彌漫型胃癌（DGC）和腸型胃癌（IGC）是胃癌（GC）的主要組織學(xué)類型。目前對(duì)DGC和IGC差異的分子機(jī)制了解甚少。在這項(xiàng)研究中，進(jìn)行了包括蛋白質(zhì)組、磷酸蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄因子（TF）活性分析在內(nèi)的多層次蛋白質(zhì)組學(xué)研究，涵蓋了196例中國(guó)患者的DGC和IGC病例。綜合蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了與DGC和IGC之間相反預(yù)后效果相關(guān)的ARIDIA突變，通過對(duì)它們相應(yīng)蛋白質(zhì)組的多樣影響。系統(tǒng)比較和共識(shí)聚類分析分別基于細(xì)胞周期、細(xì)胞外基質(zhì)組織以及免疫應(yīng)答相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的不同模式，確定了DGC和IGC的三個(gè)亞型。基于TF活性的亞型表明，DGC和IGC的疾病進(jìn)展受SWI/SNF和NFKB復(fù)合物的調(diào)節(jié)。此外，推斷的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和免疫聚類顯示Th1/Th2比例是免疫治療有效性的指標(biāo)，在一個(gè)獨(dú)立的GC抗PD1治療患者組中得到驗(yàn)證。本研究的多層次蛋白質(zhì)組學(xué)分析有助于更全面地理解GC，并能進(jìn)一步推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展。本文于2023年2月發(fā)表在《nature communications》IF：16.6期刊上。

技術(shù)路線：

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1、胃癌隊(duì)列的全面蛋白質(zhì)組學(xué)景觀

本研究收集了196對(duì)原發(fā)性胃癌樣本（DGC，n=83；IGC，n=102；混合型胃癌（MGC），n=11），以及來(lái)自未接受治療的中國(guó)患者的正常對(duì)照組（NATs）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖如圖1a所示。多層次蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)使大家能夠全面探索胃癌組織與正常對(duì)照組之間蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。蛋白質(zhì)組的基因集富集分析（GSEA）表明，在腫瘤組織中，與DNA復(fù)制、細(xì)胞周期、細(xì)胞外基質(zhì)組織和免疫應(yīng)答相關(guān)的蛋白質(zhì)明顯上調(diào)，而與代謝（如脂肪酸β氧化、三羧酸循環(huán)（TCA）和氧化磷酸化）相關(guān)的蛋白質(zhì)在腫瘤組織中明顯下調(diào)（圖1b）。轉(zhuǎn)錄因子活性分析的通路富集分析表明，在腫瘤組織中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子涉及介導(dǎo)細(xì)胞周期、NF-κB信號(hào)通路和Ras信號(hào)通路，而在正常對(duì)照組中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子涉及鈣信號(hào)通路、葡萄糖素信號(hào)通路和cAMP信號(hào)通路（圖1b）。磷酸蛋白質(zhì)組的通路富集分析表明，腫瘤磷酸化蛋白涉及癌變相關(guān)的通路/過程，如細(xì)胞周期、TP53活性調(diào)控和DNA修復(fù)等，而正常對(duì)照組的磷酸化蛋白涉及生理功能，如囊泡介導(dǎo)運(yùn)輸、膜運(yùn)輸和葡萄糖代謝等（圖1b）。這些分析表明，腫瘤組織在蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄因子活性和磷酸蛋白質(zhì)組水平上的特征顯示部分一致性，同時(shí)存在一些差異。

值得注意的是，所有三個(gè)數(shù)據(jù)集中涉及細(xì)胞周期的蛋白質(zhì)均呈上調(diào)狀態(tài)。細(xì)胞周期蛋白質(zhì)的評(píng)估基于它們的變化表達(dá)模式（WAPAL、AHCTF1等）、磷酸化模式（CCNL1 T67、SMC4 S41等）和在胃癌腫瘤組織中推斷的轉(zhuǎn)錄因子活性（SMARCA5、E2F3等）（圖1c）。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)特征比較了轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的靶基因（TGs）在腫瘤組織和正常對(duì)照組中的表達(dá)。如圖1d所示，TF-TG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)表明TGs的表達(dá)水平呈現(xiàn)出與組織特異性TFs相似的趨勢(shì)。

