源自人體皮膚的工程皮膚替代品可顯著減少由外來/人造材料介導的炎癥反應，因此更易于臨床應用。I型膠原蛋白是傷口愈合過程中細胞外基質的主要成分，具有優異的生物相容性，富含血小板的血漿可作為愈合級聯的引發劑。脂肪間充質干細胞衍生的外泌體對于組織修復至關重要，在增強細胞再生、促進血管生成、調節炎癥和重塑細胞外基質方面發揮著關鍵作用。在此，I型膠原蛋白和富含血小板的血漿混合形成穩定的3D支架，為角化細胞和成纖維細胞粘附、遷移和增殖提供天然支持。將脂肪間充質干細胞衍生的外泌體添加到支架中，以改善工程皮膚的性能。分析了該細胞支架的理化性質，并在全層皮膚缺損小鼠模型中評估其修復效果。細胞支架可降低炎癥水平并促進細胞增殖和血管生成，從而加速傷口愈合。蛋白質組學分析表明，外泌體在富含膠原/血小板的血漿支架中表現出優異的抗炎和促血管生成作用。該方法為組織再生和傷口修復提供了新的治療策略和理論基礎。本文于2023年10月發表在《Advanced Materials》期刊上，IF=29.4

主要技術路線：

主要研究結果：

1、膠原（COL）/富含血小板的血漿（PRP）支架的設計和表征

       傷口發生后，傷口周圍血漿滲出，血小板立即被激活釋放血小板衍生生長因子（PDGF）促進血栓形成，形成凝膠狀團塊覆蓋傷口，這是傷口愈合反應的初始階段。PRP的提取和應用可用于模擬愈合級聯的啟動。此外，趨化因子招募的成纖維細胞通過膠原蛋白沉積修復傷口。愈合后期，血管和肉芽組織形成，角化細胞覆蓋創面。為了模擬傷口愈合微環境，使用COL-I和PRP生成生物支架，并添加成纖維細胞和角化細胞層。合成示意圖如圖1A所示。PRP和COL-I以不同質量比混合，加入10 μL mL?1凝血酶形成支架的主網絡。對支架的材料性能進行了測試。根據3D孔徑、彈性模量和拉伸強度選擇PRP的最佳質量比后，添加成纖維細胞和外泌體，然后接種角化細胞以覆蓋支架表面。然后使用四組評估COL/PRP支架對傷口愈合的影響：純PRP組和質量比為16:1、8:1和4:1的PRP/COL-I組。具有高度多孔結構的支架對于實現細胞遷移和“爬行”、不同細胞層之間的相互作用以及營養物質流動至關重要。首先，對不同質量比的COL/PRP支架的微觀結構進行了表征。不同質量比的COL/PRP支架表現出均勻的3D互連多孔結構（圖1B），孔徑范圍為20至120 μm，并且隨著PRP質量比的減小，孔徑逐漸減小。對于直徑為17-20 μm的成纖維細胞來說，這個孔徑可以為細胞生長提供足夠的面積和空間。本研究證實COL/PRP可以形成3D立體生物支架結構，為細胞粘附、遷移和增殖提供環境支持。COL/PRP支架的彈性模量，即抗變形能力，在質量比為8:1時最大，達到463±0.252 kPa（圖1C）。支架的組織粘合性質使其能夠保持與傷口的結合，降低使用過程中脫落的風險。搭接剪切試驗用于評估不同質量比下COL/PRP支架的組織粘附性能。每組的粘附強度約為5 kPa（圖1D），組間無顯著差異，證實COL/PRP支架滿足傷口表面粘附要求。8:1組的拉伸強度最高，達到220.6±3.725 kPa（圖1E）。蘇木精-伊紅（H&E）染色也顯示出均勻的孔隙結構，并且隨著PRP質量比的降低，結構變得更致密，孔徑逐漸減小（圖1F）。

       此外，為了評價COL/PRP支架是否具有良好的生物相容性，進行了活體/死亡實驗。每組支架分別與成纖維細胞（圖1G）和角化細胞（圖2A）共培養3d。成纖維細胞和角化細胞的活/死細胞染色僅見少量死亡細胞，與正常對照組結果相似，活細胞定量分析無明顯差異（圖1H和2D），證實該支架具有良好的細胞相容性。Ki67是用于評估細胞增殖的主要標志物。將不同質量比的COL/PRP支架與成纖維細胞和角化細胞共培養，并用Ki67染色（圖2B、C）。免疫熒光結果表明，8:1質量比組表達Ki67的成纖維細胞和角化細胞豐度最高（圖2E、F）。這些數據證實質量比為8:1的COL/PRP支架比其他組的COL/PRP支架具有更好的性能和更大的細胞增殖促進作用。因此，后續實驗均采用8:1的質量比。按照設計過程（圖1A），PRP和COL-I以8:1的質量比混合，并將105 cm?2成纖維細胞添加到1毫米厚的支架上。混合后，加入10 μL mL?1凝血酶以固化支架。細胞生長2天后，將105 cm?2的角化細胞接種到表面。如圖2G所示，角化細胞均勻分布在支架表面，形狀令人滿意，外觀呈鵝卵石狀。此外，支架中角化細胞特異性標記物K14和成纖維細胞特異性標記物