血行播散是結(jié)腸直腸癌（CRC）轉(zhuǎn)移的一種普遍途徑。然而，作為血管的守門人，腫瘤外膜細(xì)胞（TPCs）在血行轉(zhuǎn)移中的作用仍然大部分未知。本文旨在研究TPCs的異質(zhì)性及其對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的影響。作者從有或沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者中分離TPCs，并通過單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）進(jìn)行分析。通過scRNA-seq鑒定了13個(gè)TPC亞群。一種新的TCF21高表達(dá)的TPC亞群，被稱為“基質(zhì)-外膜細(xì)胞”，與CRC患者的肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。TPCs中的TCF21增加了血管周圍ECM的硬度，膠原重排和基底膜降解，建立了一種促使結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移（CRCLM）的外膜細(xì)胞轉(zhuǎn)移微環(huán)境。TPCs中的Tcf21耗盡減輕了血管周圍ECM的重塑和CRCLM，而TCF21高表達(dá)的TPCs與CRC細(xì)胞的共注射顯著促進(jìn)了CRCLM。在機(jī)制上，整合素α5的喪失抑制了FAK/PI3K/AKT/DNMT1軸，從而損害了TCF21高表達(dá)TPCs中的TCF21 DNA高甲基化。本研究揭示了TPCs在血行轉(zhuǎn)移中的先前未知角色，并為CRC轉(zhuǎn)移提供了潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本文于2023年4月發(fā)表在《Gut》IF：24.5期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、鑒別與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)的TPCs的特定亞群

       為剖析TPCs的異質(zhì)性并評(píng)估它們對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的貢獻(xiàn)，從有或沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的原發(fā)腫瘤組織中分離了TPCs，并進(jìn)行了scRNA-seq分析。從50,000個(gè)細(xì)胞中生成了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，這些細(xì)胞在t-SNE空間中對(duì)比，以識(shí)別出不同的聚類（圖1A）。TPCs的基因表達(dá)譜被分類為13個(gè)不同的聚類（圖1B）。圖1C顯示了前10個(gè)聚類特異性基因。在所有亞群中，聚類2中細(xì)胞的比例在有（18.5%）和沒有（3.4%）肝轉(zhuǎn)移的CRC患者之間顯示了最大的差異（圖1D），表明這個(gè)亞群與CRCLM相關(guān)。GO富集分析表明，在來自有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的樣本中，上調(diào)的基因與ECM相關(guān)的幾個(gè)GO術(shù)語有關(guān)（圖1E），包括MATN2、CHI3L1、COL3A1、COL1A2、CILP、MMP2、MFAP4、FBLN1和FBLN2（圖1F）。因此，聚類2中的細(xì)胞被定義為基質(zhì)-外膜細(xì)胞。在聚類2中獨(dú)特富集的基因之一是MATN2，它編碼蛋白質(zhì)matrilin-2（MATN2），被選擇為基質(zhì)-外膜細(xì)胞的生物標(biāo)志物。在源自有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的腫瘤切片中，MATN2+ TPCs的比例高于沒有肝轉(zhuǎn)移的患者（圖1G）。此外，ROC曲線分析顯示，MATN2+ TPCs的最佳截?cái)喟俜直龋愿哽`敏度和特異性預(yù)測(cè)CRCLM，為30%（圖1H）。Kaplan-Meier生存分析顯示，在MATN2+ TPCs比例較高（>30%）的患者中，總生存（OS）（圖1I）和無病生存（DFS）（圖1J）較短。這些數(shù)據(jù)表明，基質(zhì)-外膜細(xì)胞與CRC轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖1 結(jié)直腸癌患者TPCs中基質(zhì)周細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征

2、TPCs中的TCF21與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)

