編碼α-突觸核蛋白（αSyn）的基因SNCA突變可導(dǎo)致家族性帕金森病（PD），而αSyn異常是特發(fā)性帕金森病的關(guān)鍵病理標(biāo)志。α-突觸核蛋白病變可導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)變性。PARKIN和PINK1在常染色體隱性PD中突變，通過誘導(dǎo)線粒體蛋白泛素化來調(diào)節(jié)功能失調(diào)線粒體的優(yōu)先自噬清除（“線粒體自噬”），這一過程通過USP30被去泛素化抵消。本研究表明，USP30基因敲除小鼠的USP30缺失可以保護(hù)行為缺陷，并導(dǎo)致有絲分裂增加，磷酸化-s129 αSyn減少，αSyn誘導(dǎo)的SN多巴胺能神經(jīng)元損失減弱。這些觀察結(jié)果用一種有效的、選擇性的、腦滲透的USP30抑制劑MTX115325進(jìn)行了概括，該抑制劑具有良好的藥物樣特性。這些數(shù)據(jù)有力地支持了USP30抑制作為PD潛在的疾病改善療法的進(jìn)一步研究。

        USP30被提出調(diào)節(jié)線粒體自噬，這是帕金森病的一個(gè)相關(guān)機(jī)制。在這里，作者表明USP30基因敲除小鼠和USP30抑制劑如MTX115325在帕金森病的αSyn小鼠模型中表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)反應(yīng)。該文章與2023年11月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. USP30KO小鼠存活，無明顯病理

        為了在小鼠中產(chǎn)生USP30 KO，作者將USP30必需外顯子4與loxP位點(diǎn)（條件準(zhǔn)備等位基因）連接，然后使用CRE重組酶（構(gòu)成等位基因）將其刪除，以產(chǎn)生USP30 KO小鼠（圖1a）。在腦、腎、心臟、骨骼肌、脾臟、肝臟、胰腺和睪丸中缺失USP30 mRNA證實(shí)了USP30基因的成功缺失（圖1b）。此外，USP30 KO小鼠的皮質(zhì)中未檢測到USP30蛋白（圖1c）。正如先前報(bào)道的那樣，USP30 KO小鼠以預(yù)期的孟德爾頻率出生（圖1d）。為了了解USP30的丟失是否會(huì)導(dǎo)致隨年齡增長的病理，作者建立了一個(gè)衰老隊(duì)列，并表明與野生型（WT）同儕對照相比，USP30的丟失沒有可檢測到的有害影響（圖1e）。綜合來看，這些數(shù)據(jù)顯示USP30缺失對小鼠沒有不利影響。

        為了驗(yàn)證USP30缺失會(huì)影響多巴胺能神經(jīng)元線粒體自噬的假設(shè)，作者將USP30 KO小鼠與mito-QC報(bào)告小鼠雜交，后者具有GFP-mCherry串聯(lián)融合到源自蛋白FIS146的線粒體定位信號。這使得在體內(nèi)測量有絲分裂成為可能，因?yàn)樵谟薪z分裂過程中，GFP信號在溶酶體的酸性環(huán)境中被淬滅。因此，沒有綠色GFP信號的紅色mCherry斑點(diǎn)反映了線粒體在有絲分裂降解過程中與溶酶體融合（圖1f）。為了了解USP30缺失是否會(huì)影響線粒體清除，作者在16周齡時(shí)量化了mitto - qc / USP30 KO小鼠多巴胺能神經(jīng)元中的線粒體自噬信號，并與mitto - qc WT幼崽進(jìn)行了比較。在這種情況下，在單個(gè)SN多巴胺能神經(jīng)元（圖1g），作者量化了與溶酶體標(biāo)記（LAMP1，綠色；圖1f中左面板）代表有絲分裂體與溶酶體融合。作者發(fā)現(xiàn)，與WT小鼠相比，USP30 KO小鼠多巴胺能神經(jīng)元中的mCherry斑點(diǎn)顯著特異性增加（圖1 h）綜上所述，作者的結(jié)果表明，虧損USP30老鼠增加基底的mitophagy SNpc DA神經(jīng)元，大腦皮層神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元，而不是肌肉。

