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在惡性橫紋肌樣腫瘤中, SMARCB1缺失激活了患者特異性遠端致癌增強子

欄目:最新研究動態 發布時間:2024-08-15
SMARCB1 的缺失會激活 MRT 腫瘤發生背后的患者特異性表觀遺傳重編程......

 

       惡性橫紋肌樣瘤(MRT)是一種高度惡性且通常致命的兒童癌癥。 MRT 在基因上由 SMARCB1 的雙等位基因失活突變定義,SMARCB1 BRG1/BRM 相關因子 (BAF) 染色質重塑復合體的成員。 BAF 復合體成員的突變在人類癌癥中很常見,但在許多情況下,人們對它們對腫瘤發生的貢獻仍知之甚少。在這里,我們研究了 MRT 背景下 SMARCB1 丟失導致的監管環境脫軌。我們對源自患者的 MRT 類器官的多組學方法揭示了 SMARCB1 重組后監管格局的巨大重塑。染色體構象捕獲實驗隨后揭示了遠端增強子區域與 MYC 癌基因啟動子的患者特異性環。聯合單細胞 RNA-seq ATAC-seq 顯示,這種 MYC 增強子利用的腫瘤間異質性也存在于患者 MRT 組織中。我們發現 SMARCB1 的缺失會激活 MRT 腫瘤發生背后的患者特異性表觀遺傳重編程。

       該研究于202312月發表在《Nature communications》,IF16.6

結果:

1MRT PDOs 中的染色質動力學分析揭示了 SMARCB1 依賴性增強子調節

       我們先前證明了SMARCB1的喪失是惡性轉化所必需但不足夠的。因此,我們假設腫瘤形成需要額外的表觀遺傳學驅動因子。將MRT的主要遺傳驅動事件SMARCB1喪失重新引入,將MRT細胞恢復到正常狀態,表明促使惡性的表觀遺傳變化是可以克服的(圖1A)。為了找到這些促使腫瘤發展的調控性變化,我們對一種MRT PDO模型(命名為P103)進行了慢病毒轉導,分別使用熒光素酶表達(對照)或SMARCB1表達(SMARCB1+)質粒,通過轉座酶可及染色質測序(ATAC-seq)以及染色質免疫共沉淀測序(ChIP-seq)或使用核酸酶測序進行靶點切割和釋放測序(CUT&RUN)來測量染色質可及性(圖1AB)。在SMARCB1重建后,我們發現了7,941個新形成的開放染色質區域(OCRs),這些區域富集了來自不同家族的轉錄因子結合位點,如SMARCC1/2AP-1(圖1C)。SMARCB1 ChIP-seq顯示這些OCRSMARCB1cBAFPBAF)和SS18ncBAFcBAF)結合,表明在重建后這些區域存在cBAF的結合。當我們使用GREAT對這些OCR進行功能注釋時,發現多個類別富集,主要與分化和發育過程相關。在失去的1,211OCR中,觀察到了ncBAF復合物成員BRD9SS18的結合明顯減少。我們發現這些區域中唯一富集的基序是隔離蛋白CTCF的基序,與之前在人類胚胎干細胞和小鼠胚胎成纖維細胞中的報告一致

       CTCFChIP-seq結果顯示,在SMARCB1重建后,CTCFSMARCB1+細胞中失去的OCR上的結合減少(圖1C)。在基因組中,CTCF的結合經常與環形粘連復合物的結合重疊。粘連復合物亞單位RAD21ChIP-seq證實,除了CTCF結合減少外,SMARCB1+細胞中失去的OCR顯示了粘連復合物的結合減少(圖1C)。另一方面,在SMARCB1+ PDO中增益的OCR顯示了RAD21的占有(圖1C),但沒有CTCF的結合。為了確定SMARCB1重建后增強子景觀的變化,我們進行了H3K27ac活性增強子標記的ChIP-seq。如預期,失去的OCR顯示H3K27ac水平下降,而增加的可及性位點則顯示H3K27ac水平顯著增加(圖1C)。活性增強子標記的增加與粘連復合物的結合增加相一致(圖1C),這與一部分粘連復合物分子結合到(超級)增強子區域以及CTCF結合位點一致。這些結果表明,經典BAF復合物在抑制CTCF結合到染色質方面起著重要作用,并且SMARCB1的喪失導致CTCF結合到染色質的可及性增加,以及ncBAF復合物結合到腫瘤特異OCR