       使用單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷和聚類（SCENIC）流程鑒定了基質(zhì)-外膜細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子，該流程將順式調(diào)控序列信息與scRNA-seq數(shù)據(jù)相連接。SCENIC分析顯示，TCF21的調(diào)控區(qū)活性在基質(zhì)-外膜細(xì)胞中最高（圖2A），在所有細(xì)胞的t-SNE空間中得到了確認(rèn)（圖2B）。此外，與沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者相比，有肝轉(zhuǎn)移的患者樣本中TCF21高表達(dá)的TPCs數(shù)量顯著增加（圖2C）。在有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的腫瘤切片中，TCF21+ TPCs的比例也增加了（圖2D）。Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示TCF21+ TPCs比例與MATN2+基質(zhì)-外膜細(xì)胞呈正相關(guān)（r=0.805，P<0.001；圖2E）。ROC曲線分析顯示，預(yù)測(cè)有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者中TCF21+ TPCs的最佳百分比為44%（圖2F）。Kaplan-Meier生存分析表明，在TCF21+ TPCs比例較高（>44%）的患者中，總生存（OS）（圖2G）和無病生存（DFS）（圖2H）顯著縮短。這些發(fā)現(xiàn)表明TPCs中的TCF21可作為CRC轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物。

圖2 基質(zhì)周細(xì)胞TCF21與結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)

3、TPCs中的TCF21對(duì)基質(zhì)-外膜細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變和血管周圍ECM的重塑起促進(jìn)作用

       TCF21在TPCs中的上調(diào)與CRCLM之間的正相關(guān)表明，TCF21可能參與了TPCs的激活，并可能促進(jìn)基質(zhì)-外膜細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變。基質(zhì)-外膜細(xì)胞中的九個(gè)基因，包括IGFBP5、CILP、MFAP4、c11orf96、A2M、SFRP2、MAF、PTGDS和MATN2，在TPCNM TCF21中顯著高于TPCNM Vector（圖3A）。此外，在TPCNM中過表達(dá)TCF21會(huì)增加MATN2+基質(zhì)-外膜細(xì)胞的百分比，而在TPCLM中敲除TCF21會(huì)減少MATN2+基質(zhì)-外膜細(xì)胞的百分比（圖3B）。

       使用全轉(zhuǎn)錄組RNA-seq和ChIP-seq分析，對(duì)TCF21下游基因在TPCs中進(jìn)行了調(diào)查。RNA-seq和ChIP-seq結(jié)果的GO富集分析顯示，由TCF21調(diào)控的基因與“ECM組織”和“ECM”等類別相關(guān)（圖3C、D），與基質(zhì)-外膜細(xì)胞的表達(dá)譜相似。此外，通過比較ChIP-seq分析檢測(cè)到的TCF21峰值、RNA-seq檢測(cè)到的TCF21誘導(dǎo)基因和scRNA-seq檢測(cè)到的基質(zhì)-外膜細(xì)胞基因，確定了139個(gè)重疊基因（圖3E）。這些重疊基因的GO分析顯示它們與“含膠原的ECM”和ECM等類別相關(guān)（圖3F）。這些結(jié)果通過RT-qPCR和ChIP-qPCR進(jìn)行了確認(rèn)，TCF21與基質(zhì)-外膜細(xì)胞特異基因的啟動(dòng)子的結(jié)合在TCF21過表達(dá)的TPCNM中顯著上調(diào)（圖3G、H），Western blotting進(jìn)一步確認(rèn)了這些結(jié)果（圖3I）。這些結(jié)果表明TCF21對(duì)于基質(zhì)-外膜細(xì)胞的生成至關(guān)重要。