圖1 Usp30 KO小鼠的產(chǎn)生與表征

2. USP30 KO可減輕AAV-A53T-SNCA小鼠模型中的多巴胺能神經(jīng)元損失

        為了驗(yàn)證USP30 KO小鼠DA神經(jīng)元的自噬增強(qiáng)是否與DA神經(jīng)元免受αSyn毒性的保護(hù)有關(guān)，作者使用了經(jīng)過驗(yàn)證的AAV1/2-A53T-SNCA αSyn過表達(dá)PD小鼠模型，該模型在大鼠、小鼠和非人靈長類動(dòng)物模型中顯示多巴胺能神經(jīng)變性和運(yùn)動(dòng)障礙。首先，為了確定αSyn的誘導(dǎo)是否影響線粒體自噬，作者測量了同側(cè)（注射AAV-A53T-SNCA）SNpc內(nèi)的線粒體自噬情況，并與對側(cè)（未注射；NI），分娩后28周。USP30 KO小鼠對側(cè)和同側(cè)SNpc DA神經(jīng)元的線粒體自噬點(diǎn)均顯著增加。為了確定USP30缺失是否能保護(hù)USP30 KO小鼠免受αSyn誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元缺失，作者在注射后28周對同側(cè)（注射AAV-A53T-SNCA）SNpc內(nèi)與對側(cè)（NI）部位進(jìn)行了TH+神經(jīng)元計(jì)數(shù)（圖2a）。上述結(jié)果表明，USP30缺失可顯著減輕αSyn過表達(dá)引起的DA神經(jīng)元缺失（圖2b）與WT對照組相比（圖2b）或mito-QC小鼠（圖2 b）。因此，USP30缺失可防止αSyn誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元損失。

圖2 在α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的PD小鼠模型中，Usp30 KO可改善DN神經(jīng)元的存活，降低病理性αSyn，并防止運(yùn)動(dòng)缺陷

3. USP30 KO抑制αSyn病理和相關(guān)運(yùn)動(dòng)缺陷的發(fā)展

        為了確定注射AAV-A53T-SNCA的USP30 KO小鼠的線粒體自噬上調(diào)是否與αSyn病理降低有關(guān)，作者用抗磷S129-αSyn對SNpc進(jìn)行了免疫染色，這是一種在Lewy小體中發(fā)現(xiàn)的αSyn的病理形式。相比之下，注射AAV-A53T-SNCA的WT小鼠同側(cè)SNpc有較強(qiáng)的磷酸化-s129-αSyn熒光免疫染色（圖2c，d）與注射AAV-Ev小鼠相比，mito-QC AAV-A53T-SNCA小鼠（圖2c，d）。值得注意的是，注射AAV-A53T-SNCA的小鼠多巴胺能神經(jīng)元中磷酸化- s129 αSyn的強(qiáng)度在mito-QC/USP30 KO小鼠中顯著降低（圖2c， d）。

4. USP30 KO對α syn誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷有保護(hù)作用

        為了評估注射AAV-A53T-SNCA后28周多巴胺能神經(jīng)元的損失是否與運(yùn)動(dòng)缺陷有關(guān)，并評估USP30 KO對運(yùn)動(dòng)功能的影響，作者在圓柱試驗(yàn)中測量了前肢的不對稱使用，這對不對稱多巴胺缺陷很敏感。單側(cè)注射AAV-Ev不影響所有三個(gè)實(shí)驗(yàn)組（WT、mito-QC和mito-QC/USP30 KO）的雌雄小鼠的運(yùn)動(dòng)功能；圖2f），從而排除了來自病毒或立體定向注射劑本身的任何非特異性作用。相反，在WT和mito-QC小鼠中單側(cè)注射AAV-A53T-SNCA誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)功能障礙，表現(xiàn)為注射對側(cè)前肢較少使用（與使用同側(cè)前肢相比）（圖2e）。值得注意的是，USP30 KO對雌性和雄性mitto - qc /USP30 KO小鼠α syn誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷均有顯著保護(hù)作用（圖2e）。這些結(jié)果表明，USP30 KO可以緩解α syn誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)缺陷。

圖3 在α-突觸核蛋白為基礎(chǔ)的小鼠模型中，Usp30 KO可防止紋狀體TH+多巴胺能纖維的丟失，并保留多巴胺及其代謝物

5. USP30 KO可防止α syn誘導(dǎo)的紋狀體多巴胺和TH+終端的丟失

        為了測試USP30 KO對α syn誘導(dǎo)的DA神經(jīng)突向紋狀體的損失的影響，作者測量了腦切片紋狀體中TH+終端的密度（圖3a）。兩種WT小鼠TH+纖維的相對光密度均顯著降低（圖3b）和mito-QC小鼠，但在USP30 KO小鼠注射AAV-A53T-SNCA后沒有顯著變化（圖3b）。

