男性乳腺癌(MBC)是一種惡性腫瘤，占所有乳腺癌的1%，通常診斷較晚，惡性程度較高，預(yù)后較差，死亡率高于女性乳腺癌(FBC)。由于臨床特點和缺乏治療，MBC患者的總死亡率比FBC患者高19%。在這項工作中，作者利用scRNA-seq和scTCR-seq技術(shù)探索乳腺癌的腫瘤微環(huán)境，并比較MBC和FBC樣本的免疫學和代謝特征。作者的研究表明，FASN介導(dǎo)的脂肪酸代謝水平升高與MBC的癌細胞轉(zhuǎn)移和低免疫浸潤有關(guān)。此外，作者的數(shù)據(jù)揭示了T細胞在MBC微環(huán)境中的功能失調(diào)和特異性代謝模式。作者的研究為進一步了解MBC的腫瘤免疫學和代謝提供了信息，并為制定改善MBC患者預(yù)后的治療策略提供了啟示。該文于2023年9月發(fā)表于《Nature Communications》，IF=16.6。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1、MBC的免疫浸潤率低于FBC

        為了探索乳腺癌(BRCA)的細胞多樣性，作者整合了6個MBC和13個FBC樣本的scRNA-seq數(shù)據(jù)(圖1a)。對3個MBC和2個FBC樣本進行ScTCR-seq檢測，以表征T細胞受體的克隆性。所有樣本均為陽性。這些樣本的臨床特征見補充資料1。考慮到一些臨床病理特征，如腫瘤分期可能與患者的免疫微環(huán)境和代謝有關(guān)，作者比較了收集的MBC和FBC樣本的臨床特征。結(jié)果顯示，FBC組與MBC組在年齡、HER2狀態(tài)、KI67水平、腫瘤范圍(T1-T4)等方面無顯著差異。作者的單細胞分析概述如圖1a所示。通過分析標記基因的表達，作者標注了BRCA生態(tài)系統(tǒng)中的各種細胞類型，包括上皮細胞、T細胞、B細胞、漿細胞、巨噬細胞、肥大細胞、肌成纖維細胞、癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAFs)、動脈內(nèi)皮細胞、靜脈內(nèi)皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞(圖1b、c)。鑒定了每種細胞類型中特異性表達的基因(圖1d)。在不同性別之間觀察到顯著的富集差異，表明MBC和FBC患者之間的微環(huán)境成分不同(圖1c)。結(jié)果顯示，與FBC相比，MBC中癌細胞比例明顯較高，T細胞、B細胞等免疫細胞比例較低，免疫浸潤水平較低(圖2a-d)。這些免疫細胞比例在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后的FBC患者之間沒有明顯差異(圖2e)。為了進一步驗證這一結(jié)果，作者根據(jù)從單細胞數(shù)據(jù)中獲得的基因特征計算了722個ER+ TCGA-BRCA樣本的各種細胞類型的分數(shù)(圖2 f)。絕經(jīng)前和絕經(jīng)后FBC患者的這些評分也進行了比較(圖2g)。結(jié)果證實MBC具有較高的腫瘤純度和較低的T細胞和B細胞比例，與單細胞水平的觀察結(jié)果一致。此外，作者對30例ER+ MBC和30例ER+ FBC樣本的T細胞標志物CD4和CD8進行了免疫組織化學(IHC)分析。結(jié)果表明，這些T細胞標記物在MBC中的表達比例低于FBC樣品(圖2h, i)。因此，scRNA-seq、大體積轉(zhuǎn)錄組和免疫組化分析一致表明，MBC的免疫浸潤程度明顯低于FBC，尤其是T細胞和B細胞的浸潤程度較低。