 

1| SMARCB1 重建重塑了 MRT PDO 模型中開放的染色質景觀。

 

2SMARCB1 重建重組了 MYC 癌基因周圍的染色質景觀

       觀察到在SMARCB1重建后CTCFRAD21結合景觀的變化使我們假設,這些細胞中可能影響了長距離基因調控。為了確定基因組的組織(3D基因組)是否發生了任何依賴于SMARCB1的變化,我們在對照和SMARCB1+ P103 MRT PDOs中進行了高分辨率原位HiC實驗。盡管CTCF對染色質的結合存在差異,但我們發現染色質結構基本上沒有受到影響。3D基因組特征,如拓撲相關域(TADs)和A/B區,SMARCB1重建后顯示出有限的變化。然而,我們分別鑒定了控制和SMARCB1+ PDO131個和1,164個特異loop,其最小接觸頻率變化為1.5倍(圖2C)。在SMARCB1重建后,對最顯著失去的基因座進行排名,我們發現MYC癌基因的啟動子與一個大約1.1 Mb的遠程區域之間存在相互作用(圖2AC)。這個loopSMARCB1重建后第六個最減少的相互作用,也是涉及原癌基因的排名最高的相互作用。這個MYC啟動子的遠程區域具有高H3K27ac水平,表明這是一個超級增強子(圖2AB)。

       在MRT的背景下,MYC癌基因尤為引人關注,因為我們和其他研究先前證明,MRT是通過SMARCB1依賴的MYC基因表達特征來定義的。類似地,我們觀察到在SMARCB1重建后MYC mRNA和蛋白水平明顯減少,以及細胞周期相關基因的失調,表明存在細胞周期停滯(圖2D)。此外,通過shRNA誘導的MYC敲除在MRT PDOs中導致細胞增殖顯著減少(圖2E),表明MYCMRT的生長是必需的。除了MYC表達的減少外,我們觀察到在SMARCB1重建后,超級增強子以及MYC啟動子的染色質可及性顯著減弱(圖2AB)。為了探討SMARCB1重建是否影響ncBAF復合物的結合,我們對BRD9ncBAF)和SS18cBAFncBAF)進行了CUT&RUN。我們發現在SMARCB1重建后,BRD9SS18MYC啟動子以及1.1 Mb遠程區域的結合顯著減少(圖2B)。這些結果表明,MYC表達至少在很大程度上取決于ncBAF復合物的結合。SMARCB1的重建減少了ncBAF復合物在MYC位點的結合,從而可能減少了MYC啟動子與遠程超級增強子的相互作用。

 

2| SMARCB1 重建影響 MRT PDO MYC 癌基因的遠端增強子

 

3、患者特異性超級增強子與 MRT 中的 MYC 相互作用

       我們隨后假設MYC遠程增強子環路可能是推動MRT致癌的一種普遍機制。為此,我們在另外兩個MRT PDOsP78P60)中進行了SMARCB1的重建。RNA-seq分析顯示這兩個MRT模型中MYC表達減少,以及細胞周期基因的失調,證實了細胞增殖停滯的誘導(圖2DE)。接下來,我們使用MYC啟動子作為視點,對這兩個額外的PDO進行了4C-seq,這是一種定向到特定基因組位點的染色體構象捕獲方法。與P103類似,P78SMARCB1重建后顯示了MYC啟動子與相同的約1.1 Mb遠程基因組區域的減少接觸頻率(圖3A)。值得注意的是,第三個PDO模型(P60)的4C-seq分析顯示MYC啟動子與我們先前確定的基因組區域沒有相互作用。相反,在SMARCB1重建后,4C-seq揭示了另外兩個染色質環路的減弱(圖3A)。