為了探索激酶在胃癌中的作用，選擇了在腫瘤組織和正常對(duì)照組之間表達(dá)變化較大的磷酸位點(diǎn)，而不同于其蛋白質(zhì)表達(dá)變化。胃癌相關(guān)磷酸位點(diǎn)的激酶底物富集分析（KSEA）確定了多個(gè)激酶，包括CDK1、CDK2、CSNK2A1、CAMK2A、PAK1、MAPK1和MAPK3，在胃癌腫瘤組織中被激活（圖1e）。這些激酶調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以及GPCR信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路等多個(gè)致癌通路。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK1、MAPK3和CDK1的表達(dá)、磷酸化和活性均有所增加；因此，這三個(gè)激酶可能成為胃癌患者的潛在藥物靶點(diǎn)（圖1f）。

因此，本研究迄今為止建立了中國(guó)胃癌患者的全面蛋白質(zhì)組學(xué)景觀。此外，這些數(shù)據(jù)集可作為一個(gè)多層次的資源，用于研究胃癌病理學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。

圖1 人GC樣品的多級(jí)蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

2、ARID1A基因突變?cè)?/span>DGC和IGC中表現(xiàn)出不同的影響

為研究胃癌遺傳信息的變化，對(duì)65例DGC患者中的274個(gè)癌癥驅(qū)動(dòng)基因和GC熱點(diǎn)基因的突變頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。圖2a展示了至少有9%患者中檢測(cè)到突變的13個(gè)基因。在這些基因突變中，TP53、CDH1、KMT2D、RHOA、ARID1A、APC和PIK3CA被檢測(cè)為高頻突變（10.8-47.7%），與先前的報(bào)告一致。為了探討基因突變與預(yù)后結(jié)果的關(guān)聯(lián)，基于生存結(jié)果計(jì)算了基因突變的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）。發(fā)現(xiàn)患有ARID1A突變的患者預(yù)后不利（圖2b）。

影響同一基因座位的基因表達(dá)水平的基因組變化被稱為順式效應(yīng)，而影響另一基因座位的變化則被定義為反式效應(yīng)。作者全面地表征了基因變化對(duì)蛋白質(zhì)水平的順、反式效應(yīng)（圖2c）。與順式效應(yīng)相比，蛋白質(zhì)豐度的變化在許多反式效應(yīng)中更為顯著，并且這些變化具有生物學(xué)過程的傾向。一致地，患有CDH1突變的患者的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)表達(dá)較低（圖2c），顯示了CDH1基因在細(xì)胞外基質(zhì)組織中的功能。重要的是，只有三個(gè)基因顯示了順式效應(yīng)：TP53、PIK3CA和ARID1A。患有TP53或PIK3CA突變的患者其相應(yīng)蛋白質(zhì)的豐度增加，而患有ARID1A突變的患者其ARID1A蛋白質(zhì)表達(dá)較低（圖2d）。作者還比較了ARID1A在7例患有ARID1A突變和野生型患者中的轉(zhuǎn)錄因子活性。發(fā)現(xiàn)ARID1A的轉(zhuǎn)錄因子活性在患有ARID1A突變的患者中也減少了（圖2d）。這些結(jié)果表明ARID1A突變導(dǎo)致其蛋白質(zhì)表達(dá)降低和轉(zhuǎn)錄因子活性減少。

