在三陰性乳腺癌(TNBC)患者中，遠處轉移是導致死亡的主要原因。我們之前的研究表明，circKIF4A極大地促進了TNBC的進展，但其在TNBC腦轉移中的作用和分子機制仍然不確定。在這項研究中，我們發現circKIF4A在TNBC細胞系和腦轉移中顯著上調。抑制circKIF4A會損害TNBC的增殖、遷移和引起腦轉移的能力。熒光素酶報告基因檢測證實circKIF4A與STAT3 3’UTR競爭miR-637的結合。Western blot分析顯示，抑制circKIF4A可降低STAT3和p62的表達，同時增加LC3B-II/ LC3B-I比值和Beclin的表達，表明circKIF4A下調通過與STAT3競爭miR- 637結合而誘導自噬。通過采用競爭性內源性RNA (ceRNA)機制，circKIF4A-miR-637-STAT3軸協調TNBC中的腦轉移。因此，circKIF4A可以作為TNBC腦轉移的預后生物標志物和治療靶點。本文于2023年11月發表于“Cancer Letter”（IF=9.7）上。

技術路線：

結果：

1）抑制circKIF4A可損害TNBC的增殖、遷移和侵襲

         為了探索KIF4A衍生的環狀RNA hsa_circ_0007255 (circKIF4A)在TNBC腦轉移中的功能，我們采用qRT-PCR驗證了circKIF4A在腦轉移和原發性乳腺癌組織中的表達。22例腦轉移患者顯示circKIF4A水平升高，且在腦轉移組織中明顯升高(圖1A)。然后我們在TNBC細胞系和MCF10A中進行RT-qPCR檢測，發現circKIF4A在TNBC細胞系中上調(圖1B)。用RNase R(核糖核酸酶R)處理HCC1806和SUM159PT細胞株RNA樣品后，我們使用qRT-PCR檢測了兩株細胞株中circKIF4A及其親本基因編碼KIF4A mRNA和GAPDH的表達水平。結果表明，與線性KIF4A mRNA和GAPDH相比，circKIF4A對RNase R處理具有更強的耐受性，這與環狀RNA的特征一致(圖1C)。我們設計了兩個siRNA來探索circKIF4A的功能，并通過RT-qPCR在TNBC細胞中驗證了其敲低作用(圖1D)。采用CCK-8和集落形成法檢測TNBC細胞的活力，結果表明，抑制circKIF4A可顯著損害TNBC細胞的增殖能力(圖1E, F, I)。此外，在傷口愈合和transwell試驗中，敲低circKIF4A可抑制TNBC細胞的遷移和侵襲能力(圖1G-I)。這些結果表明，抑制circKIF4A會損害TNBC細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

2）下調circKIF4A抑制TNBC細胞的增殖和腦轉移

         在通過體外細胞實驗證實了circKIF4A在TNBC細胞中的促瘤作用后，我們利用穩定敲除circKIFA的HCC-1806細胞和對照細胞構建TNBC異種移植模型，研究circKIF4A在體內是否具有相同的作用。注射腫瘤細胞后，每周一次測量小鼠移植腫瘤的大小，繪制生長曲線。4周后，對小鼠進行體外熒光成像，安樂死后切除腫瘤。結果顯示，與對照組相比，穩定敲低circKIF4A組移植腫瘤的大小明顯減小(圖2A-C)。sh-circKIF4A組腫瘤重量明顯降低(圖2D)。此外，對裸鼠腫瘤進行免疫組化，結果顯示sh-NC組細胞增殖標志物Ki-67顯著升高(圖2E)。為了進一步研究circKIF4A在TNBC腦轉移中的作用，我們通過左心室注射穩定敲除circKIF4A并表達熒光素酶的HCC1806細胞以及對照細胞，構建了腦轉移模型(圖2F)。培養50天后，再次對小鼠進行體外熒光成像，結果顯示，敲低circKIF4A可顯著抑制HCC1806細胞體內腦轉移能力(圖2G)。穩定敲低circKIF4A組腦轉移灶的大小和數量明顯低于對照組。circKIF4A敲低組腦轉移結節數為2±1個，對照組為9±3個(圖2H和圖2I)。這些結果證實敲低circKIF4A可以抑制三陰性乳腺癌細胞的腦轉移能力。

