阿爾茨海默病（AD）是癡呆最常見的病因，也是全球亟待解決的主要醫學問題。該疾病的病理學特征是由淀粉樣-β肽（Aβ）在細胞外聚集構成的淀粉樣斑塊和由磷酸化Tau蛋白（pTau）構成的神經原纖維纏結在細胞內沉積。近年來，有人提出，致病蛋白通過細胞外囊泡（EVs）在神經元之間傳播參與了AD進展。外泌體、微囊泡和凋亡囊泡等EVs是含有多種蛋白質、脂質和核酸的分泌性膜囊。EVs可由多種細胞釋放，有報道稱來自CNS的EVs含有aβ、其分解代謝酶和Tau等分子，這些分子均在AD的發病機制中發揮重要作用。該研究發表在《Brain》，IF：14.5。

技術路線：

主要研究結果：

1. ATN分類中腦脊液細胞外囊泡的蛋白質組學分析

       工作流程如圖1所示。首先，利用受試者工作特征（ROC）曲線分析腦脊液aβ42、pTau和Tau的截斷值（cut-off值）（n=60；aβ42的cut-off值為677.9 pg/ml（AUC 0.80，靈敏度87%，特異度70%），pTau的cut-off值為73.0 pg/ml（AUC 0.74，靈敏度97%，特異度57%），tTau的cut-off值為597.7 pg/ml（AUC 0.80，靈敏度78%，特異度70%）。接下來，利用這些cut-off值設計蛋白質組學分析的發現集（表1）。

       為了鑒定與AD病理進展相關的蛋白質，研究者從16例參與者的腦脊液中分離出EVs，測量其粒徑并使用LC-MS/MS進行分析。分離的EV平均粒徑約為120nm。從腦脊液EV中共鑒定和定量了1756個蛋白質。鑒定的腦脊液EV蛋白質與Vesiclepedia數據庫中top100列表中的EV蛋白質進行了比較，在腦脊液EV蛋白質組學列表中發現了top100列表中的87個蛋白質。通過注釋、可視化和整合發現數據庫進行GO分析，進一步對腦脊液EV蛋白進行功能評估在生物過程、分子功能和細胞成分中富集的蛋白主要與細胞外結構組成和細胞外結構組織相關。這些結果表明，樣品富含EVs。A?T?N?組、A+T-N?/A+T?N+組和A+T+N+組腦脊液EVs分別鑒定出1487、1592和1535個蛋白質。在所有組中檢測到約95.2%的蛋白質（1671個蛋白質），A?T?N?、A+T?N?/A+T?N+和A+T+N+分別有1、30和15個蛋白質（圖2A）。兩組共有的蛋白質數量為：EV標志蛋白Alix、CD9和CD63的豐度水平在三組間無差異，表明蛋白質組學譜的差異很可能不是由于EV數量/組成的差異。

圖2 在ATN分類下對發現集中的腦脊液細胞外囊泡（EV）蛋白質進行蛋白質組學分析

2. 淀粉樣蛋白發病期間腦脊液和血漿細胞外囊泡中CatB水平升高

       CatB是在A?T?N?和A+T?N?/A+T?N+之間發生顯著變化的蛋白之一，與AD腦內的老年斑相關，也參與溶酶體蛋白酶介導的淀粉樣前體蛋白（APP）向Aβ的加工。因此，研究者選擇了CatB，在使用CSF和血漿EVs的更大規模隊列中驗證蛋白質組學結果。從136份腦脊液樣本中分離出EV，分為7個ATN組（表3），采用ELISA法測定其CatB水平（CSF-EV-CatB）。從CSF和血漿中分離出的EV平均粒徑約為105 nm。與蛋白質組學分析一致，CSF-EV-CatB水平顯著升高（A?，35.9±24.7 pg/ml；A+為95.4±23.9 pg/ml；P<0.0001)與淀粉樣蛋白陰性組相比（圖3A），并且A+和T+時的水平分別顯著高于A-和T-時的水平（圖3B）。CatB濃度與腦脊液aβ42濃度呈強負相關（r=?065，P<0.0001），與pTau呈極弱相關（r=0.172，P=0.046），與tTau呈弱相關（r=0.261，P=0.019）（圖3C-E）。這些結果表明CSF-EV-CatB與CSF的Aβ狀態密切相關。

圖3 基于ELISA方法驗證CatB在腦脊液細胞外囊泡中的表達

       EVs外周血中可用于監測病變在CNS。因此，研究者測量總CatB和EV CatB使用由ELISA血漿樣本136例（表3），由于等離子體的濃度CatB ATN組之間沒有顯著差異。與自由等離子CatB plasma-EV-CatB水平顯著增加相比，A?T?N?（A?T?N?，143.3±40.4 pg/ml；A+T?N?，177.7±52.6 pg/ml；P=0.042），而在其他AD連續組中沒有（圖4A）。A+組的水平顯著高于A-組，但T+/T?組和N+/N?組之間沒有差異（圖4B）。血漿-EV-CatB與CSF aβ42濃度呈中度負相關，但與CSF pTau或tau無中度負相關（圖4C-F）。這些結果提示血漿EV-CatB與腦脊液Aβ狀態相關。

圖4 ELISA驗證血漿細胞外囊泡中的CatB作為推定的血液生物標志物使用ATN分類

結論：

       總之，該研究對ATN分類中的腦脊液EVs進行的全蛋白質組分析發現，淀粉樣蛋白陽性組和淀粉樣蛋白陰性組之間有6種蛋白質發生了顯著變化。此外，對136份樣本的ELISA分析證實，隨著淀粉樣蛋白進展，CSF和血漿中EVs中的CatB水平升高，表明EVs中的CatB可能參與AD淀粉樣蛋白的發病機制。除了與淀粉樣蛋白病理相關的蛋白，EV蛋白質組分析揭示了一些病理生理功能未知的蛋白，這些蛋白的表達在Tau蛋白病理/神經變性中發生了改變，這可能有助于闡明AD的分子發病機制和開發新的治療藥物。

實驗方法：

       質譜分析，免疫測定，ELISA，蛋白質組學分析

參考文獻：

       Yuyama K, Sun H, Fujii R, Hemmi I, Ueda K, Igeta Y. Extracellular vesicle proteome unveils cathepsin B connection to Alzheimer's disease pathogenesis. Brain. 2023 Dec 10:awad361. doi: 10.1093/brain/awad361.