳酸處理恢復了H3K18la峰(圖4I、4J)。與作者在tss附近的全基因組H3K18ac峰的發現一致，在活化的HK2-KO細胞和乳酸處理的HK2-KO細胞中，H3K18ac峰在基因的啟動子處逐漸被抑制。已知補充乙酸可以增強組蛋白乙酰化和染色質可及性。為了評估乳酸和醋酸鹽處理是否能恢復HK2-KO HSC中的基因表達，作者測量了HSC激活誘導基因的轉錄水平。令人驚訝的是，乳酸處理上調了被HK2缺失抑制的基因表達，而醋酸處理沒有(圖4K)。同樣，活化的HSC的侵襲能力因HK2缺乏而降低，但乳酸處理使其恢復，而醋酸處理未恢復表型(圖4L)。總的來說，作者的研究結果表明，HK2缺失抑制HSC激活，乳酸處理(可能通過H3K18la)可以挽救HSC激活，而醋酸處理則不能。

圖4、HK2基因缺失通過降低H3K18la來抑制HSC的激活，而外源性乳酸處理可以挽救H3K18la，而醋酸處理則不能

6、抑制外源性乳酸產生可以抑制HSC的激活

       為了繼續研究組蛋白乳酸化與HSC激活之間的關系，作者進一步評估了乳酸生成藥物抑制劑治療后基因表達的激活。草酸酯通過抑制乳酸脫氫酶(LDH)抑制丙酮酸產生乳酸，而DCA通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶(PDHK)增加丙酮酸轉化為乙酰輔酶a而不是乳酸來抑制乳酸的產生(圖5A)。正如之前報道的那樣，草酸酯和DCA處理顯著降低了乳酸生成和細胞乳酸水平(圖5B、5C)，這種干預抑制了小鼠原代HSC的細胞增殖，而不引起細胞死亡(圖5D)。草酸酯和DCA處理有效地降低了H3K18la和HSC激活誘導基因的表達，乳酸可以挽救HSC激活誘導基因，而乙酸補充不能(圖5E-5H)。為了進一步確定LDH與HK2誘導的組蛋白乳酸化和隨后的基因表達之間的直接關系，作者在小鼠原代HSC中轉染了靶向LDH的小干擾RNA (siRNA)。與LDH抑制劑處理一致，Ldha的siRNA敲低降低了細胞乳酸水平和H3K18la以及HSC激活誘導的基因表達，乳酸處理恢復了細胞乳酸水平，而醋酸處理沒有恢復。TGF-b1被認為是在HSC纖維化信號通路中起重要作用的關鍵細胞因子。最近，越來越多的證據表明TGF-b1也通過增強HSC和成纖維細胞的糖酵解通量參與代謝重編程。因此，作者研究了TGF-b1對Lx-2細胞活化的影響。正如預期的那樣，TGF-b1增加了乳酸的產生，這一作用被草酸鹽或DCA處理所減弱。將葡萄糖水平從25 mM降低到5 mM會降低H3K18la，但TGF-b1在兩種葡萄糖濃度下均會增加H3K18la，同時降低H3K18ac。正如預期的那樣，TGF-b1誘導a-SMA基因表達和COL1A1基因表達。作者隨后的時間過程研究發現，在TGF-b1處理后的較晚時間點(6-24 h)， H3K18la持續升高，這與HSC激活誘導基因的顯著上調相關。相比之下，H3K18ac水平在1 h時略有升高，但在TGF-b1處理后，這種升高隨后持續降低。為了確定TGF-b1對Lx-2細胞中a-SMA基因啟動子組蛋白修飾的影響，作者采用ChIPqPCR分析了啟動子區域組蛋白的乳酸化和乙酰化。與作者的免疫印跡結果一致，TGF-b1增加了a-SMA啟動子上的H3K18la，但降低了H3K18ac。接下來，作者發現草酸酯和DCA降低了H3K18la，抑制了TGF-b1升高的a-SMA表達。作者進一步證實這種抑制不是由于細胞死亡。在作者的拯救實驗中，乳酸可以恢復激活誘導基因的表達減少，而醋酸不能恢復。作者的研究結果表明，干擾乳酸的產生會降低H3K18la和HSC激活誘導基因的表達，乳酸可以恢復，而乙酸不能恢復。綜上所述，這些結果表明組蛋白乳酸化在HSC激活和隨后的基因表達誘導中起著關鍵作用。

圖5、通過抑制乳酸生成或I類HDAC抑制劑治療降低H3K18la，使造血干細胞失活

7、一類HDAC抑制劑可提高H3K18ac，抑制H3K18la，從而抑制HSC激活誘導基因的表達

       組蛋白去乙酰化酶(hdac)催化從組蛋白賴氨酸殘基中去除乙酰基，導致染色質凝聚，抑制基因轉錄。先前的研究表明，在體外和體內，抑制僅局限于細胞核的I類hdac可使HSC失活。考慮到作者的研究結果，H3K18la是一種新的組蛋白修飾，反映了HSC激活誘導基因的表達，作者假設I類HDAC抑制劑可能誘導H3K18ac, H3K18la與H3K18la在組蛋白H3上相同的賴氨酸18殘基上競爭。首先，作者用I類HDAC抑制劑apicidin和MS275 (entinostat)處理活化的小鼠原代HSC(圖5I)。抑制劑處理增加了H3K18ac，但降低了H3K18la，表明賴氨酸18的乙酰化和乳酸化之間存在競爭(圖5J)。其次，apicidin和MS275處理顯著降低了基因表達和增殖的激活，這些影響不是由于細胞死亡(圖5K)。為了進一步探索組蛋白乙酰化和乳酸化之間競爭的可能性，作者用乳酸和乙酸處理Lx-2細胞。單獨乳酸處理增加了a-SMA的表達，而單獨醋酸處理顯示相反的效果。有趣的是，當添加醋酸鹽時，乳酸誘導的a-SMA表達被消除。事實上，H3K18la在乳酸處理下被高度升高，但當添加醋酸鹽時，這種升高被抑制，因此H3K18ac水平恢復。因此，作者的研究結果表明，I類HDAC抑制劑可能通過上調H3K18ac而失活HSC, H3K18la與H3K18la競爭，導致H3K18la依賴性基因表達下調。