3）circKIF4A作為海綿與miR-637結合

         利用核細胞分離試劑盒和FISH檢測circKIF4A在細胞內的分布和定位。circKIF4A主要分布在細胞質中(圖3A和B)。根據Targetscan預測，circKIF4A具有miR-637結合位點(圖3C)。同時，對22對三陰性乳腺癌腦轉移灶和原發灶的qRT-PCR檢測顯示，miR-637在腦轉移組織中的表達(1.84±1.16)明顯低于原發灶的腫瘤組織(5.14±1.54)(圖3D)。RT-qPCR檢測了miR-637在TNBC細胞系中的分布，結果顯示，與MCF 10A相比，miR-637在TNBC細胞系中的含量明顯較低(圖3D)。為了進一步驗證circKIF4A與miR-637在三陰性乳腺癌細胞中的結合，我們基于circKIF4A與miR-637的潛在結合序列構建了野生型雙熒光素酶報告載體和結合序列突變載體(圖3F)。通過雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實了TNBC細胞中circKIF4A和miR-637之間的相互作用。與轉染circKIF4A-wt和miR-CTR的細胞相比，轉染circKIF4A-wt和miR-637模擬物的細胞熒光素酶活性顯著降低。相比之下，在轉染circKIF4A-mut的細胞中，分別轉染miR-CTR和miR-637模擬物后，熒光素酶活性沒有差異(圖3G)。這些結果表明circKIF4A在TNBC中作為海綿與miR-637結合。

4）circKIFA通過miR-637調控STAT3的表達

         通過TargetScanHuman，我們發現STAT3是miR-637的候選下游蛋白，在多種腫瘤中發揮促癌作用(圖4A)。在TNBC細胞中轉染miR-637模擬物后，與對照組(miR-CTR)相比，miR-637模擬物在HCC1806和SUM159PT細胞系中分別下調了54.67%±6.46和49.60%±8.50的STAT3 mRNA表達(P < 0.05)(圖4B)。為了進一步驗證三陰性乳腺癌細胞中miR-637是否通過結合STAT3’UTR調控STAT3的翻譯，我們基于miR-637與STAT 3’UTR的潛在結合序列構建了野生型雙熒光素酶報告載體和結合序列突變載體(圖4C)。與轉染STAT3-wt和miR-CTR的細胞相比，轉染STAT3-wt和miR-637模擬物的細胞熒光素酶活性顯著降低。相比之下，在轉染STAT3-mut的細胞中，分別轉染miR-CTR和miR-637模擬物后，熒光素酶活性沒有差異(圖4D)。這些結果表明miR-637通過結合STAT3 3’ UTR發揮其功能。為了驗證circKIF4A是否通過circKIF4A/miR-637軸調控STAT3的表達，我們通過穩定敲低HCC1806細胞中的circKIF4A并轉染相應的抑制劑，建立了敲低對照組(sh-circKIF4A + inhibitor NC)和拯救組(sh-circKIF4A + miR-637 inhibitor)。將未處理的細胞作為空白對照組(sh-NC +抑制劑NC)。采用qRT-PCR和Western blot檢測上述各組中STAT3的表達變化。與空白對照組相比，敲低對照組STAT3 mRNA和蛋白的表達水平均下調；而與敲低對照組相比，拯救組STAT3 mRNA和蛋白的表達水平均有所升高(圖4E和4F)。這些結果表明，circKIF4A通過結合miR-637來緩解miR-637對STAT3 mRNA的抑制作用，促進STAT3蛋白的上調，建立了circKIF4A/miR-637/STAT3調控軸。

5）STAT3過表達通過自噬恢復TNBC中circKIF4A敲低誘導的抑制作用

         鑒于上述結果，我們開展拯救實驗，探討circKIF4A/miR-637/STAT3軸對三陰性乳腺癌細胞生物學特性的影響。我們構建了STAT3過表達載體，并利用qRT-PCR檢測了STAT3在circKIF4A穩定敲低HCC1806和SUM159PT細胞系中的過表達效率。結果顯示，用過表達載體轉染后，STAT3的表達水平顯著增加(圖5A)。CCK-8和集落形成拯救實驗結果表明，STAT3過表達可顯著恢復TNBC的增殖能力(圖5B, E, F)。Transwell和傷口愈合實驗表明，STAT3過表達可以恢復TNBC細胞中被circKIF4A敲低抑制的侵襲能力(圖5C, D, F)。Western blot檢測證實STAT3和p62下調；但Beclin表達和LC3B-II/ LC3B-I通過敲低circKIF4A而上調，而與STAT3過表達載體共轉染顯著逆轉了這一變化(圖5D)，表明抑制circKIF4A通過與STAT3競爭結合miR-637來促進自噬。這些結果可能解釋了circKIF4A通過circKIF4A /miR-637/STAT3軸調控自噬進而促進TNBC腦轉移的機制。

結論：

          circKIF4A-miR-637-STAT3軸通過競爭性ceRNA機制調節TNBC腦轉移。因此，circKIF4A是診斷和治療TNBC腦轉移的一個有前景的生物標志物。

實驗方法：

         qRT-PCR，CCK-8，Transwell，傷口愈合試驗，集落形成試驗，熒光素酶報告試驗，Western blot，IHC，動物實驗。

參考文獻：

         Wu S, Lu J, Zhu H, Wu F, Mo Y, Xie L, Song C, Liu L, Xie X, Li Y, Lin H, Tang H. A novel axis of circKIF4A-miR-637-STAT3 promotes brain metastasis in triple-negative breast cancer. Cancer Lett. 2024 Jan 28;581:216508. doi: 10.1016/j.canlet.2023.216508.