肺癌是一種致命的惡性腫瘤，每天死亡人數超過350人。臨床研究表明約77%的肺癌患者接受放療（Radiotherapy，RT）。盡管放療的療效顯著改善，但癌細胞在連續暴露于電離輻射（Ionizing Radiation，IR）時產生抗性導致疾病復發。IR主要通過引起DNA損傷，特別是雙鏈斷裂（DSBs）來殺死癌細胞。輻射抗性癌細胞已經發展出強大的DNA損傷修復能力來生存IR。核因子?紅細胞2相關因子2（Nuclear Factor Erythroid 2-related Factor 2，NRF2）與輻射抗性相關。在本研究中，作者采用TCGA數據庫和組織芯片分析NRF2與肺癌患者預后的相關性，構建耐輻射肺癌細胞，通過體內和體外實驗探討NRF2在抗輻射中的作用，并采用免疫沉淀、免疫熒光和染色質級分提取等方法探討其潛在機制。本研究證明NRF2通過與RPA32和TOPBP1合作激活ATR-CHK1信號通路增強輻射抗性，還驗證了NRF2可作為放療的潛在靶點。

該研究于2024年1月1日發表在《Theranostics》，IF：12.4

技術路線

主要研究結果

1.NRF2/KEAP1基因改變引起NRF2激活與肺癌患者預后不良相關

作者通過c-BioPortal網站分析了肺癌患者NRF2/KEAP1基因的變異類型。在分析了來自29項研究的12,478個樣本/ 9,930名肺癌患者后，發現NRF2和KEAP1基因的總變異分別為4%和13%（圖1A）。遺傳突變是NRF2和KEAP1基因變異的主要形式。在拷貝數變異類型中，擴增是NRF2的主要改變類型，而KEAP1的主要改變類型是缺失（圖1A）。肺癌的不同亞型，如肺腺癌（LUAD）和肺鱗狀細胞癌（LUSC），具有不同的細胞變異類型，導致不同的生長特征。此外，作者發現NRF2的擴增和突變主要發生在LUSC（圖1B），KEAP1基因變異在LUAD中發生更頻繁（圖1C）。接下來通過RNA-seq分析表明，LUAD和LUSC中NRF2的主要CNV類型是擴增和增益，這導致NRF2 mRNA表達增加（圖1D-E）。KEAP1的主要變異類型是淺缺失，伴隨著較低的KEAP1 mRNA表達（圖1F-G）。此外還調查了NRF2/KEAP1基因改變組和NRF2/KEAP1基因未改變組患者之間的臨床結果。結果表明，NRF2/KEAP1基因的基因改變與較短的總生存期相關（圖1H-I）。NRF2/KEAP1基因改變患者的總生存期中位數分別為38.24和38.14個月，而無基因改變組分別為56.35和54.34個月。因此，上述結果表明，NRF2/KEAP1基因變異導致NRF2表達水平升高，并與肺癌患者預后不良有關。

圖1：NRF2/KEAP1變異導致的NRF2過表達與肺癌患者預后不良相關

IHC檢測由LUAD患者和鄰近非癌組織作為對照的肺癌組織樣本組成的腫瘤微陣列（TMA）中NRF2蛋白的表達。用NRF2抗體染色TMA，并根據染色強度評估評分。根據細胞質中NRF2染色強度將LUAD樣本分為高/中/低NRF2表達水平的三組（圖2A）。在LUAD組中，44%的患者屬于NRF2高表達組（圖2B），該組患者的中位壽命為31.23個月（圖2C）。接下來作者根據NRF2蛋白在細胞核中的定位將患者分為陽性和陰性組，結果顯示核NRF2檢測陽性的患者的壽命明顯短于檢測陰性的患者（圖2D-E）。