作為唯一與不利預(yù)后相關(guān)的基因突變，作者進(jìn)一步研究了ARID1A突變與癌癥蛋白質(zhì)組的變化之間的關(guān)系，即相關(guān)蛋白和通路的變化。挖掘了ARID1A的TGs數(shù)據(jù)。ARID1A主要被報(bào)道為轉(zhuǎn)錄抑制因子。因此，調(diào)查了在ARID1A突變患者中升高的TGs。GSEA分析顯示在具有和不具有ARID1A突變的樣本之間存在顯著變化的通路。基于標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)在ARID1A突變患者中，模式識(shí)別受體信號(hào)通路和TLR信號(hào)通路是富集最顯著的通路（圖2e–f）。在參與TLR信號(hào)通路的15個(gè)蛋白質(zhì)中，CD14和PIK3AP1在ARID1A突變患者中顯著上調(diào)（圖2g，h）。此外，預(yù)后分析顯示CD14是DGC中的不良預(yù)后蛋白質(zhì)（圖2i）。這些結(jié)果表明，患有ARID1A突變的患者具有不良預(yù)后，并且激活了CD14介導(dǎo)的TLR信號(hào)通路。而在IGC中的結(jié)果則相反。這些結(jié)果表明，ARID1A的突變?cè)?/span>DGC和IGC之間產(chǎn)生了相反的預(yù)后效應(yīng)，通過對(duì)它們相應(yīng)蛋白質(zhì)組的多樣影響。因此，基于多層次蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)比較DGC和IGC是很重要的。

圖2 DGC蛋白基因組學(xué)分析總覽

3、綜合多層次蛋白質(zhì)組學(xué)研究DGC和IGC

Lauren分類包括DGC、IGC和MGC，其中前兩種病理類型是主要的。在本研究的隊(duì)列中，臨床信息顯示DGC的發(fā)展與年齡、腫瘤位置和淋巴血管侵襲顯著相關(guān)（圖3a）。與當(dāng)前的臨床知識(shí)一致，生存分析顯示IGC患者的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)（圖3b）。為了進(jìn)一步研究DGC和IGC之間的腫瘤異質(zhì)性，比較了多層次（蛋白質(zhì)組、磷酸蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄因子活性）的差異表達(dá)。根據(jù)腫瘤組織與正常對(duì)照組的比值，發(fā)現(xiàn)DGC和IGC之間存在384個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。其中，83個(gè)在DGC中上調(diào)，301個(gè)在IGC中上調(diào)（圖3c）。

為了探索DGC中腫瘤微環(huán)境的不同效應(yīng)，比較了DGC和IGC的xCell scores。DGC的微環(huán)境和免疫分?jǐn)?shù)高于IGC（圖3d），表明DGC中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度較IGC更高。隨后，比較了在DGC和IGC腫瘤中普遍存在的免疫細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DGC腫瘤中CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度高于IGC腫瘤（圖3e）。對(duì)于DGC患者，觀察到RB1的磷酸化增加，TF活性降低，而E2F活性和CDK4/6水平在DGC中上調(diào)（圖3f）。這種綜合分析表明，在DGC中，RB1被磷酸化并促使與E2F的解離，增加了E2F的活性，并推動(dòng)了細(xì)胞周期的進(jìn)展。這些結(jié)果表明了利用CDK4/6復(fù)合物作為DGC的潛在藥物靶點(diǎn)的可能性。

對(duì)于IGC患者，作者通過評(píng)估激酶活性、磷酸位點(diǎn)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平來(lái)全面調(diào)查DNA修復(fù)網(wǎng)絡(luò)。包括MLH1、MSH3和MSH6在內(nèi)的12個(gè)參與DNA損傷的蛋白質(zhì)在IGC患者中上調(diào)（圖3g）。進(jìn)一步的研究顯示，IGC患者中DNA損傷蛋白上的磷酸位點(diǎn)增加，包括PARP1、SMC3和SSRP1。此外，比較分析表明，IGC患者中磷酸化的ATM/ATR上調(diào)（圖3g）。先前的研究表明，ATM/ATR作為DNA修復(fù)網(wǎng)絡(luò)的核心組成部分，在DNA雙鏈斷裂事件中被激活以啟動(dòng)同源重組修復(fù)。因此，可以推斷DNA損傷相關(guān)蛋白質(zhì)可能成為IGC的潛在藥物靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，在TCGA隊(duì)列中驗(yàn)證了DGC和IGC的潛在藥物靶點(diǎn)。比較了CDK4/6和ATM/ATR的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)CDK4在DGC中的表達(dá)較高，而ATR在IGC中的表達(dá)較高（圖3h）。此外，預(yù)后分析顯示CDK4和ATR的表達(dá)分別與DGC和IGC的臨床結(jié)果呈負(fù)相關(guān)（圖3i）。這些結(jié)果證明了CDK4/6和ATM/ATR分別是DGC和IGC的潛在靶點(diǎn)（圖3j）。