        通過TH染色，作者還觀察到紋狀體和SNpc的TH強(qiáng)度與WT和USP30 KO不同，即使在未注射側(cè)也是如此。為了理解其中的原因，作者量化了注射AAV-A53T-SNCA或在同側(cè)注射aav -空載體（Ev）的小鼠TH光密度與NI對側(cè)的關(guān)系。這些數(shù)據(jù)表明，在注射AAV-A53T-SNCA的小鼠中，TH染色強(qiáng)度不僅在同側(cè)受到影響，而且在對側(cè)也受到影響（圖3a，b）。在大鼠PD模型中，單側(cè)注射AAV載體在SN中過表達(dá)αSyn后，雙側(cè)紋狀體TH+末端受到影響。因此，USP30 KO小鼠的TH染色可能不會(huì)直接升高，相反，USP30 KO可以防止發(fā)生在同側(cè)和對側(cè)的異步誘導(dǎo)的TH損失。這一觀察結(jié)果并沒有改變作者的整體數(shù)據(jù)解釋，因?yàn)樵谧髡叩姆治鲋校髡弑容^了小鼠內(nèi)效應(yīng)（同側(cè)與對側(cè)）。

        作者進(jìn)一步分析了雌性和雄性小鼠同側(cè)紋狀體中多巴胺及其代謝產(chǎn)物的分子水平。在注射AAV-Ev的小鼠中，多巴胺及其代謝物，包括3，4-二羥基苯基乙酸（DOPAC）、3-甲氧基酪胺（3- mt）和同型香草酸（HVA）的水平在不同基因型中是相似的（圖3 c-f）。注射AAV-A53T-SNCA引起WT和mito-QC小鼠多巴胺消耗（圖3c），但在USP30 KO小鼠中沒有（圖3c）。此外，USP30 KO可以阻止多巴胺代謝物HVA （圖3e）和3-MT （圖3f）的下降，而DOPAC的下降趨勢不顯著（圖3d）。這些結(jié)果表明，USP30 KO在以αSyn為基礎(chǔ)的PD小鼠模型中可保護(hù)TH+紋狀體終末的喪失和紋狀體多巴胺的喪失。

6. 腦滲透USP30抑制劑MTX115325的驗(yàn)證

        MTX115325是Mission Therapeutics公司開發(fā)的USP30抑制劑（USP30i），具有良好的口服生物利用度和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）穿透性（圖4）。MTX115325（圖4a）在生化熒光偏振分析中抑制USP30，IC50為12 nM，并在細(xì)胞中阻斷泛素樣探針進(jìn)入酶活性位點(diǎn)，IC50為25 nM。在過表達(dá)PARKIN并受到線粒體毒素antiycin a和oligomycin a（A/O）攻擊的人HeLa細(xì)胞系中，MTX115325增加了線粒體外膜蛋白TOM20（USP30底物）的泛素化，具有代表性的TOM20-UB濃度響應(yīng)曲線如圖4b所示。為了進(jìn)一步研究MTX115325在體外對人多巴胺能神經(jīng)元的藥理作用，作者檢測了IPSC衍生的多巴胺能神經(jīng)元在10 nM、100 nM或1μM無任何外源刺激的情況下，在不存在或存在MTX115325的情況下，TOM20和TOM20泛素化的差異。為了評估對DUB和其他半胱氨酸蛋白酶的選擇性，USP30i MTX115325在生化試驗(yàn)中對54種DUB和5種組織蛋白酶進(jìn)行了篩選。作者證實(shí)，USP30i MTX115325抑制小鼠USP30的IC50為13 nM，顯示出人和小鼠酶之間的等效效力。USP30i MTX115325在單次10 mg/kg劑量后的全血和前額皮質(zhì)透析液中的時(shí)間濃度曲線，顯示了兩種組織曲線的緊密關(guān)系（圖4c），以及前額皮質(zhì)游離CMax為528 nM（在60分鐘時(shí)間點(diǎn)）。小鼠探索性毒理學(xué)研究表明，MTX115325耐受性良好，在劑量水平高達(dá)300 mg/kg/天的兩周后，無不良臨床觀察或病理發(fā)現(xiàn)。在穩(wěn)定表達(dá)mito-QC的SH-SY5Y細(xì)胞中，MTX115325與ETC復(fù)合物III和V的亞最大抑制（0.1 mM a /O）聯(lián)合孵育72小時(shí)，產(chǎn)生了濃度依賴性的線粒體自噬增加（圖4e）。MTX115325在37 nM時(shí)使線粒體自噬增加22%，在1μM時(shí)與基線相比最大增加54%（圖4f）。這些數(shù)據(jù)表明，MTX115325對USP30的抑制具有高度選擇性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透性和良好的耐受性，并且MTX115325在體外驅(qū)動(dòng)成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系和IPSC來源的神經(jīng)元的線粒體質(zhì)量控制過程中，在存在和不存在外源刺激的情況下具有濃度依賴效應(yīng)。

