翻譯體系相關的7同源物（TMA7）與增殖相關疾病密切相關。然而，TMA7在喉鱗狀細胞癌（LSCC）中的作用和調控機制尚不清楚。本研究旨在探討TMA7在喉癌發生發展中的作用，并探討其作用機制。TMA7在喉鱗狀細胞癌組織中表達上調，并與預后不良有關。TMA7下調后，自噬水平增加，抑制了LSCC細胞的增殖、遷移和侵襲。M6A甲基化閱讀器IGF2BP3增強了TMA7的穩定性，降低了自噬水平。TMA7與UBA2直接相互作用。此外，IGF2BP3調節的TMA7-UBA2-PI3K通路的激活是TMA7抑制自噬、促進喉癌進展的主要機制。目前的研究表明，IGF2BP3介導的TMA7 m6A修飾通過UBA2-PI3K途徑促進LSCC的進展和順鉑耐藥，為LSCC自噬相關機制、潛在的生物標志物和治療靶點提供了新的見解。本文于2023年2月發表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF=9.2

主要技術路線：

1、喉癌組織中TMA7癌基因表達上調

        為了研究該基因的表達，我們選擇了5對喉癌和癌旁組織進行蛋白質組學和轉錄組學聯合分析。我們選擇了OmicStudio工具來分析數據。結果如圖1a-e所示。在log2FoldChange>1或log2FoldChange<-1（p<0.05）的轉錄分析中，剔除極端數據后，選取有代表性的基因進行聚類分析，其中54個基因與癌旁組織相比顯著上調，11個基因顯著下調（圖1A）。在蛋白質組學分析結果中，在p<0.05處，2486個蛋白質表現出顯著差異。在相同條件下，剔除極端數據后，選擇具有代表性的蛋白質進行聚類分析，與癌旁組織相比，15個蛋白質顯著上調，15個蛋白質顯著下調（圖1B）。

        轉錄組分析表明，6828個基因在患者樣本中與鄰近組織中存在差異表達。在蛋白質組學數據中，共有6187個蛋白質得到了差異表達。在兩組數據中總共有2131個差異表達的基因（圖1C）。對這兩組數據的相關性分析表明，在轉錄和蛋白質組數據中存在差異表達的基因，如圖1D所示。藍點代表了兩個具有相同組學表達趨勢的基因。火山圖也是使用OmicStudio工具進行的（圖1E）。此外，我們評估了在特定篩選條件下喉癌組織中上調基因的意義、組織中的蛋白質含量以及差異表達倍數，并鑒定了上調表達的基因。

        其中，TMA7在RNA和蛋白質水平上均有上調。因此，我們選擇TMA7作為目的基因。統計分析表明，喉癌組織中TMA7的表達水平在蛋白質水平和RNA水平均高于癌旁組織。根據喉癌組織中TMA7的表達情況分析其臨床病理特征（表1）。如表1所示，喉癌TMA7高表達患者的臨床分期（***p<0.001）和T分期（**p<0.01）均較高。此外，TMA7升高的患者有淋巴結轉移（***p<0.001）和頻繁復發（**p<0.01）。然而，TMA7的表達與年齡、性別和原發部位無關。此外，Kaplan-Meier生存曲線顯示TMA7升高與預后不良相關（圖1F-G）。因此，TMA7的IHC是在喉癌和癌旁組織中進行的，如圖1H所示。

 圖1 TMA7作為癌基因在喉癌組織中表達上調

2、TMA7影響喉鱗狀細胞癌的增殖、侵襲、遷移和凋亡

        為了闡明TMA7在LSCC細胞中的生物學功能，我們用慢病毒TU177、AMC - HN8和TU212的shRNA轉染LSCC細胞系來KD TMA7的表達（TMA7-KD）。RT-qPCR和Western blot證實TMA7被成功敲除（圖2A, B）。集落形成和EdU檢測顯示TMA7-KD抑制細胞增殖（圖2C, D）。Transwell分析顯示，TMA7 KD降低了LSCC細胞的侵襲性（圖2e）。隨后，通過傷口愈合試驗進行評估了LSCC細胞的遷移能力降低，隨后TMA7水平下降（圖2F）。在LSCC細胞TMA7-KD后，細胞的凋亡率增加（圖2G）。綜上所述，這些結果表明TMA7-KD減弱了LSCC細胞的增殖、侵襲、遷移和集落形成能力，增加了細胞的凋亡率。