總體而言，TMA結果與TCGA數據庫分析結果一致，表明肺癌患者NRF2蛋白高表達與預后不良相關。

圖2：組織芯片染色NRF2與LUAD患者預后的相關性分析。

2.放療抵抗細胞中NRF2高表達

作者建立了人類肺癌抗輻射細胞并通過集落形成實驗進行驗證。對肺癌細胞和肺癌放療抵抗細胞使用質譜進行蛋白質組學分析，發現氧化應激信號通路發生變化。檢測了輻射抵抗細胞中NRF2的蛋白水平，發現與A549細胞相比，A549R細胞中具有抗氧化應激功能的NRF2蛋白及其下游血紅素氧合酶-1（HO-1）顯著上調（圖3A）。NRF2向細胞核轉移是激活下游基因的先決條件，這些基因編碼一系列II期解毒或抗氧化酶。核質分離結果顯示，與H460和H1299細胞相比，H460R和H1299R細胞核中NRF2蛋白水平顯著升高（圖3B-C）。此外，免疫熒光實驗顯示，在H1299R細胞中NRF2熒光信號更強烈（圖3E）。這些結果表明NRF2在輻射抗性細胞中上調，并優先積累在細胞核中。

有研究報道過NRF2可通過激活ATR/CHK1通路導致DSBs和G2/M細胞周期停滯。因此作者接下來監測了放射抗性細胞中ATR信號級聯的變化。WB結果顯示，IR誘導H460和H1299細胞中ATR和CHK1的磷酸化，H460R和H1299R細胞中ATR和CHK1的磷酸化水平明顯更高（圖3F-G）。采用免疫熒光監測γ-H2AX以評估DNA損傷。紅外線照射后，A549R細胞γ-H2AX病灶的數量顯著低于A549細胞，表明輻射抵抗細胞的DNA修復能力優于對照細胞（圖3H）。H460和H1299細胞也觀察到類似的趨勢（圖3I-J）。上述結果表明，輻射抵抗細胞中高水平的NRF2蛋白增強了DNA損傷修復能力，這可能是肺癌細胞可以發生輻射抵抗的原因之一。.

圖3：NRF2在抗輻射細胞中表達顯著

3. 體內NRF2過表達的抗輻射細胞對放療的抗性更強

將穩定表達GFP的A549和A549R細胞注射到裸鼠尾靜脈，6周后成功構建肺腫瘤轉移模型，將小鼠分為對照組（A549）、抗輻射細胞組（A549R）、對照照射組（A549-IR）、抗輻射細胞照射組（A549R-IR）四組。每周用2或4 Gy分次劑量的γ射線局部照射肺部，治療持續3周（圖4A）。熒光信號檢測到肺部腫瘤轉移（圖4B）。與A549組相比，A549-IR組放療后肺腫瘤轉移數量明顯減少。相比之下，在注射A549R細胞的小鼠中，接受或不接受放療的肺轉移數量沒有觀察到統計學上的顯著差異，提示A549R腫瘤對IR更具抗性（圖4C-D）。結果顯示A549R細胞在體內也具有抗輻射性。肺組織切片IHC分析顯示，A549細胞源性腫瘤中的Ki67陽性染色在照射后顯著下降，但A549R-IR組與A549R-未照射組的Ki67豐度差異較小，提示IR可能不能有效抑制A549R細胞的增殖（圖4E）。此外，用IHC檢測NRF2的染色強度。A549組的NRF2染色在照射后顯著下降，而A549R組的變化不顯著（圖4F）。總的來說，這些研究結果表明NRF2蛋白與體內肺癌細胞的輻射抵抗之間存在關聯。

接下來，作者通過Nrf2+/ -C57BL/6小鼠雜交得到Nrf2+/+和Nrf2-/-幼鼠，以進一步探索NRF2在體內響應IR中的作用（圖4G）。將Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠暴露于兩種劑量的IR（7.2和6.5 Gy）（圖4H），發現Nrf2-/-小鼠表現出更高更快的死亡率（圖4I和4K）。Nrf2-/-小鼠的平均體重在全身照射（TBI）后繼續下降；而，Nrf2+/+小鼠的平均體重在TBI后大約20天趨于穩定（圖4J和4L）。這些結果表明，缺失NRF2基因導致輻射暴露后小鼠死亡率較高，這意味著NRF2可能在體內對輻射反應中發揮保護作用。