       為了繪制PDO模型在存在和不存在SMARCB1時的調控景觀,我們在P78P60上進行了ATAC-seq。當我們將ATAC-seq數據與4C-seq數據疊加時,發現與MYC啟動子相互作用的區域是高度可訪問的。這種可訪問性與患者特異的MYC啟動子相互作用景觀相關(圖3B)。在SMARCB1重建后,相互作用的喪失與這些位點的可訪問性喪失相一致(圖3B)。在P78中的可訪問染色質區域類似于我們在P103中確定的超級增強子。總體而言,我們將這些可能的超級增強子區域稱為Rhabdoid Oncogenic MYC EnhancerRhOME),并根據它們在基因組中的位置進行編號。值得注意的是,與RhOME2相反,RhOME1PCAT1)和RhOME3CCDC26)先前在其他腫瘤實體中已被確定為MYC的調控區域。因此,我們的Hi-C4C實驗揭示,在不同的MRT PDOs中,與MYC啟動子相互作用的不同遠程增強子是活躍的(RhOME1-3)。RhOMEs的腫瘤間特異性進一步突顯了增強子RNAeRNAs)的表達,這是活躍的超級增強子所特有的,特異地在這些增強子在MRT PDOs中是活躍的并與MYC啟動子相互作用的情況下(圖3C)。這些結果表明,SMARCB1的喪失導致了一種表觀狀態,其特征是形成長程啟動子-增強子環路,這些環路對于PDO模型是特異的,但在來自不同供體的MRT PDOs之間是異質的。

       因為MRT PDOs在很大程度上保留了它們衍生自的組織的(表觀)遺傳特征,我們利用這些模型進一步探索患者特異的表觀遺傳程序,使用ATAC-seq(圖4A)。為了對在P103中喪失的OCR進行分層,我們執行了K均值聚類,包括來自三個PDOsATAC-seq數據和P103ChIP-seq數據(圖4A)。因此,我們可以將失去的OCR分類為(K1)非增強子CTCF結合位點、(K2)弱增強子和(K3)獨立于CTCF的超級增強子(圖4A)。與超級增強子在細胞身份控制中的功能一致,我們鑒定了SOX蛋白結合位點,包括SOX2SOX9SOX17,以及與K3簇特異性開放染色質位點、RhOME23.1 OCR相關的許多發育過程的功能注釋。此外,K3簇顯示了ncBAF復合物的最高染色質占有率,由BRD9 CUT&RUN測量,其在恢復SMARCB1表達后顯著減少。而K1K2簇在三個PDO模型中顯示了相似的可訪問性模式,K3簇的可訪問性喪失是特定于P103細胞系的(圖4A)。我們在P103中的Hi-C分析顯示,這些K3簇特異性超級增強子形成了絕緣邊界,這在重建SMARCB1表達后被有效地廢除(圖4BC)。因此,在MRT PDOs中的SMARCB1重建與基因組拓撲、BAF復合物占有率和增強子活性方面發生了戲劇性但局部、患者特異性的變化。

 

3|不同 MRT PDO 中患者特異性 MYC 增強子組的鑒定。

 

4|患者特異性超級增強子在 SMARCB1null 腫瘤 PDO 中形成獨立于 CTCF TAD 邊界。

 

4MYC 增強子可塑性反映在患者 MRT

       到目前為止,我們的數據引發了一個有趣的可能性,即在增強子利用的水平上存在推動MYC癌基因表達的腫瘤間異質性。為了將我們的體外發現推廣到患者組織,我們首先檢查了來自患者MRT組織的公開可獲得的H3K27ac ChIP-seq數據。如預期,MYC啟動子在大多數患者樣本中都標有高水平的H3K27ac,表明活躍的轉錄(圖5A)。此外,RhOME1-3處廣泛富集H3K27ac,顯示了在MRT PDOs中鑒定的腫瘤超級增強子景觀在MRT組織中的保留。在STJ0090STJ0537中未能檢測到RhOME1-3的清晰峰值,而在MYC啟動子處檢測到弱的H3K27ac信號。值得注意的是,與我們的PDO數據一致,不同患者樣本中在不同的RhOME位點檢測到H3K27ac峰的存在呈異質性分布(圖5A)。