       ECM重塑對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它以異常的膠原產(chǎn)生和交聯(lián)為特征，導(dǎo)致組織硬度增加，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。此外，矩陣金屬蛋白酶等蛋白酶對(duì)血管基底膜的降解促使腫瘤細(xì)胞逃離原發(fā)腫瘤部位。作者提出TCF21可能在血管周圍ECM重塑和CRC轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。原子力顯微鏡（AFM）顯示，與TPCNM Vector相比，TPCNM TCF21在誘導(dǎo)膠原局部排列、卷曲和片狀膠原纖維重新組織成輻射和捆綁結(jié)構(gòu)以及增加粗糙度方面具有更強(qiáng)的能力（圖3J）。此外，TPCNM TCF21優(yōu)于TPCNM Vector在增加膠原的機(jī)械性能（圖3K）和增加膠原收縮（圖3L）方面，從而增強(qiáng)ECM的硬度。為了進(jìn)一步評(píng)估TCF21介導(dǎo)的血管周圍ECM重塑對(duì)CRC細(xì)胞跨越的影響，PKH-67標(biāo)記的HCT116或DLD-1細(xì)胞與TPCNM Vector、TPCNM TCF21、TPCLM siNC或TPCLM siTCF21混合后播種到Matrigel中。TPCNM TCF21比TPCNM Vector更有利于CRC細(xì)胞通過Matrigel涂覆的Transwell膜侵入（圖3M），而TPCLM siTCF21減少了與TPCLM siNC相比的CRC細(xì)胞的侵入。在一個(gè)器官樣培養(yǎng)系統(tǒng)上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，在由膠原I和Matrigel組成的基質(zhì)與TPCNM TCF21預(yù)混比與TPCNM Vector相比，侵入的HCT116細(xì)胞數(shù)量顯著增加（圖3N）。總體而言，這些結(jié)果表明在基質(zhì)-外膜細(xì)胞中的TCF21誘導(dǎo)血管周圍ECM的重塑，從而促使CRC細(xì)胞通過血管周圍的基質(zhì)進(jìn)行侵入。

圖3 TCF21對(duì)于基質(zhì)周細(xì)胞的形成至關(guān)重要，并通過ECM重塑促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲

4、敲除TPCs中的Tcf21抑制CRC轉(zhuǎn)移

       為確定TPCs中的TCF21是否對(duì)CRC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，作者生成了外膜細(xì)胞譜系追蹤小鼠（PClin）和誘導(dǎo)劑型Cspg4驅(qū)動(dòng)的外膜細(xì)胞特異性Tcf21敲除小鼠（PClin-KO）（圖4A）。對(duì)PClin和PClin-KO小鼠同時(shí)進(jìn)行了鹽酸酮庚酮的給藥，結(jié)果是對(duì)外膜細(xì)胞進(jìn)行了永久標(biāo)記，并敲除了PClin-KO小鼠中的Tcf21。為檢查TPCs中的TCF21對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的影響，先分別將PClin和PClin-KO小鼠注射熒光素標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞（MC38-luc-LM3），然后進(jìn)行1周的鹽酸酮庚酮處理。鹽酸酮庚酮處理誘導(dǎo)了TPCs中的Cre活性，這表現(xiàn)為PClin和PClin-KO小鼠中的tdT熒光，以及PClin-KO小鼠中TCF21的喪失。在體內(nèi)，TPCs特異性敲除Tcf21顯著抑制了肝轉(zhuǎn)移的形成（圖4B）。與PClin小鼠相比，PClin-KO小鼠中肝轉(zhuǎn)移灶的面積和數(shù)量顯著減少（圖4C）。此外，在PClin-KO小鼠中，EpCAM+CD45? CTCs的數(shù)量明顯低于PClin小鼠（圖4D）。這些數(shù)據(jù)表明，TPCs中的TCF21促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移，獨(dú)立于腫瘤生長和EMT。