圖4：NRF2過表達的放射抗性細胞在體內對放療的抗性更強

4. NRF2激活ATR/CHK1通路獨立于其轉錄功能

接下來，作者試圖闡明NRF2導致放射抗藥性的機制。在A549和H1299細胞中，照射以劑量依賴性的方式增加NRF2蛋白水平（圖5A-B）；8 Gy照射以時間依賴性的方式增加NRF2蛋白水平（圖5C-D）。之前的實驗結果表明NRF2蛋白在肺癌組織細胞核中的積累與肺癌預后較差有關（圖2D-E），抗輻射細胞細胞核中的NRF2蛋白水平也較高（圖3B-C）。因此，從細胞中分離出染色質，并檢查照射后NRF2與染色質的結合。結果表明，照射后NRF2蛋白與染色質的結合顯著增加（圖5E），這表明NRF2在紅外下轉移到細胞核并與染色質結合。此外，通過免疫熒光研究NRF2的亞細胞定位。結果表明，NRF2被招募到激光微照射引起的DNA損傷位點，并在H1703和A549細胞中與γ-H2AX共定位（圖5F）。

NRF2作為一種轉錄因子在應激條件下調節BRCA1和53BP1的表達。BRCA1和53BP1都是DNA損傷反應過程中的關鍵蛋白。在A549細胞中敲低NRF2后53BP1和BRCA1蛋白的水平顯著下降；而53BP1和BRCA1的敲低并不影響CPT處理后ATR和CHK1的激活（圖5G）。這些結果表明53BP1和BRCA1可能不是NRF2/ATR/CHK1信號通路激活的介導者。為了確認NRF2促進ATR-CHK1信號通路的激活不依賴于其轉錄調節功能，作者構建了刪除Neh1結構域的NRF2突變質粒（Δ434-561-NRF2）（圖5H），并在A549-NRF2 KO細胞中分別表達HA-NRF2和Δ434-561-NRF2。當細胞用8 Gy IR處理時，HA-NRF2和Δ434-561-NRF2的表達都顯著促進ATR和CHK1磷酸化（圖5I）。這些結果表明NRF2可以保持獨立于轉錄功能的基因組穩定性。

圖5：NRF2激活ATR/CHK1通路獨立于其轉錄功能

5. NRF2促進RPA32磷酸化和RPA在ssDNA的積累

NRF2可以直接結合并激活ATR，而RPA調節ATR激活。因此，作者探討了NRF2是否可以影響RPA在DNA損傷過程中的作用。RPA70和RPA32是RPA復合物的兩個主要亞基。在照射后6、12和24小時檢查了用siNRF2處理或未處理的A549細胞中RPA32和RPA70病灶的數量。免疫熒光結果顯示，敲低NRF2后A549細胞中RPA70病灶陽性細胞的比例明顯高于A549細胞暴露于IR后（圖6A）。同樣，敲低NRF2降低了細胞暴露于IR后RPA32病灶陽性細胞的比例（圖6B-C）。DNA結合的RPA與許多蛋白質相互作用以調節DNA代謝，RPA封裝的ssDNA也是復制應激誘導的DNA損傷反應過程的平臺。接下來，提取染色質結合蛋白以確定NRF2是否影響RPA32蛋白與DNA的結合，發現NRF2的敲除在照射后顯著抑制RPA32蛋白與染色質的結合，但不影響RPA32的可溶性形式（圖6D）。結果暗示NRF2可能有助于RPA32與染色質的結合在DNA損傷條件下形成病灶。

進一步研究了NRF2是否會影響RPA32的磷酸化。在A549細胞中，NRF2的敲低降低了CPT處理后RPA在Ser33和Thr21的磷酸化（圖6E）。此外還觀察到RPA32（Ser33、Thr21和S4/S8）的磷酸化水平在照射后10小時內持續增加，且A549R細胞中RPA32的磷酸化增加更加明顯（圖6F）。NRF2敲除細胞中RPA32的磷酸化明顯低于野生型細胞，并且通過在CPT（圖6G）處理后將Flag-NRF2重新引入A549-NRF2KO細胞來挽救這一缺陷。因此，研究結果表明NRF2通過促進DNA損傷過程中RPA32的磷酸化來影響DNA上RPA的招募。

