附睪對(duì)于睪丸后精子的發(fā)育是至關(guān)重要的，這被稱為精子成熟。在這個(gè)過(guò)程中，通過(guò)蛋白質(zhì)和小的非編碼RNA（sncRNAs）的交換，附睪與精子之間有了交流從而獲得了受精能力。更重要的是，附睪上皮細(xì)胞分泌的附睪源外泌體將sncRNAs轉(zhuǎn)移到成熟的精子中。這些單鏈RNA可以調(diào)節(jié)代際遺傳，從而進(jìn)一步影響后代的健康。近年來(lái)，精子成熟過(guò)程中sncRNAs與精子功能調(diào)控的聯(lián)系和機(jī)制日益受到人們的關(guān)注。建立附睪特異性核糖核酸酶T2（RNaseT2）敲入（KI）小鼠模型，探討其在精子受精能力發(fā)育中的作用。對(duì)RNase T2 KI雄性的精子參數(shù)進(jìn)行了評(píng)估，并對(duì)其后代的代謝表型進(jìn)行了表征。Pandora測(cè)序技術(shù)對(duì)精子sncRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行了分析和測(cè)序，以確定附睪部RNase T2對(duì)精子sncRNAs表達(dá)水平的影響。此外，在體外和體內(nèi)都證實(shí)了RNase T2在附睪上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平與環(huán)境應(yīng)激的反應(yīng)。RNase T2的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠附睪頭部嚴(yán)重的生育能力低下，并與弱畸精子癥相關(guān)，并進(jìn)一步導(dǎo)致后代獲得性代謝紊亂，包括高血糖、高脂血癥和高胰島素血癥。Pandora測(cè)序顯示，與對(duì)照精子相比，RNase T2 KI精子中sncRNAs特別是rRNA衍生的小RNA（rsRNA）和tRNA衍生的小RNA（tsRNA）譜發(fā)生了改變。此外，環(huán)境壓力上調(diào)附睪頭中的RNase T2。

        本文于2023年11月發(fā)表在《BMC Medicine》雜志上，IF=9.3

主要技術(shù)路線：

1、在精子成熟過(guò)程中，附睪頭中的RNase T2可通過(guò)附睪小體（附睪衍生的外泌體）轉(zhuǎn)移至精子

        我們之前的研究報(bào)道了RNase T2在人和小鼠精子中的表達(dá)。在此，聚集的RNase T2位于精子的頂體后區(qū)域（圖1A），在成熟過(guò)程中，外泌體通過(guò)附睪時(shí)與精子融合。免疫印跡分析表明，RNase T2蛋白在頭精子首次進(jìn)入附睪部時(shí)存在于中等水平，而在尾部精子中表達(dá)較豐富（圖1B）。附睪成熟過(guò)程中精子中RNase T2水平的升高及其在精子中的定位特征表明，分泌的RNase T2在附睪轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中被轉(zhuǎn)運(yùn)到成熟的精子中。

        隨后，采用免疫印跡法和免疫熒光法研究RNase T2在小鼠睪丸和附睪中的表達(dá)規(guī)律。值得注意的是，據(jù)報(bào)道，核糖核酸酶T2在人類細(xì)胞和小鼠組織中以多種形式存在，即36 kDa條帶代表全長(zhǎng)、糖基化和分泌型，而27 kDa和31 kDa條帶是蛋白水解物。在此，對(duì)小鼠睪丸和附睪中RNaseT2的免疫印跡法分析表明，RNase T2在近40 kDa處有預(yù)期的條帶（圖1C），代表其糖基化的全長(zhǎng)形式。因此，我們的結(jié)果表明，RNase T2在附睪頭的表達(dá)尤其高于在睪丸或附睪尾的表達(dá)（圖1C）。同時(shí)，免疫熒光分析顯示，附睪頭RNaseT2主要分布在面對(duì)附睪上皮腔的主細(xì)胞的頂下區(qū)，這與附睪頭的分泌特征一致（圖1D）。