7. 在AAV-A53T-SNCA小鼠模型中，USP30抑制劑MTX115325可防止多巴胺能神經(jīng)元丟失并保留紋狀體多巴胺

        為了測試USP30催化活性的抑制是否能再現(xiàn)USP30 KO小鼠對黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的保護(hù)作用，作者在與USP30 KO研究密切相關(guān)的AAV-A53T-SNCA PD小鼠模型中測試了USP30i MTX115325 （WO 2021/249909 A1）。小鼠單側(cè)立體定向注射編碼AAV-A53T-SNCA的AAV1/2，未對側(cè)注射（NI）后，每天兩次口服15 mg/kg或50 mg/kg MTX115325，治療10周后，取同側(cè)和對側(cè)紋狀體測定多巴胺和代代物，取SN測定TH+神經(jīng)元（僅50 mg/kg組）。例TH染色圖像如圖5a所示。與上述USP30 KO的作用一致，MTX115325抑制USP30可防止A53T αSyn誘導(dǎo)的TH+神經(jīng)元損失（圖5b）。以每只動(dòng)物的對側(cè)NI半球?yàn)閷φ眨?span>MTX115325 （50 mg/kg BID）處理動(dòng)物的同側(cè)TH+神經(jīng)元比例為61.7%，而MTX115325 （50 mg/kg BID）處理動(dòng)物的同側(cè)TH+神經(jīng)元比例為89.08%，表明USP30的藥理抑制對αSyn誘導(dǎo)的神經(jīng)元損失有顯著保護(hù)作用。與這些對TH+神經(jīng)元的影響一致的是，與對側(cè)半球相比，MTX115325在50和15 mg/kg BID下，消除了同側(cè)半球多巴胺和多巴胺代謝物HVA和DOPAC的損失，也消除了處理組之間同側(cè)半球多巴胺和多巴胺代謝物HVA和DOPAC的損失（圖5c-e）。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)比較治療組間同側(cè)半球的水平時(shí)，盡管平均多巴胺/HVA/DOPC估計(jì)表明，與50 mg/kg BID相比，15 mg/kg BID的療效略弱，但它們不足以在該模型中明確建立MTX115325治療的劑量反應(yīng)效應(yīng)。

圖4 小分子USP30抑制劑MTX115325對USP30的抑制作用及藥代動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證

        為了確認(rèn)化合物暴露與研究中目標(biāo)接觸的穩(wěn)定水平一致，在首次給藥后0.5、1、2、4和6小時(shí)，即研究結(jié)束前7天，測量了血液樣本中的MTX115325水平。MTX115325在15 mg/kg和50 mg/kg劑量下的血液Cmax分別為7546.9 ng/mL和16374.3 ng/mL，不同劑量下的暴露分別為13606 ng*h/mL和42959 ng*h/mL（圖4d）。在給藥方案持續(xù)時(shí)間內(nèi)，估計(jì)的腦游離藥物濃度將遠(yuǎn)高于TOM20泛素化（TOM20- UB）測定的EC50，劑量為50 mg /kg。

        綜上所述，這些結(jié)果表明，MTX115325對USP30的抑制作用再現(xiàn)了USP30 KO在αSyn - PD小鼠模型中保護(hù)TH+神經(jīng)元丟失和紋狀體多巴胺丟失的作用。

圖5 在α-突觸核蛋白為基礎(chǔ)的PD小鼠模型中，MTX115325對USP30的藥理抑制可防止多巴胺能神經(jīng)元丟失和多巴胺耗損

結(jié)論：

        總之，作者使用了一種通過USP30缺失來上調(diào)線粒體自噬的策略，使用藥理學(xué)USP30抑制劑獲得了類似的結(jié)果。這些減少USP30的策略導(dǎo)致線粒體自噬增強(qiáng)和對αSyn毒性的有效保護(hù)。這項(xiàng)工作驗(yàn)證了抑制USP30作為進(jìn)一步測試PD潛在疾病改善作用的有希望的策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

        細(xì)胞培養(yǎng)、多巴胺能神經(jīng)元培養(yǎng)、腺相關(guān)載體（AAV） 1/2立體定向注射、MTX115325劑量和在生活中的血液采樣的化合物水平測量、行為評估、免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色、線粒體自噬點(diǎn)與共定位分析、Western blot分析、多巴胺和多巴胺代謝物的測定、USP30生化熒光偏振測定、細(xì)胞USP30泛素探針結(jié)合試驗(yàn)、細(xì)胞TOM20泛素化試驗(yàn)、小鼠藥代動(dòng)力學(xué)及腦CETSA分析

參考文獻(xiàn)：

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