圖6：NRF2促進RPA32的磷酸化和RPA在ssDNA的積累。

6. NRF2協同TOPBP1激活ATR/CHK1信號通路

RPA32和CHK1都是ATR的磷酸化底物。有研究表明，TOPBP1和ETAA1的激活對應于不同的ATR功能。ETAA1在正常和應激復制過程中負責ATR介導的RPA磷酸化，而TOPBP1激活ATR/CHK1信號通路以響應復制應激。NRF2、TOPBP1和ETAA1在A549細胞中分別敲除，以比較NRF2、TOPBP1和ETAA1之間的差異。結果表明，轉染siNRF2的A549細胞在8Gy照射后ATR和CHK1的磷酸化水平比轉染siTOPBP1和siETAA1的細胞更顯著降低，表明NRF2在ATR的磷酸化中發揮了重要作用（圖7A）。而與單獨敲除NRF2相比，同時敲除TOPBP1和NRF2并沒有進一步降低ATR磷酸化水平（圖7A）。這些觀察結果表明NRF2可能與TOPBP1在同一途徑中發揮作用。因此，構建的Flag-TOPBP1和HA-NRF2融合蛋白進行驗證，用60 nM CPT處理細胞后，siTOPBP1在H1299R細胞中ATR/CHK1沒有磷酸化（圖7B）。表達HA-NRF2沒有挽救這一缺陷，這表明TOPBP1在NRF2/ATR/CHK1途徑中的關鍵作用（圖7B）。同時，Flag-TOPBP1的表達也未能磷酸化ATR和CHK1。

TOPBP1通過與RAD9-HUS1-RAD1（9-1-1）的復合物被招募到DNA損傷位點，并通過其AAD樣區域結合介導ATR的磷酸化。在染色質結合蛋白檢測實驗中，WB顯示NRF2的下調顯著抑制了TOPBP1蛋白與輻照A549細胞染色質的結合（圖7D）。使用靶向HPRT基因的Cas9/sgRNA實現了位置特異性DNA雙鏈斷裂，以進一步證實NRF2在TOPBP1招募到DNA損傷位點中的作用。熒光顯微鏡顯示TOPBP1與A549細胞中的γH2AX共定位。NRF2缺乏顯著減弱了A549-NRF2KO細胞中TOPBP1病灶的強度（圖7E-F）。圖7G結果清楚地表明，A549細胞中激光微輻射后TOPBP1被招募到DNA損傷位點，但在A549-NRF2KO細胞中沒有。這些結果表明，NRF2可以影響DNA損傷期間TOPBP1招募。接下來使用Co-IP驗證DNA損傷中TOPBP1和NRF2之間的相互作用。從A549細胞的染色質和可溶性提取物中免疫沉淀NRF2后可檢測到TOPBP1。此外，在IR后細胞的染色體提取物中TOPBP1和NRF2之間的相互作用增強（圖7H）。這些結果表明NRF2與TOPBP1合作促進ATR/CHK1信號通路的激活，并對照射后TOPBP1向DNA損傷位點的募集有促進作用。

圖7：NRF2協同TOPBP1激活ATR/CHK1信號通路

結論

作者證明NRF2的高核表達與肺癌患者的不良預后相關，并有助于輻射抗性的發展。響應IR或CPT，NRF2被轉移到DNA損傷位點，促進RPA32的磷酸化，并通過招募TOPBP1到DNA損傷位點激活ATR/CHK1通路（圖8）。這項研究表明NRF2可能是改善肺癌放療的一個有希望的靶點。

圖8

實驗方法

細胞培養和藥物治療，組織微陣列，輻射抗性細胞系構建，全細胞裂解物收集和蛋白質印跡法，免疫熒光分析，Co-IP實驗，活性氧水平的測定，集落形成試驗，腫瘤球形成實驗，核和細胞質蛋白質提取，提取染色質部分，慢病毒轉染實驗，siRNA轉染實驗，質粒轉染實驗，小鼠實驗，免疫組織化學染色，TUNEL實驗

參考文獻

Sun Xiaohui, Dong Mingxin, Li Jiale, et al. NRF2 promotes radiation resistance by cooperating with TOPBP1 to activate the ATR-CHK1 signaling pathway. [J]. Theranostics, 2024, 14: 681-698.