圖3 綜合多水平蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示DGC和IGC的致病機(jī)制不同

4、胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)亞型及其與臨床結(jié)果的關(guān)系

在臨床上，腫瘤治療在很大程度上依賴于組織學(xué)檢查。越來(lái)越多的研究表明，在每種腫瘤組織學(xué)類型中都存在不同的分子亞型，這些亞型具有不同的預(yù)后和治療靶點(diǎn)。基于DGC腫瘤組織與正常對(duì)照組中上調(diào)的蛋白質(zhì)的共識(shí)聚類識(shí)別出三個(gè)DGC蛋白質(zhì)亞型：DGC cluster 1（n = 23）、DGC cluster 2（n = 28）和DGC cluster 3（n = 28）。多變量Cox回歸分析表明，這些亞型與臨床結(jié)果顯著相關(guān)，包括性別、年齡、TNM分期和化療（圖4a，b）。這一結(jié)果表明，蛋白質(zhì)亞型劃分可作為獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

這些亞型顯示出明顯的分子特征。分別在DGC和IGC聚類中鑒定了2367和3154個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。在六個(gè)亞型中，DGC cluster 1和IGC cluster 3以細(xì)胞周期（如CDK1/2和CDK6）和DNA復(fù)制（如ORCS3和AHCTF1）為特征；DGC cluster 2和IGC cluster 2以細(xì)胞外基質(zhì)組織（如DMD和MUC5AC）、膠原形成和生物合成（如CD36、COL6A1和LAMA2）為特征；許多與免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)（如CD163、IDO1和ICAM1），以及調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞脫顆粒和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的蛋白質(zhì)（如FCER1G、IL 16和C5）在DGC cluster 3和IGC cluster 1中過度表達(dá)（圖4c）。

ssGSEA分析進(jìn)一步表明，細(xì)胞周期和免疫應(yīng)答相關(guān)的信號(hào)通路的標(biāo)準(zhǔn)化富集分?jǐn)?shù)（NESs）與DGC和IGC中不同的臨床結(jié)果相關(guān)（圖4d）。調(diào)節(jié)紡錘體裝配和DNA復(fù)制中涉及的DNA解旋與DGC中的良好預(yù)后相關(guān)。然而，在IGC中，調(diào)節(jié)有絲分裂細(xì)胞周期和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相轉(zhuǎn)變與不良預(yù)后相關(guān)。

由于細(xì)胞周期狀態(tài)影響患者對(duì)輔助化療的敏感性，作者比較了在每個(gè)亞型中接受輔助化療和未接受輔助化療的患者的預(yù)后。發(fā)現(xiàn)DGC cluster 1患者對(duì)輔助化療不敏感，而IGC cluster 3患者對(duì)其敏感（圖4e）。為了評(píng)估腫瘤細(xì)胞周期相如何影響患者對(duì)化療的敏感性，進(jìn)行了進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)DGC cluster 1患者中有最高比例的患者上調(diào)了S期標(biāo)志性蛋白，而IGC cluster 3患者中有最高比例的患者上調(diào)了G2M期轉(zhuǎn)變標(biāo)志性蛋白（圖4f）。進(jìn)一步比較參與DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在DGC cluster 1和IGC cluster 3患者中具有相反的表達(dá)模式（圖4g）。因此，化療治療策略應(yīng)在考慮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期相的基礎(chǔ)上制定。作者提出DNA復(fù)制過程中參與的蛋白質(zhì)值得被視為DGC cluster 1的治療靶點(diǎn)（圖4g）。

比較DGC cluster 1和IGC cluster 3的磷酸蛋白組學(xué)揭示了亞型特異性激酶的激活，分別是CDK2和CDK1等（圖4h）。由于細(xì)胞增殖狀態(tài)和細(xì)胞周期相影響患者對(duì)化療的響應(yīng)，作者嘗試基于CDK1和CDK2的表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)GC患者的化療反應(yīng)。在GC隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)CDK1高表達(dá)和CDK2低表達(dá)水平的患者受益于輔助化療（圖4i），表明CDK1和CDK2水平可作為評(píng)估GC患者化療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