        由于RNase T2定位于頂體后區(qū)域（圖1A），附睪來(lái)源的外泌體在此處與精子融合，因此我們可以想知道外泌體是否介導(dǎo)RNase T2向精子的轉(zhuǎn)移。通過(guò)聚合物沉淀分離附睪液中的外泌體，并通過(guò)透射電子顯微鏡、納米顆粒跟蹤分析和蛋白質(zhì)印跡分析進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)納米顆粒追蹤分析檢測(cè)到的這些附睪來(lái)源的外泌體的直徑在50至150 nm范圍內(nèi)（圖1E），這與外泌體的定義一致。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察到的外泌體的超微結(jié)構(gòu)（圖1F）顯示出明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)直徑約為50至100 nm，這與納米顆粒跟蹤分析檢測(cè)到的一致。此外，蛋白質(zhì)印跡顯示，分離的外泌體富含外泌體標(biāo)記物TSG101和Flotillin 1，而它們不顯示鈣聯(lián)蛋白（一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白）（圖1G）。正如預(yù)期的那樣，RNase T2存在于這些分離的附睪來(lái)源的外泌體中（圖1G）。此外，RNase T2和外泌體富集的脂筏蛋白Caveolin 1的免疫熒光染色表明，這兩種蛋白從頭精子到尾精子的聚集顯著更多，并且它們特別共定位于尾精子的頂體后區(qū)域（圖1H）。RNase T2和Caveolin 1的共定位表明RNase T2可能通過(guò)外泌體遞送過(guò)程轉(zhuǎn)運(yùn)到成熟的精子。

        還研究了RNA-SET2與人精漿中外泌體之間的關(guān)聯(lián)。蛋白質(zhì)印跡和透射電子顯微鏡證實(shí)外泌體源自人精漿。此外，RNA-SET2的蛋白質(zhì)印跡分析顯示其存在于精液樣本的不同部分中，即精子、精漿和從精漿中分離的外泌體。同時(shí)，膠體金標(biāo)記和免疫電鏡分析表明，RNA-SET2標(biāo)記的免疫金顆粒主要局限于外泌體樣囊泡，這些囊泡往往在精子的頂體后和中段區(qū)域與精子融合。免疫熒光分析顯示，RNA-SET2與Caveolin 1在人精子中共定位，這與小鼠精子中的一致。綜上所述，人類精子中的RNA-SET2可能是通過(guò)精子-外泌體相互作用從精漿衍生而來(lái)。

        綜上所述，這些結(jié)果表明RNase T2在附睪頭高度表達(dá)，并至少部分以外泌體依賴性方式分泌到附睪液中。因此，它在附睪運(yùn)輸過(guò)程中被轉(zhuǎn)運(yùn)到成熟的精子中（圖1I）。

圖1 附睪頭中的RNase T2可以通過(guò)釋放外泌體到精漿中轉(zhuǎn)移到精子中

2、附睪頭RNase T2的條件敲入（KI）

        為了確定附睪頭RNase T2對(duì)精子成熟的影響，構(gòu)建了基于Rosa26-Cre的基因敲入小鼠模型。Rosa26-pCAG-STOP-RNase T2小鼠與附睪頭的主細(xì)胞特異性Cre小鼠系（Lcn5-Cre）雜交。因此，在Rosa26-RNaseT2條件性敲入（KI）小鼠（rosa26-RNASET2loxP/loxP；Lcn5Cre+）中，Cre介導(dǎo)的條件性NeoSTOP片段的去除導(dǎo)致CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的RNase T2在附睪頭的主細(xì)胞中表達(dá)。免疫印跡和免疫熒光分析均證實(shí)RNase T2在KI小鼠附睪頭和成熟精子中的表達(dá)顯著增加，證實(shí)了RNase T2在這些KI小鼠中過(guò)表達(dá)。值得注意的是，免疫熒光分析表明，在RNaseT2 KI精子中，RNase T2主要聚集在精子頭部的頂體后區(qū)域。RNase T2 KI雄性小鼠健康，發(fā)育正常。組織學(xué)分析也表明，與野生型（WT）小鼠相比，這些小鼠的睪丸和附睪體沒(méi)有明顯的缺陷。然而，對(duì)照組（Rosa26-RNASET2loxP/loxP，Cre陰性）小鼠和RNaseT2 KI小鼠的血清睪酮、抗精子抗體和附睪炎性細(xì)胞因子的濃度沒(méi)有顯著差異。提示該RNaseT2 KI小鼠模型適用于附睪頭的RNaseT2功能的研究。