8、HSC特異性和系統性的HK2缺失在體內抑制肝纖維化

       為了進一步證實HK2/H3K18la在肝纖維化背景下在HSC中的作用，作者首先生成HK2f/f;LratCre小鼠，其中HK2可以在HSC中特異性刪除。小鼠注射CCl4 3周，誘導肝纖維化(圖6A)。Sirius red和Masson’s三色染色顯示，當HSC中缺失HK2時，肝臟中CCl4引起的膠原積累明顯減少(圖6B和6E)。在膠原沉積的同時，a-SMA在HSC特異性HK2-KO小鼠肝臟中的表達顯著降低(圖6B和6D)。為了驗證H3K18la水平是否反映了體內HSC的激活，作者在給藥CCl4后從HSC特異性HK2-KO小鼠的肝臟中分離小鼠原代HSC。作者證實，CCl4給藥后小鼠肝臟原代HSC中誘導的H3K18la水平因缺乏HK2而顯著降低(圖6C)。然而，H3K18ac水平沒有改變。接下來，ALT(丙氨酸轉氨酶)和AST(天冬氨酸轉氨酶)的測定顯示，HSC中HK2的缺失對肝毒性沒有顯著影響(圖6F)。考慮到外源性乳酸補充在體外挽救了HK2缺失的HSC的HSC激活表型，作者接下來通過注射2 g/kg乳酸(腹腔注射)來評估乳酸對HSC特異性HK2-KO小鼠的影響，連續注射CCl4 3周，每隔一天一次。有趣的是，作者的Sirius red和a-SMA免疫染色結果顯示，體內添加乳酸后，HSC特異性HK2-KO小鼠肝臟中膠原沉積減少和a-SMA表達恢復。總之，作者的研究結果表明，HSC特異性缺失HK2可減輕HSC中的H3K18la并抑制肝纖維化，而體內慢性和全身乳酸治療可恢復膠原沉積和a-SMA表達。作者之前的研究表明，成年小鼠的全身HK2缺失對乳腺癌和肺癌具有良好的耐受性和治療性，沒有不良的生理后果。接下來，作者用CCl4治療系統性HK2缺失小鼠3周(圖7A)。值得注意的是，作者的Sirius red和Masson’s三色染色結果顯示，在系統性缺失HK2后，肝臟中的膠原積累明顯受到抑制(圖7B和7D)。此外，證實a- SMA表達顯著減少(圖7B和7C)。為了進一步分析系統性HK2缺失的抗纖維化作用，作者接下來在注射他莫昔芬后建立了bdl誘導的HK2f/f;UBCCreERT2小鼠纖維化模型(圖7F)。與作者之前的體內實驗結果一致，系統性缺失HK2有效抑制了bdl小鼠肝臟中膠原的積累和a-SMA的表達(圖7G-7I)。在ccl4誘導和bdl誘導的纖維化模型中，血清ALT和AST活性在HK2熟練組和HK2缺乏組之間相似，這表明體內系統性的HK2缺失不會引起顯著的細胞毒性(圖7E和7J)。接下來，為了進一步了解系統性HK2缺失對治療潛力的影響，作者首先用CCl4治療3周誘導肝纖維化，然后嘗試系統性地刪除HK2(圖7K)。在系統性缺失HK2的小鼠肝臟中，Sirius紅和Masson三色染色顯示膠原沉積明顯減少(圖7L和7M)。作者觀察到，在肝纖維化建立后，當全身缺失HK2時，a-SMA的表達也減少(圖7N)。 此外，在誘導肝纖維化后，刪除HK2對血清ALT和AST活性沒有明顯影響(圖7O)。綜上所述，作者的研究結果表明，靶向HK2可以系統性地抑制HSC的激活;因此，HK2可能是肝纖維化的治療靶點。

圖6、造血干細胞中特異性缺失HK2可改善ccl4誘導的肝纖維化

圖7、體內系統缺失HK2對ccl4和bdl誘導的肝纖維化的抑制作用

結論

       總之，作者發現HK2介導的乳酸生成通過組蛋白乳酸化影響基因表達。作者發現在活化的HSC中誘導HK2的表達對于HSC的激活至關重要，并且由HK2表達引起的組蛋白乳酸化決定了HSC激活后的基因表達。此外，作者的研究結果表明，干預HK2/H3K18la軸是肝纖維化的一種潛在治療策略。

實驗方法

WB, qPCR，IHC，IF，RNA-seq，CUT&Tag，CHIP-qPCR，CHIP-seq，ECAR，OCR，代謝組學 

參考文獻

Rho H, Terry AR, Chronis C, Hay N. Hexokinase 2-mediated gene expression via histone lactylation is required for hepatic stellate cell activation and liver fibrosis. Cell Metab. 2023 Aug 8;35(8):1406-1423.e8. doi: 10.1016/j.cmet.2023.06.013. Epub 2023 Jul 17. PMID: 37463576.