總的來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)亞型在DGC和IGC中展示了蛋白質(zhì)特征與預(yù)后之間的相反關(guān)聯(lián)，為臨床中患者分層和治療策略提供了指導(dǎo)。

圖4 胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)亞型及其與臨床結(jié)果的關(guān)系

5、TF活性譜及其臨床相關(guān)性

我們對(duì)DGC和IGC的425個(gè)和396個(gè)在大于50%的DGC和IGC患者中檢測(cè)到的TF進(jìn)行了TF活性分析，分別在每個(gè)數(shù)據(jù)集中確定了兩個(gè)亞型。對(duì)TF活性基礎(chǔ)亞型的進(jìn)一步分析顯示它們與患者的生存顯著相關(guān)，表明了聚類TF活性基礎(chǔ)亞型的預(yù)后力量（圖5a）。為了方便起見，TF活性基礎(chǔ)亞型被指定為DGC TF cluster 1（n = 40）、DGC TF cluster 2（n = 43）、IGC TF cluster 1（n = 42）和IGC TF cluster 2（n = 60）。對(duì)TF活性基礎(chǔ)亞型的臨床特征進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)與DGC TF cluster 1比較，DGC TF cluster 2包括更多具有淋巴血管浸潤(rùn)的患者以及更高概率發(fā)生在胃竇（圖5b）。IGC TF cluster 2包括比IGC TF cluster 1更少的I期GC患者。

隨后，作者確定了每個(gè)TF活性基礎(chǔ)亞型中的主控TFs（圖5c）。在IGC TF cluster 1中主導(dǎo)的是NFKB2；在IGC TF cluster 2中主導(dǎo)的是SMARCE1和TFAP4；在DGC TF cluster 1中主導(dǎo)的是MLX和SMARCC1；在DGC TF cluster 2中主導(dǎo)的是NFKB1、RELA和IRF2。總體而言，NFKB復(fù)合物被提名為IGC TF cluster 1和DGC TF cluster 2中的主控TFs；SWI/SNF復(fù)合物被提名為IGC TF cluster 2和DGC TF cluster 1中的主控TFs。值得注意的是，對(duì)于DGC患者，DGC TF cluster 1具有更好的預(yù)后，而DGC TF cluster 2具有更差的預(yù)后；對(duì)于IGC患者，IGC TF cluster 1具有更好的預(yù)后，而IGC TF cluster 2具有更差的預(yù)后。這些結(jié)果顯示了NFKB復(fù)合物和SWI/SNF復(fù)合物在DGC和IGC中的多樣的預(yù)后相關(guān)性。

TGs的通路富集分析表明，主控TFs在不同的聚類中調(diào)節(jié)不同的生物學(xué)功能（圖5d）。例如，在IGC TF cluster 1中，NFKB復(fù)合物參與了Rho蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血小板活化，而在DGC TF cluster 2中，它參與了免疫應(yīng)答、CAMs轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移。另一方面，SWI/SNF復(fù)合物參與了IGC TF cluster 2中的翻譯和細(xì)胞周期進(jìn)展，而在DGC TF cluster 1中參與了RNA剪接和DNA復(fù)制（圖5e–f）。