       對(duì)TCFs在TPCs中對(duì)血管結(jié)構(gòu)和功能的影響進(jìn)一步通過評(píng)估外膜細(xì)胞覆蓋率和腫瘤血管中MATN2+基質(zhì)-外膜細(xì)胞的百分比來進(jìn)行評(píng)估。在MC38-luc-LM3 CRCLM移植小鼠的原發(fā)腫瘤組織中，MATN2+基質(zhì)-外膜細(xì)胞的數(shù)量在PClin-KO小鼠中低于PClin小鼠（圖4E）。此外，PClin小鼠的TPCs中與ECM重塑相關(guān)的蛋白，包括MMP2、COL1A2、COL3A1和CHI3L1的表達(dá)，明顯高于PClin-KO小鼠（圖4F）。Masson染色顯示PClin-KO小鼠的腫瘤切片中纖維膠原成分的密度顯著降低，相比之下，PClin小鼠的腫瘤切片中纖維膠原成分的密度較高（圖4G）。透射電子顯微鏡分析表明，在PClin-KO小鼠的腫瘤切片中，血管周圍區(qū)域的膠原束較PClin小鼠的薄（圖4H）。膠原的沉積是組織硬度和腫瘤細(xì)胞的局部侵襲性所必需的，而膠原方向的改變也是腫瘤轉(zhuǎn)移的原因之一。通過二次諧波發(fā)生和雙光子激發(fā)熒光進(jìn)一步檢查了血管周圍膠原的結(jié)構(gòu)。PClin-KO小鼠中的血管周圍膠原纖維呈不規(guī)則排列，呈卷曲和不規(guī)則的輪廓，而PClin小鼠中的血管周圍膠原呈幾乎平行的方向，并緊密地環(huán)繞在腫瘤血管周圍（圖4I）。通過AFM確定了血管周圍區(qū)域的硬度，并用楊氏模量圖案進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PClin-KO小鼠中的血管周圍區(qū)域明顯較PClin小鼠中軟（圖4J、K）。由于基底膜在阻止腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲方面起著物理屏障作用，基底膜的降解可能削弱其屏障功能并增加血管滲透性。結(jié)果顯示，PClin-KO小鼠中laminin（血管基底膜中最豐富的成分）的表達(dá)顯著高于PClin小鼠（圖4L），而TPCs中的Tcf21的敲除導(dǎo)致PClin-KO小鼠中血管的滲透性降低，相對(duì)于PClin小鼠（圖4M）。綜上所述，基質(zhì)-外膜細(xì)胞中的TCF21可能是血管周圍ECM重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，建立了一個(gè)促使CRC細(xì)胞內(nèi)滲的PMM。

圖4 周細(xì)胞特異性敲除Tcf21抑制血管周圍ECM的重塑和CRC轉(zhuǎn)移

5、缺失整合素α5減弱了TCF21啟動(dòng)子的DNA甲基化，并增加了TPCs中TCF21的表達(dá)

       整合素是ECM成分的關(guān)鍵受體，起到機(jī)械傳導(dǎo)作用，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示，在13個(gè)TPCs簇中，ITGA2、ITGA5和ITGB1在基質(zhì)-外膜細(xì)胞中顯著減少（圖5A）。功能實(shí)驗(yàn)表明，整合素α5在mRNA和蛋白水平上負(fù)調(diào)控TCF21（圖5B）。此外，整合素α5正調(diào)控TCF21 DNA的高甲基化，TPCs中整合素α5的喪失減弱了TPCs中TCF21啟動(dòng)子的DNA高甲基化（圖5C）。

       據(jù)報(bào)道DNMT1在肺癌中調(diào)節(jié)TCF21的DNA高甲基化。結(jié)果顯示，整合素α5的敲除通過抑制FAK/PI3K/AKT通路減少了TPCNM中DNMT1的表達(dá)，而在TPCLM中整合素α5的過表達(dá)產(chǎn)生了相反的效果，這可以通過FAK抑制劑Y15逆轉(zhuǎn)（圖5D）。此外，Y15或DNMT抑制劑SGI1027都減少了DNMT1的表達(dá)，并抑制了TCF21的DNA高甲基化（圖5E），隨后在TPCLM ITGA5中增加了TCF21的表達(dá)（圖5D）。這些結(jié)果表明，整合素α5的喪失通過抑制TCF21的DNA高甲基化上調(diào)了TPCs中的TCF21。