       為了評估是否在腫瘤內存在差異的增強子利用,即腫瘤內異質性,我們利用單細胞Multiome10x Genomics)對七個MRT患者組織樣本進行了聯合單細胞RNA-seqATAC-seq(圖5B)。經過過濾,留下14,799個細胞用于進一步的分析,每個腫瘤中的中位數為2040個細胞(圖5C)。通過細胞類型標記基因41SMARCB1表達將正常和腫瘤細胞進行了分配。均勻流形逼近和投影(UMAP)空間顯示,腫瘤細胞按患者進行了聚類,而非惡性細胞按細胞類型進行了聚類(圖5C)。MYC表達以及MYC啟動子的OCR在所有MRT和一些正常細胞聚類中都有發現(圖5D)。然而,盡管在正常細胞中檢測到可察覺的MYC啟動子信號,但幾乎在RhOME1-3中沒有檢測到可訪問的染色質,這表明在至少這些樣本中,這些超級增強子是腫瘤特異性的。至關重要的是,我們觀察到在不同的患者MRTs中,RhOME1-3OCR組合是不同的(圖5DE)。更具體地說,盡管P156P168僅由RhOME2處的OCR定義,但P041P052主要顯示RhOME1RhOME3處的OCR,并且在P166中僅在RhOME3處檢測到OCR。在P116P138中在任何RhOME中都沒有發現OCR,這表明在這些腫瘤中通過RhOME1-3以外的調控元件發生了超生理激活MYC。總體而言,這些結果表明,在MRT中,存在在超級增強子活性水平上推動MYC癌基因表達的腫瘤間異質性。

 

5 | MRT 組織分析揭示了 MYC 增強子景觀的腫瘤間和腫瘤內異質性

 

5ncBAF 抑制誘導類似于 SMARCB1 重建的基因表達特征

       最近的研究表明,MRT可能由ncBAF復合物在MRT細胞中異常定位所驅動。因此,抑制ncBAF亞單位BRD9被證明是MRT中的一個潛在治療易感性。因此,我們著手研究ncBAF抑制對MRT PDOs的影響(圖6A)。為此,我們使用BRD9的藥物抑制劑(I-BRD9)處理MRT PDOs。我們觀察到,在形態上,MRT細胞呈現出與SMARCB1重建相似的分化表型(圖6A),并且細胞生長顯著受到抑制。定量RT-PCRRT-qPCR)證實,BRD9抑制導致MYC mRNA水平顯著下降(圖6B)。我們進行了RNA-seq以進一步測量ncBAF抑制后的轉錄組變化,并發現I-BRD9處理后引起的基因表達變化與SMARCB1重建后的變化之間存在顯著的關聯(圖6C)。為了在兩個基因集之間統計確認差異,我們對這兩個集合進行了Fisher確切性檢驗(圖6D),確認了強烈的相似性。與增殖下降一致,我們觀察到細胞周期相關基因集以及MYC靶基因的下調(圖6E)。在上調的基因集中,我們發現了與分化相關的基因的富集(圖6E),與用BRD9抑制劑處理的細胞的形態表型一致(圖6A)。BRD9SS18CUT&RUN證實了在MYC啟動子以及RhOME23位點的ncBAF復合物結合的減少(圖6F)。更一般地,在I-BRD9處理后觀察到BRD9SS18的基因組范圍內結合的喪失,這并不是由于處理引起的BRD9SS18蛋白表達的降低引起的。因此,證實了治療誘導的ncBAF復合物結合的喪失。因此,在MRT中抑制ncBAF復合物,消除了所有三個BAF復合物,呈現出重建SMARCB1表達的效應的表型。

       總的來說,我們的全面研究表明,由于SMARCB1喪失導致超級增強子活性的偏離支撐了MRT的腫瘤發生,并為揭示BAF復合物突變在各種癌癥中對腫瘤發生的貢獻提供了藍圖。


6 |通過使用藥物抑制劑靶向名為 BRD9 ncBAF 亞基來治療 MRT 患者

實驗方法:

       慢病毒轉導、定量RT-PCR、細胞活力測定、Western BlotRNA-seqATAC-seqChIP-seqCUT&RUNHi-C and 4C-seqMotif分析、單細胞多組 ATAC + GEX

參考文獻:

       Liu, N.Q., Paassen, I., Custers, L. et al. SMARCB1 loss activates patient-specific distal oncogenic enhancers in malignant rhabdoid tumors. Nat Commun 14, 7762 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43498-3