作者提出，為什么主控TFs在不同的亞型中可以調(diào)控不同的基因集。由于磷酸化是調(diào)控TF活性的基本機(jī)制，作者探討了磷酸化對(duì)主控TFs的影響，基于激酶-底物網(wǎng)絡(luò)。作者比較了這些TFs的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)在DGC TF cluster 2中，NFKB1的S907、S937、S939和S941的磷酸化水平增加，而在IGC TF cluster 2中，TFAP4的S124的磷酸化水平增加（圖5g）。隨后，通過相關(guān)性分析篩選可能負(fù)責(zé)這五個(gè)磷酸化位點(diǎn)的激酶。發(fā)現(xiàn)33個(gè)激酶與這五個(gè)磷酸化位點(diǎn)有顯著正相關(guān)（圖5h）。基于TF活性亞型的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)如圖5i所示。在DGC TF活性 cluster 2中，IKBKE的激酶活性與NFKB1的S941磷酸化位點(diǎn)呈正相關(guān)。這表明IKBKE激活了NFKB1，與先前的研究結(jié)果一致。在IGC中，ATM/ATR活性與TFAP4（磷酸化位于S124）顯著正相關(guān)，與細(xì)胞分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)相關(guān)。正如圖3g所示，ATM/ATR在IGC中的活性高于DGC。這些觀察結(jié)果表明ATM/ATR在通過激活TFAP4等不同下游TFs調(diào)控DGC和IGC發(fā)生中的細(xì)胞分裂可能發(fā)揮潛在作用。在這里，作者根據(jù)整合的多層次蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)（圖5i）闡明了TF復(fù)合物在病理過程中的作用，并呈現(xiàn)了DGC和IGC亞型中的激酶-TF-靶基因網(wǎng)絡(luò)。

圖5 基于TF活動(dòng)概況的DGC和IGC亞型

6、多水平蛋白質(zhì)組亞型的特征及其穩(wěn)健性

圖6a結(jié)果表明，基于TF活性的亞型、蛋白質(zhì)組學(xué)的亞型和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的亞型具有較高的分類一致性。此外，作者探討了TF活性亞型和蛋白質(zhì)亞型之間的關(guān)聯(lián)。發(fā)現(xiàn)DGC蛋白質(zhì)亞型cluster2的患者被分為兩個(gè)TF活性亞型（TF活性亞型cluster1中的18名患者和TF活性亞型cluster2中的10名患者（圖6b）。對(duì)于DGC蛋白質(zhì)亞型cluster 2，進(jìn)一步探討了兩個(gè)TF活性亞型之間的臨床和分子差異。正如預(yù)期的那樣，TF活性亞型cluster 2中的患者預(yù)后較差（圖6c），具有較高的NFKB1 TF活性和較低的SMARCC1 TF活性（圖6d）。進(jìn)一步對(duì)TF活性的預(yù)后分析顯示，NFKB1 TF活性與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，而SMARCC1 TF活性與預(yù)后呈正相關(guān)（圖6e）。根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)比較了NFKB1和SMARCC1的TGs的表達(dá)（圖6f，g）。發(fā)現(xiàn)SMARCC1的靶基因，涉及RNA剪接和DNA復(fù)制， 在TF活性亞型cluster 1中上調(diào)；NFKB1的靶基因，與免疫反應(yīng)有關(guān)，在TF活性亞型cluster 2中上調(diào)。總體而言，綜合亞型劃分的結(jié)果表明，蛋白質(zhì)亞型與TF活性分析相結(jié)合可用于預(yù)后預(yù)測(cè)和聯(lián)合治療策略的開發(fā)。

圖6 多水平蛋白質(zhì)組亞型的特征及其穩(wěn)健性

7、GC免疫浸潤(rùn)的表征

為更好地理解GC腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的概念，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了xCell分析，推斷了TME中多樣性細(xì)胞類型的相對(duì)豐度（Fig. 7）。基于推斷的細(xì)胞比例的共識(shí)聚類確定了以下三組具有不同免疫特征和基質(zhì)特征的腫瘤集群：免疫cluster 1（n?=?69），免疫cluster 2（n?=?65），免疫cluster 3（n?=?49；Fig. 7a, b）。作者發(fā)現(xiàn)免疫cluster 1具有較低的免疫和基質(zhì)評(píng)分，并且上皮細(xì)胞的比例較高。正如預(yù)期的那樣，ssGSEA分析表明在免疫cluster 1中上調(diào)了上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生和有絲分裂細(xì)胞周期相轉(zhuǎn)變的正調(diào)節(jié)。此外，上皮細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物，即EPCAM，KRT18，MUC1和CDH1，在免疫cluster 1中的表達(dá)高于其他cluster（Fig. 7a）。此外，巨噬細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物，即TLR2和ARG148，以及免疫治療靶點(diǎn)，即FCGR1A，CD276和CD2720，在免疫cluster 2中的表達(dá)高于其他cluster（Fig. 7a）。至于免疫cluster 3，比其他cluster更高的基質(zhì)評(píng)分，以及成纖維細(xì)胞，淋巴內(nèi)皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的比例較高。成纖維細(xì)胞增殖，ECM組裝和基于肌動(dòng)蛋白絲的運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)在免疫cluster 3中富集。內(nèi)皮細(xì)胞的經(jīng)典標(biāo)志物，即DCN，在免疫cluster 3中的表達(dá)高于其他cluster（Fig. 7a）。因此，免疫亞型被定義為上皮亞型（cluster 1，冷瘤），免疫亞型（cluster 2，熱瘤）和內(nèi)皮亞型（cluster 3，Fig. 7b）。