在通過注射HCT116-luc-LM3或DLD1-luc-LM3細(xì)胞和過表達(dá)或沉默整合素α5的TPCs生成的正位異位移植模型中，研究了TPCs中整合素α5對(duì)CRC轉(zhuǎn)移的影響（圖5F）。與TPCNM shNC相比，TPCNM shITGA5增加了腫瘤組織血管周圍區(qū)域的膠原密度（圖5G），并顯著增加了肝臟轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量和面積（圖5H）。相反，與TPCLM Vector相比，腫瘤細(xì)胞與TPCLM ITGA5的共注射顯示了相反的效果（圖5G、H）。這些數(shù)據(jù)表明，TPCs中整合素α5的喪失促進(jìn)了CRC的轉(zhuǎn)移。

圖5 整合素α5缺失可抑制TCF21啟動(dòng)子的高甲基化，上調(diào)TCF21在TPC中的表達(dá)

6、TCF21高表達(dá)的基質(zhì)-外膜細(xì)胞與CRC患者的血管周圍ECM重塑和肝轉(zhuǎn)移相關(guān)

       為確定上述發(fā)現(xiàn)是否適用于CRC患者，評(píng)估了具有和不具有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的血管周圍膠原沉積和排列情況。與沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者相比，有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的血管周圍膠原豐度以及血管周圍膠原纖維向徑向排列的重新定向更為顯著（圖6A、B）。此外，與沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者相比，有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的血管周圍區(qū)域的硬度顯著增強(qiáng)（圖6C、D）。此外，與沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者相比，有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的TPCs中COL1A2、COL3A1和CHI3L1的表達(dá)（圖6E）以及參與基底膜降解的關(guān)鍵蛋白酶MMP2（圖6F）的表達(dá)更高。相應(yīng)地，與沒有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者相比，有肝轉(zhuǎn)移的CRC患者的TPCs中整合素α5的表達(dá)較低（圖6G）。Pearson相關(guān)分析表明，TPCs中MMP2、COL1A2、COL3A1和CHI3L1的水平呈正相關(guān)，而TPCs中整合素α5的水平與TCF21高表達(dá)的TPCs比率呈負(fù)相關(guān)（圖6E–G）。這些臨床數(shù)據(jù)表明，整合素α5喪失導(dǎo)致TCF21的上調(diào)是血管周圍ECM重塑和PMM建立的重要調(diào)節(jié)因子，從而促進(jìn)CRC的轉(zhuǎn)移。

圖6 基質(zhì)周細(xì)胞中的TCF21與CRC患者原發(fā)性腫瘤血管周圍ECM的重塑有關(guān)

實(shí)驗(yàn)方法：

       細(xì)胞培養(yǎng)，人體樣本的獲取，小鼠模型，TPC細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，scRNA-seq及其生信分析，重組細(xì)胞的構(gòu)建，流式細(xì)胞術(shù)，細(xì)胞追蹤，血管通透性實(shí)驗(yàn)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的分離和鑒定，染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）和ChIP- seq，RT-qPCR，Y15和SGI1027處理，WB，免疫熒光，H&E染色，免疫組織化學(xué)和Masson染色，RNA測(cè)序，遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，膠原凝膠收縮試驗(yàn)，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，粘附實(shí)驗(yàn)，管形成實(shí)驗(yàn)，透射電鏡分析，二次諧波產(chǎn)生和雙光子激發(fā)熒光（SHG/TPEF），原子力顯微鏡（AFM）測(cè)量，DNA提取和亞硫酸鹽測(cè)序，器官型培養(yǎng)系統(tǒng)

參考文獻(xiàn)：

       Li X, Pan J, Liu T, Yin W, Miao Q, Zhao Z, Gao Y, Zheng W, Li H, Deng R, Huang D, Qiu S, Zhang Y, Qi Q, Deng L, Huang M, Tang PM, Cao Y, Chen M, Ye W, Zhang D. Novel TCF21high pericyte subpopulation promotes colorectal cancer metastasis by remodelling perivascular matrix. Gut. 2023 Apr;72(4):710-721. doi: 10.1136/gutjnl-2022-327913. Epub 2022 Sep 7. PMID: 36805487; PMCID: PMC10086488.