3、RNaseT2 KI小鼠雄性不育率和精子質(zhì)量下降

        為了評(píng)估RNase T2 KI小鼠的繁殖力，每只雄性小鼠與兩只性成熟雌性小鼠交配1周，然后比較妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)與WT和對(duì)照組小鼠的受孕率和產(chǎn)仔數(shù)。正如預(yù)期的那樣，RNase T2 KI 雄性性行為活躍，并在雌性伴侶中產(chǎn)生陰道塞。在21天的懷孕期內(nèi)，18只雌性與RNase T2 KI雄性交配，平均只有4只雌性懷孕并產(chǎn)下近3只幼崽（圖2A）。與RNase T2 KI 雄性交配的雌性的妊娠率（4/18）和產(chǎn)仔數(shù)（2.67 ± 0.58, n=4, P < 0.05）均顯著低于與WT雄性交配的雌性（妊娠率, 18/ 18；產(chǎn)仔數(shù)，8.61 ± 0.92，n=18）和對(duì)照雄性（懷孕率，17/18；產(chǎn)仔數(shù)，7.94 ± 1.98，n=17）（圖2A）。因此，如此極低的妊娠率和產(chǎn)仔數(shù)清楚地表明，RNase T2 KI 雄性被認(rèn)為反映了嚴(yán)重的生育能力低下。

        計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）和形態(tài)學(xué)分析評(píng)估了附睪尾成熟精子的精子參數(shù)。結(jié)果表明，WT雄性、對(duì)照雄性和RNase T2 KI雄性之間精子濃度沒(méi)有顯著差異。然而，盡管RNase T2 KI小鼠的精子活力和前向運(yùn)動(dòng)在獲能30分鐘和60分鐘期間稍大，但RNase T2 KI雄性小鼠的活動(dòng)精子和前向活動(dòng)精子的百分比明顯低于WT和對(duì)照雄性（圖2B，C）。這種活力的增加表明，RNase T2 KI精子對(duì)獲能有反應(yīng)，但仍處于相對(duì)較低的水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足受精的要求。

        此外，質(zhì)膜流動(dòng)性、細(xì)胞內(nèi)鈣水平和線粒體活性被用來(lái)評(píng)估精子獲能能力。用流式細(xì)胞術(shù)分析，WT精子和RNase T2 KI精子都有很高比例的部花青540（MC540）熒光信號(hào)。同時(shí)，熒光強(qiáng)度測(cè)定WT精子和RNase T2 KI精子細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平和線粒體膜電位高氯酸四甲基羅丹明甲酯（TMRM）染色的結(jié)果無(wú)顯著差異。另一方面，鈣離子載體A23187誘導(dǎo)的RNase T2 KI精子頂體反應(yīng)的發(fā)生率也與WT和對(duì)照精子相同。這些結(jié)果表明，RNase T2 KI精子的獲能和頂體反應(yīng)與WT精子相同。

        值得注意的是，通過(guò)瑞氏-吉姆薩染色（圖2E）進(jìn)行評(píng)估發(fā)現(xiàn)，RNase T2 KI精子的精子頭部畸形率（79.06±8.42%，n=20）顯著高于WT精子（8.17±0.98%，n=16）和Rosa26/Cre-精子（6.86±1.74%，n=17）（圖2D）。同時(shí)，電子顯微鏡分析顯示，RNase T2 KI精子的精子頭部有膨脹的細(xì)胞質(zhì)（圖2F），因此細(xì)胞質(zhì)膜、頂體和細(xì)胞核彼此不貼合。RNase T2 KI精子中精子頭部的這種嚴(yán)重畸形形態(tài)被稱為畸形精子癥。這種情況可能是精子活力差和男性生育能力低下的原因。另一方面，TEM圖像表明，與對(duì)照小鼠相比，RNase T2 KI附睪頭的精子表現(xiàn)出正常的形態(tài)。這種差異表明，RNase T2 過(guò)度表達(dá)可能會(huì)導(dǎo)致附睪成熟過(guò)程中的精子畸形。

        此外，輔助生殖技術(shù)表明體內(nèi)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）可以幫助RNase T2 KI精子受孕，而體外受精（IVF）則無(wú)效（圖2G）。這種差異表明，RNase T2 KI精子可以使卵母細(xì)胞受精，但由于運(yùn)動(dòng)能力差而無(wú)法到達(dá)卵母細(xì)胞。

圖2 RNase T2 KI 小鼠的雄性生育能力和精子質(zhì)量較差

4、精子中的人類RNASET2與精子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)

        我們前期的研究表明，精液中RNase T2的表達(dá)與精子活力呈負(fù)相關(guān)。這種反比關(guān)系被認(rèn)為是人類弱精子癥的一個(gè)指標(biāo)。在此，我們進(jìn)一步表征了RNASET2與精子畸形之間的潛在相關(guān)性。每組的供體人群為63名健康男性和44名弱畸精子癥男性。免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀分析鑒定了人類精子中的RNASET2含量。熒光分析顯示，與健康捐獻(xiàn)者相比，弱精子癥個(gè)體（n = 44）的精子被標(biāo)記有更高的熒光強(qiáng)度（n=63，P<0.01）。