多變量Cox回歸分析顯示，免疫亞型（cluster 1–3）在調(diào)整其他臨床covariates后與預(yù)后相關(guān)（Fig. 7c, d）。有趣的是，在免疫cluster 3中，DGC和IGC患者表現(xiàn)出相反的預(yù)后趨勢(shì)。對(duì)于IGC患者，免疫cluster 3有著最好的預(yù)后，而對(duì)于DGC患者，免疫cluster 3有著最差的預(yù)后（紅線；Fig. 7c, d）。為解決這個(gè)問題，比較了在免疫cluster 3中DGC和IGC患者的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況。共同淋巴祖細(xì)胞、NK細(xì)胞和Th2細(xì)胞在IGC患者中的水平高于DGC患者，而CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞和Th1細(xì)胞在DGC患者中的水平高于IGC患者（Fig. 7e）。DGC患者在免疫cluster 3中具有較高的Th1/Th2比率（Fig. 7f）。值得注意的是，對(duì)于所有GC患者，Th1/Th2比率與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（Fig. 7g），表明Th1/Th2比率可以作為GC患者的預(yù)后指標(biāo)。

為驗(yàn)證Th1/Th2比率與免疫治療有效性之間的關(guān)系，收集一組接受抗PD1治療的GC患者，包括7例反應(yīng)迅速的病例（部分緩解，PR）和7例反應(yīng)不佳的病例（疾病穩(wěn)定/進(jìn)展，SD/PD）。收集了來(lái)自14名治療前的GC患者的甲醛固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤組織切片。總共測(cè)得了7705種蛋白質(zhì)，平均每個(gè)樣本鑒定了4575種蛋白質(zhì)。通過基于蛋白質(zhì)組學(xué)輪廓的xCell分析評(píng)估了這14個(gè)樣本中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。如圖7h所示，計(jì)算了14個(gè)樣本的Th1/Th2比率值。發(fā)現(xiàn)與非應(yīng)答組相比，應(yīng)答組的Th1/Th2比率顯著更高（Fig. 7i）。這一結(jié)果表明，Th1/Th2比率可能是預(yù)測(cè)GC患者免疫治療臨床結(jié)果的指標(biāo)（Fig. 7j）。因此，Th1/Th2比率與免疫治療有效性之間的關(guān)系在一個(gè)獨(dú)立的胃癌抗PD1治療患者群中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖7 GC免疫浸潤(rùn)的表征

實(shí)驗(yàn)方法

        臨床隊(duì)列的構(gòu)建，抗PD1患者組樣本采集，細(xì)胞系的來(lái)源，靶向外顯子組測(cè)序，蛋白質(zhì)提取和胰蛋白酶消化，磷酸化肽的富集，核蛋白的提取，TFRE pull-down，LC-MS/MS和數(shù)據(jù)處理，生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)

        Shi W, Wang Y, Xu C, Li Y, Ge S, Bai B, Zhang K, Wang Y, Zheng N, Wang J, Wang S, Ji G, Li J, Nie Y, Liang W, Wu X, Cui J, Wang Y, Chen L, Zhao Q, Shen L, He F, Qin J, Ding C. Multilevel proteomic analyses reveal molecular diversity between diffuse-type and intestinal-type gastric cancer. Nat Commun. 2023 Feb 14;14(1):835. doi: 10.1038/s41467-023-35797-6. PMID: 36788224; PMCID: PMC9929250.