圖2 TMA7影響喉鱗狀細胞癌的增殖、侵襲、遷移和凋亡

3、TMA7與喉癌細胞自噬相關

        為了研究TMA7與下游分子之間的調控相關性，我們對三個LSCC細胞系及其相應的TMA7 KD細胞系進行了RNA-SEQ檢測。相關下游RNA分子的表達水平發生了變化。我們還發現，在FC≥1.5且p<0.05的截止點TMA7-KD上調了945個基因，下調了2521個基因。接下來，我們篩選出了泛素樣修飾物激活酶2（UBA2），它通過添加小蛋白SUMO（參見SUMO 1；MIM 601912）或類泛素化來調節蛋白質結構和細胞內定位，從而實現蛋白質的翻譯后修飾。我們發現它的mRNA水平降低，經過GO分析，它與蛋白質結合有關。數據庫分析表明，它在UniProt預測的細胞質中表達。UBA2-KD促進腎透明細胞癌細胞的凋亡。本研究討論了與細胞凋亡和自噬相關的表型，因為細胞凋亡和自噬與癌癥有關。因此，我們推測UBA2除了與細胞凋亡有關外，是否還與自噬有關，這在以前還沒有描述過。本研究探討了UBA2與自噬表型相關途徑的調控關系，并選擇UBA2作為TMA7的下游基因進行進一步研究。

        為了研究喉鱗狀細胞癌TMA7-OE細胞生物學功能的變化，將TMA7-OE慢病毒導入LSCC細胞。RT-qPCR結果顯示，TMA7-OE慢病毒感染LSCC細胞后，TMA7的表達相應增加（圖3A）。TMA7-OE慢病毒從Genecem（MD，美國）獲得。此外，我們進行了Western印跡以驗證LSCC細胞TMA7的OE和KD（圖3B）。結果表明，TMA7在LSCC細胞中成功地過表達或沉默（圖2B，圖8A），蛋白質含量相應地增加和減少。為了研究LSCC細胞中的自噬和TMA7，我們檢測了與自噬相關的蛋白：P62、LC3B-I和LC3B-II。TMA7-OE后，細胞自噬減弱，p62表達增加，LC3B-II/I比值降低。TMA7-KD提供了相互矛盾的結果（圖3B）。

        用黃色自噬小體（mCherry和GFP）和紅色自噬溶體（MCherry）標記的串聯熒光報告基因（mCherryGFP-LC3）直接監測自噬通量。因此，黃點和紅點分別表示自噬小體和自噬溶體。用腺病毒（mCherry-GFP-LC3、韓恒、中國）感染用TMA7OE或KD感染的LSCC和對照細胞。共聚焦顯微鏡顯示，單個細胞的黃點和紅點的比例不變，但點數增加。分析表明，自噬-溶酶體代謝沒有改變，總體自噬水平增加。TMA7-KD后自噬增加，TMA7-OE后自噬減少（圖3C）。UBA2的表達在TMA7-KD后減少，TMA7-OE后增加（圖3B）。因此，我們推測UBA2可能是TMA7的下游分子，并被選中進行進一步的研究。

圖3 TMA7與喉鱗狀細胞癌自噬相關

4、IGF2BP3在喉癌細胞中的癌基因功能

        對來自多個數據集的差異表達基因的分析表明，除了TMA7上調外，IGF2BP3在喉癌組織中也上調。在LSCC細胞中，IGF2BP3-KD或-OE后，IGF2BP3水平成功改變（圖4A-B）。免疫印跡顯示IGF2BP3-KD后IGF2BP3、TMA7和UBA2表達降低，而IGF2BP3-OE后IGF2BP3、TMA7和UBA2表達增加。為了研究IGF2BP3與LSCC細胞自噬的相關性，我們檢測了自噬相關蛋白P62和LC3B。IGF2BP3-OE后，自噬減弱，p62增加，Lc3B-II/I比值降低。相反，IGF2BP3的下調導致了相反的結果（圖4C）。

        接下來，我們研究了IGF2BP3對LSCC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。克隆形成、EDU、傷口愈合和Transwell分析表明IGF2BP3-KD抑制LSCC細胞的增殖、遷移和侵襲（圖4D-f，4h），而IGF2BP3-OE促進相反的結果。IGF2BP3-KD后LSCC細胞的凋亡增加，IGF2BP3-OE后LSCC細胞的凋亡減少（圖4G）。IGF2BP3-KD后自噬水平增強，IGF2BP3-OE后自噬水平減弱（圖4I）。