        同時(shí)，進(jìn)一步分析了不同精子群體中RNASET2的含量。每個(gè)精液樣本中的兩個(gè)精子群用Percoll梯度分離，即質(zhì)量好的成熟精子用90% Percoll分離，質(zhì)量差的未成熟精子用45% Percoll分離。免疫熒光分析顯示，與90% Percoll分離的質(zhì)量良好的精子相比，45% Percoll分離的質(zhì)量較差的精子被更高的RNASET2熒光強(qiáng)度標(biāo)記（n=16，P<0.01）。此外，免疫熒光分析還顯示RNASET2強(qiáng)烈聚集在頭部變形精子的頂體后區(qū)域，即小頭（HS）、小錐形頭（HST）、小無(wú)定形頭（HSA）、小空泡頭（HSV）、大頭（HL）、大圓頭（HLR）、大梨形頭（HLP）、大不定形頭（HLA）。

        此外，ELISA檢測(cè)精漿中RNASET2含量也顯示，與健康精液標(biāo)本（17.07±4.48 μg/mL，n=44，P<0.05）相比，弱畸精子癥個(gè)體精漿中RNASET2表達(dá)量（24.43±4.39 μg/ mL，n=63）顯著升高。

        總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明，附睪頭中RNase T2的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致精子頭部形態(tài)更加嚴(yán)重的畸形，這可能進(jìn)一步損害精子的活力和受精能力。

5、RNase T2 KI小鼠將父系獲得性代謝紊亂遺傳給F1后代

        據(jù)報(bào)道，環(huán)境壓力導(dǎo)致代際代謝異常。為了證實(shí)RNase T2誘導(dǎo)的弱畸精子癥是否也介導(dǎo)代際遺傳，將RNase T2 KI小鼠與WT雌性小鼠交配以產(chǎn)生第一代子代（F1）（圖3A）。然后，分析了RNase T2 KI小鼠（RNase T2 KI-F1）和對(duì)照小鼠（Control-F1）后代的代謝表型。結(jié)果表明，RNase T2 KI-F1小鼠，無(wú)論是6周齡的雄性還是雌性，都比年齡匹配的對(duì)照F1小鼠顯著重（圖3B，C），同時(shí)，20周齡的RNase T2 KI-F1小鼠的血糖水平也顯著升高（圖3D，E）。由于雄性F1在體重和血糖水平上表現(xiàn)出更顯著的變化，因此選擇雄性后代進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

        隨后，為了更廣泛地研究后代的代謝表型變異，20周齡的雄性F1后代被用于以下實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，RNase T2 KI-F1小鼠血清胰島素和C-肽水平顯著升高，而胰高血糖素水平顯著下降（圖3F-H）。難以降解的胰島素原C肽片段是準(zhǔn)確劃分胰島細(xì)胞功能的指標(biāo)。我們的結(jié)果表明，RNase T2 KI-F1小鼠的葡萄糖代謝和高血糖受到破壞。此外，葡萄糖耐量試驗(yàn)（GTT）結(jié)果顯示，RNase T2 KI-F1小鼠的血糖和胰島素水平較高（圖3I，J）。這些上升表明，與年齡匹配的對(duì)照F1小鼠相比，RNase T2 KI-F1小鼠的葡萄糖耐量受損。RNase T2 KI-F1小鼠的這種葡萄糖代謝紊亂的出現(xiàn)肯定源于RNase T2 KI小鼠的精子中的父系因素。然而，胰島素耐量試驗(yàn)（ITT）結(jié)果在RNase T2 KI-F1小鼠和對(duì)照F1小鼠之間沒(méi)有顯著差異（圖3K）。這一相似性與以前研究報(bào)告的一致。