        IGF2BP3促進LSCC細胞遷移、增殖和侵襲，減少細胞凋亡和自噬，調節TMA7和UBA2的表達水平。

圖4 IGF2BP3在喉癌細胞中起癌基因的作用

5、IGF2BP3通過m6A甲基化調控TMA7

        m6A在mRNA調控中起重要作用。TMA7 mRNA的3’-未翻譯（UTR）序列包含一個典型的m6A修飾基序，該基序由生物信息學分析（圖5A）管理。為了預測m6A修飾的可能位點，我們對MEME進行了基序預測，得到了預測的m6A修飾位點序列RRACH（D=A、G或U；R=A或G；H=A、U或C）。m6A甲基化修飾發生在基序的A堿基上（圖5B）。Western印跡分析表明，在TU212細胞中的TMA7正義RNA探針下拉樣本中存在IGF2BP3（圖5C）。為了證明IGF2BP3與TMA7之間的相互作用，我們進行了RIP實驗，結果表明IGF2BP3可能與TMA7結合（圖5D）。接下來，我們在TU212中進行了MERIP，并在TMA7的3’-UTR區域發現了一個m6A修飾位點。因此，我們選擇了上述序列并進行了下一步的驗證。MERIP后的RT-qPCR分析（m6A RIP）進一步證實了m6A修飾的TMA7 mRNA（圖5E）。與促進蛋白質翻譯的潛在作用相一致，減少TMA7 mRNA的m6A修飾降低了TMA7蛋白的表達和新生TMA7蛋白的合成。（圖4C）。隨后，我們得出結論：IGF2BP3直接與TMA7的mRNA分子結合。IGF2BP3 OE或KD后，用Actinomycin D檢測TMA7 mRNA在LSCC細胞上的穩定性。如前所述，提取總RNA用于RT-qPCR分析。計算指定時間點的mRNA表達，并根據GAPDH的表達進行標準化。因此，我們得出結論，IGF2BP3的消除可以縮短TMA7 mRNA的半衰期。IGF2BP3-OE延長了TMA7 mRNA的半衰期（圖5F，g）。

圖5 IGF2BP3通過m6A甲基化識別和結合TMA7

6、UBA2在喉癌細胞中的癌基因功能

        在用RNA-seq（圖3）分析了差異表達基因后，我們選擇UBA2作為TMA7的下游分子，用于TMA7-KD之后的下一步研究。

        據報道，UBA2在癌癥中起主要作用，但它在喉癌中的作用尚不清楚。目前的數據表明，LSCC細胞中的UBA2-OE或UBA2-KD成功地改變了UBA2的表達（圖6A-C）。為了闡明UBA2和自噬在LSCC細胞中的作用，我們對自噬相關蛋白P62和LC3B進行了研究。UBA2的OE減少了自噬，增加了p62，降低了LC3B-II/I比值。UBA2的破壞導致LC3B-II/I升高，p62降低（圖6C）。

        接下來，我們研究了UBA2對LSCC細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響。克隆形成、EDU、傷口愈合和Transwell分析表明，UBA2-KD抑制LSCC細胞的增殖、遷移和侵襲，而UBA2-OE促進這種差異（圖6D-G）。UBA2-KD后細胞凋亡率增加，UBA2-OE后細胞凋亡率降低（圖6H）。此外，當UBA2缺失時，自噬增加，而當UBA2過度表達時，自噬減弱（圖6I）。先前的一項研究證明，TMA7的水平與UBA2（圖3B）有關；因此，我們進行了co-IP實驗。結果表明，這兩個分子直接相互作用（圖6J），表明兩個分子可能相互結合。結果表明，UBA2在喉鱗狀細胞癌中起癌基因作用。在UBA2和TMA7之間建立了結合關系。

圖6 UBA2在喉癌細胞中的癌基因功能

7、TMA7通過UBA2和PI3K/mTOR途徑影響LSCC自噬

        在TMA7-KD后，我們用RNA-seq富集PI3K-mTOR通路，發現PI3K-mTOR通路與TMA7的變化有關。因此，我們進一步研究了TMA7對PI3K-mTOR信號通路的影響。Western印跡分析表明，TMA7-KD減少，而TMA7-OE增加了PI3K和mTOR的磷酸化水平（圖7A）。推測TMA7可以激活PI3K-mTOR信號通路。自噬通量分析表明，UBA2-OE減弱了TMA7-KD引起的自噬增加，而UBA2-KD增強了TMA7-OE引起的自噬減少（圖7C）。

        為了評估PI3K-mTOR信號通路在TMA7介導的自噬抑制中的重要性，我們用雷帕霉素處理TMA7-OE LSCC細胞。Western印跡和自噬通量分析表明，當3-MA處理TMA7-KD LSCC細胞時，抑制PI3K磷酸化可以重新激活被TMA7-OE抑制的自噬，而PI3K磷酸化的激活再一次抑制了由TMA7-KD激活的自噬（圖7B，C）。此外，UBA2-OE還可挽救TMA7-KD引起的細胞增殖、侵襲和遷移的減少。此外，UBA2-KD挽救了TMA7-OE引起的細胞增殖、侵襲和遷移（圖7D，7F-H）。UBA2-OE挽救了TMA7-KD引起的細胞凋亡增加，而UBA2-KD拯救了TMA7-OE引起的細胞凋亡減少（圖7E）。因此，我們推測TMA7與UBA2相互作用，并通過PI3K/mTOR信號通路調節喉癌自噬水平。

圖7 TMA7通過UBA2和PI3K/mTOR途徑影響LSCC自噬

8、IGF2BP3通過TMA7調節LSCC自噬和UBA2表達

        為了驗證TMA7在IGF2BP3介導的抑制自噬中的重要性，用TMA7-KD感染IGF2BP3-OE LSCC細胞，用TMA7-OE慢病毒處理IGF2BP3-KD LSCC細胞。Western印跡顯示，TMA7-KD可抑制IGF2BP3-OE誘導的UBA2上調和自噬抑制。而IGF2BP3-KD對UBA2的下調和自噬的激活則被TMA7-OE拯救（圖8A）。在此，TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD誘導的細胞增殖、侵襲和遷移的減少。相反，TMA7-KD挽救了IGF2BP3-OE誘導的細胞增殖、侵襲和遷移的增加（圖8B-E）。

        結果表明，TMA7-OE挽救了IGF2BP3-KD引起的細胞凋亡增加。此外，TMA7-KD還挽救了IGF2BP3-OE引起的細胞凋亡的減少（圖 8F）。自噬通量表明TMA7-OE減弱了IGF2BP3-KD誘導的自噬增加。相反，TMA7-KD增強了IGF2BP3-OE誘導的自噬的減少（圖8G）。

        因此，我們得出IGF2BP3和TMA7之間的相互作用，且IGF2BP3通過TMA7調節LSCC中UBA2的表達和自噬。

圖8 IGF2BP3通過TMA7調節LSCC自噬和UBA2表達

9、TMA7影響LSCC細胞自噬誘導的順鉑耐藥

        為了檢查TMA7是否調節喉癌對順鉑的化療敏感性，我們構建了順鉑耐藥的AMC-HN-8/DDP和TU212/DDP細胞。結果顯示，TMA7增加可促進細胞活力并誘導順鉑處理細胞的化療耐藥性，而RAPA則使細胞對順鉑處理敏感。雷帕霉素可能會改變TMA7對LSCC細胞耐藥性的影響（圖9A-D）。RAPA降低了IC50，而TMA7-OE增加了IC50（圖9E）。

        此外，我們替換了自噬抑制劑雷帕霉素，雷帕霉素可以抑制自噬并檢測自噬相關蛋白。Western blotting顯示TMA7-OE增加了p62并降低了LC3B-II/I比率，而雷帕霉素觸發了順鉑耐藥細胞的自噬（圖9F）。

        接下來，我們檢查了TMA7對順鉑耐藥細胞中PI3K-mTOR信號傳導的影響。Western blot表明TMA7-OE增加，而雷帕霉素降低mTOR磷酸化水平。此外，TMA7-OE降低了BAX、cleaved-caspase3和cleaved-caspase9的水平，而雷帕霉素增加了這些蛋白的水平，表明由于順鉑耐藥細胞的凋亡水平較低（圖9G），TMA7-OE激活順鉑耐藥細胞中的PI3K-mTOR通路。

        自噬通量表明雷帕霉素減弱了TMA7-OE誘導的自噬減少（圖9H）。在裸鼠體內，用TMA7-KD轉染的LSCC細胞（n=5）治療，另一組用TMA7-KD和UBA2-OE轉染的TU212穩定細胞治療（n=5），第三組注射TU212細胞。所有裸鼠飼養34天。異種移植數據顯示，低水平的TMA7顯著抑制異種移植瘤的生長，而UBA2-OE增強喉癌的致瘤性（圖9I，K，L）。

        與未處理的LSCC細胞相比，TMA7-KD細胞中的自噬小體由線粒體結構組成，表明TMA7-KD激活了線粒體自噬并觸發了隨后的自噬（圖9J）。

圖9 TMA7對自噬誘導LSCC細胞順鉑耐藥的影響

        綜上所述，目前的研究表明，TMA7在喉鱗狀細胞癌中升高，與預后不良有關。TMA7是一種癌基因，調節喉癌細胞的增殖、侵襲、凋亡、自噬和化療敏感性。TMA7通過UBA2調節PI3K/mTOR通路，而IGF2BP3以m6A依賴的方式調節PI3K/mTOR通路。因此，這項研究可能為喉癌提供潛在的分子標記和治療靶點（圖9M）。

實驗方法

        WB、轉錄組學和蛋白質組學多組學分析、集落形成試驗、Transwell侵襲試驗

參考文獻：

        Yang L, Yan B, Qu L, Ren J, Li Q, Wang J, et al. IGF2BP3 Regulates TMA7-mediated Autophagy and Cisplatin Resistance in Laryngeal Cancer via m6A RNA Methylation. Int J Biol Sci. 2023;19(5):1382-400. Epub 2023/04/15. doi: 10.7150/ijbs.80921. PubMed PMID: 37056932; PubMed Central PMCID: PMCPMC10086756.