        糖平衡失調(diào)和脂代謝失調(diào)總是同時(shí)發(fā)生的。例如，胰島素抵抗會(huì)導(dǎo)致血脂異常。因此，對(duì)RNase T2 KI-F1小鼠和對(duì)照F1小鼠的血脂水平進(jìn)行了比較分析。在RNase T2 KI-F1小鼠中，它們的高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（T-CHO）、非酯化脂肪酸（NEFA）和甘油三酯（TG）水平上升。這些增加表明RNase T2 KI-F1小鼠出現(xiàn)了脂代謝紊亂和高脂血癥（圖3L-P）。由于瘦素和脂聯(lián)素的水平反映了脂肪細(xì)胞的功能，我們還發(fā)現(xiàn)它們的血清水平在RNase T2 KI-F1小鼠中顯著升高（圖3Q，R）。幾項(xiàng)研究證明，當(dāng)身體脂肪百分比增加時(shí)，血清瘦素水平的升高會(huì)抑制進(jìn)食并加速新陳代謝，而分泌的脂聯(lián)素的增加也會(huì)改善胰島素抵抗。因此，這些結(jié)果與我們的發(fā)現(xiàn)是一致的，即RNase T2 KI-F1小鼠的體重比對(duì)照F1小鼠的體重要重。

        綜上所述，我們的數(shù)據(jù)有力地證明了附睪頭中的RNase T2在誘發(fā)子代遺傳性代謝紊亂方面發(fā)揮了重要作用。

圖3 RNase T2 KI 的 F1 發(fā)生糖脂代謝紊亂

6、RNase T2 KI誘導(dǎo)F1后代肝臟mRNA表達(dá)模式的變化

        為了進(jìn)一步探討KI小鼠肝臟RNase T2功能的生物學(xué)影響，我們進(jìn)行了RNA測(cè)序（RNA-seq）并比較了10周齡和20周齡RNase T2 KI小鼠和對(duì)照小鼠的肝臟基因表達(dá)譜（圖4A-E）。結(jié)果顯示，與對(duì)照F1小鼠相比，10周齡小鼠的肝臟中RNase T2 KI-F1小鼠的肝臟中有10個(gè)基因上調(diào)，而25個(gè)基因下調(diào)。然而，與對(duì)照組相比，20周齡時(shí)有57個(gè)基因上調(diào)，83個(gè)基因下調(diào)。基因本體（GO）功能分析證明的差異表達(dá)基因（DEG）在20周時(shí)在RNase T2 KI-F1和對(duì)照-F1之間的脂質(zhì)代謝過(guò)程中富集（圖4F）。此外，還測(cè)定了兩組20周齡小鼠之間一些與葡萄糖和脂質(zhì)代謝相關(guān)的DEGs的表達(dá)水平。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1（IGFbp1）、胰島素受體底物2（Irs2）、Perilipin-4（Plin4）、血管生成素樣4（ANGPTL4）、鋅指和含16個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域（Zbtb16）的表達(dá)通過(guò)RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí)（圖4G）。由于Igfbp1和Irs2與胰島素分泌和胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，本研究的RT-qPCR結(jié)果證實(shí)RNase T2 KI-F1小鼠的Igfbp1和Irs2水平顯著降低。相反，有助于脂滴形成和功能的Plin4水平反而顯著增加（圖4G），表明RNase T2 KI-F1小鼠中脂滴水平顯著上調(diào)。

        此外，數(shù)據(jù)的火山圖顯示了RNase T2 KI-F1發(fā)育過(guò)程中肝臟mRNA表達(dá)的差異（圖4C）。10周齡的RNase T2 KI-F1和20周齡的RNase T2 KI-F1之間存在大量DEG。這些DEG還在20周時(shí)的RNase T2 KI-F1和對(duì)照-F1之間的DEG中鑒定出，例如Angptl4和Plin4。對(duì)10周齡RNase T2 KI-F1和20周齡RNase T2 KI-F1之間的DEG進(jìn)行GO分析，揭示了它們參與葡萄糖和脂質(zhì)代謝，特別是參與B型胰腺細(xì)胞發(fā)育、糖原生物合成的調(diào)節(jié)過(guò)程，以及類固醇代謝過(guò)程和膽固醇代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)（圖4H）。

        總而言之，這些結(jié)果證實(shí)，頭附睪中的RNase T2 KI表達(dá)可能會(huì)誘發(fā)后代的代謝紊亂，并且這種紊亂隨著年齡的增長(zhǎng)而變得越來(lái)越明顯。這種關(guān)聯(lián)表明附睪RNase T2參與介導(dǎo)代際遺傳。

圖4 RNase T2 KI誘導(dǎo)F1后代肝臟mRNA表達(dá)變化

7、RNase T2 KI精子中sncRNA的表達(dá)水平發(fā)生變化

        我們更多地思考了RNase T2 KI-F1小鼠附睪頭中RNase T2的表達(dá)如何促進(jìn)代謝紊亂的遺傳。為了解決這個(gè)問(wèn)題，對(duì)從RNase T2 KI小鼠和對(duì)照小鼠中分離的精子進(jìn)行了小RNA測(cè)序分析（圖5A）。小RNA-Seq結(jié)果顯示，兩組總檢測(cè)到的rRNA衍生小RNA（RsRNAs）的11.8%和總檢測(cè)到的tsRNAs的15.3%發(fā)生了顯著變化（5B、C）。同時(shí)，microRNAs（MiRNAs）和piRNAs的豐度變化分別只有5.98%和不到0.02%（圖5D，E）。此外，在改變的1884個(gè)tsRNA中，有973個(gè)在RNase T2 KI小鼠的精子中上調(diào)，910個(gè)在精子中下調(diào)。

        RNase T2是一種核糖核酸酶，參與單鏈RNA的生成，如tsRNAs和rsRNAs。tsRNAs最近被發(fā)現(xiàn)是表觀遺傳信息的代際載體。據(jù)報(bào)道，tsRNAs由幾種核糖核酸酶處理，包括Dicer、ANG和RNase T2。在本研究中，我們使用RT-qPCR和免疫印跡法檢測(cè)了這三種核糖核酸酶在附睪頭中的表達(dá)水平（圖5F，G）。結(jié)果表明，RNase T2在該組織中的表達(dá)顯著高于Dicer和ANG（圖5F，G）。因此，在RNase T2和KI精子中，sncRNAs的表達(dá)水平發(fā)生了變化，RNase T2可能是調(diào)節(jié)精子中sncRNAs水平的主要核糖核酸酶。

圖5 RNase T2 KI精子中sncRNA表達(dá)水平的變化

8、應(yīng)激條件上調(diào)附睪上皮細(xì)胞RNase T2的表達(dá)

        多項(xiàng)研究表明炎癥或氧化應(yīng)激可以激活并誘導(dǎo)RNase T2核糖核酸酶活性。在這里，我們研究了體外和體內(nèi)環(huán)境應(yīng)激對(duì)附睪RNase T2表達(dá)的影響。一方面，對(duì)來(lái)自附睪頭的原代附睪上皮細(xì)胞（EEC）進(jìn)行了原代培養(yǎng)（圖6A）并鑒定。免疫熒光分析顯示EEC中的RNase T2與外泌體標(biāo)記物Flotillin 1共定位（圖6B）。這種關(guān)聯(lián)表明外泌體可以介導(dǎo)RNase T2分泌。同時(shí)，蛋白免疫印跡分析證實(shí)從EEC培養(yǎng)基中分離的外泌體中存在RNase T2。此外，在炎癥誘導(dǎo)劑脂多糖（LPS）和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑H2O2存在的情況下，EEC（圖6C）和外泌體（圖6D）中的RNase T2表達(dá)顯著增加。另一方面，LPS處理上調(diào)了附睪頭中RNase T2的表達(dá)（圖6E、F）。此外，在炎癥小鼠中，附睪來(lái)源的外泌體中其含量也有所增加（圖6G）。

圖6 應(yīng)激條件會(huì)誘導(dǎo)附睪上皮細(xì)胞中RNase T2的上調(diào)

        因此，這些結(jié)果表明，暴露于環(huán)境應(yīng)激可以增加附睪上皮細(xì)胞和外泌體中附睪RNase T2的表達(dá)。

        附睪RNase T2在誘導(dǎo)精子成熟和代際遺傳中的重要性得到了證明。附睪頭中過(guò)度表達(dá)的RNase T2會(huì)導(dǎo)致后代的弱畸精子癥和代謝紊亂。

實(shí)驗(yàn)方法：

        小RNA測(cè)序，肝臟轉(zhuǎn)錄組分析，蛋白質(zhì)印跡分析，免疫熒光分析，外泌體提取及鑒定，透射電子顯微鏡分析，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，線粒體膜電位測(cè)定，RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR分析，細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及處理，流式細(xì)胞術(shù)，小鼠模型，組織學(xué)分析，生育能力評(píng)估，精子參數(shù)分析，體內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)，體內(nèi)胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)，代謝指標(biāo)分析

參考文獻(xiàn)：

        Ma Z, Li J, Fu L, Fu R, Tang N, Quan Y, et al. Epididymal RNase T2 contributes to astheno-teratozoospermia and intergenerational metabolic disorder through epididymosome-sperm interaction. BMC Med. 2023;21(1):453. Epub 2023/11/23. doi: 10.1186/s12916-023-03158-1. PubMed PMID: 37993934; PubMed Central PMCID: PMCPMC10664275.