圖1、乳腺癌患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

圖2、MBC和FBC細胞成分的比較

2、由AR和SREBF1控制的轉(zhuǎn)移相關(guān)程序和調(diào)控在MBC癌細胞中被顯著激活

        為了進一步比較MBC和FBC之間癌細胞的轉(zhuǎn)錄模式，作者重新聚集了來自19名BRCA患者的53,343個癌細胞(圖3a, b)。癌細胞簇顯示出基于性別的差異(圖3c)。根據(jù)每個簇中來自MBC患者的癌細胞的比例，作者將這些簇分為三個亞組，包括MBC、FBC和混合簇(見“方法”;圖3 d)。參與脂肪酸代謝的基因如FASN和AZGP1在MBC集群中的表達高于FBC集群。先前的研究表明，FASN可以增強乳腺癌的侵襲。作者進一步探討了MBC和FBC癌細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)特征評分。結(jié)果顯示，與FBC中的癌細胞相比，MBC具有更高的細胞遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和血管生成的特征評分(圖3e)。此外，ER+ HER2+和ER+ HER2MBC的癌細胞都比FBC表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)移相關(guān)特征評分，尤其是血管生成和細胞遷移。這些結(jié)果表明MBC具有更高的轉(zhuǎn)移潛力，這與臨床觀察一致。為了揭示MBC簇特異性激活的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作者確定了MBC簇和其他簇之間具有差異活性的轉(zhuǎn)錄因子(tf)(圖3f)。與FBC相比，MBC的癌細胞中雄激素受體(AR)和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1 (SREBF1)的TF活性和表達均顯著上調(diào)(圖3g, h)。既往研究表明，SREBF1作為脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)因子，可促進乳腺癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，并與EMT過程高度相關(guān)。為了進一步評估AR的觀察結(jié)果，作者回顧性研究了IHC在大樣本隊列中評估的AR水平，包括113個ER+ MBC和86個ER+ FBC樣本(圖3i, j)。結(jié)果顯示，MBC中ar陰性患者的比例明顯低于FBC(分別為5.3%和17.4%)，而MBC中ar++患者的比例高于FBC(分別為69.9%和50.0%)。這一結(jié)果進一步證實了在單細胞水平上觀察到的MBC患者激活的AR調(diào)控。

圖3、MBC和FBC中癌細胞轉(zhuǎn)錄的差異

3、活化的脂肪酸代謝與MBC的轉(zhuǎn)移和低免疫浸潤有關(guān)

        為了確定MBC和FBC樣本之間癌細胞代謝的潛在差異，作者評估了每個癌細胞簇中代謝途徑的活性，并確定了男性癌細胞簇中特異性激活的途徑。結(jié)果表明，脂肪酸代謝相關(guān)途徑在MBC癌細胞簇中明顯更活躍，包括脂肪酸生物合成、脂肪酸延伸、脂肪酸降解、和不飽和脂肪酸的生物合成(圖4a)。作為新生脂肪生成的必需酶，FASN在MBC癌細胞中比在FBC樣本中顯著上調(diào)(圖4b、c)。與HER2狀態(tài)無關(guān)，ER+ HER2+和ER+ HER2- MBC樣本的癌細胞FASN表達均高于FBC樣本。為了進一步驗證這一結(jié)果，作者比較了TCGA隊列中ER+ MBC和FBC的基因表達。與此一致的是，FASN在MBC患者中的表達明顯更高(圖4d)。此外，作者比較了30例ER+ MBC和30例ER+ FBC樣本中FASN的免疫組化染色。結(jié)果顯示，MBC中FASN蛋白水平顯著高于FBC樣品(Wilcoxon秩和檢驗，p值:0.0052;圖4e, f).這一觀察結(jié)果表明脂肪酸在MBC患者腫瘤細胞能量代謝中發(fā)揮了重要作用。為了弄清楚這種基于性別的差異是否是乳腺癌特異性的，作者進一步比較了其他癌癥類型的男性和女性患者的脂肪酸代謝活性。結(jié)果顯示，在男性肺腺癌(LUAD)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、食管癌(ESCA)和彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)患者中，脂肪酸代謝途徑的上調(diào)基因顯著富集。值得注意的是，通過對ER+乳腺癌細胞系(MCF-7)、LUAD細胞系(A549)和ESCA細胞系(KYSE150和TE-5)中SREBF1的chip -測序數(shù)據(jù)分析，作者發(fā)現(xiàn)FASN的啟動子在這些細胞中被SREBF1靶向(圖4)，進一步證明了FASN介導(dǎo)的脂質(zhì)代謝受到SREBF1的調(diào)控。此外，在三個獨立數(shù)據(jù)集的MBC和FBC樣本中，FASN和SREBF1的表達水平均呈顯著正相關(guān)(圖4h)。此外，受先前研究證實AR在PRAD中驅(qū)動脂肪酸代謝的啟發(fā)，作者研究了MBC和FBC樣本中AR與FASN表達之間的關(guān)系(圖4i)。結(jié)果表明，在GSE1047306和GSE31259的MBC樣品中，AR和FASN的表達呈正相關(guān)，而在TCGA數(shù)據(jù)集的FBC樣品中，AR和FASN的表達無明顯相關(guān)性。鑒于作者的上述結(jié)果表明，MBC患者的癌細胞具有更高的轉(zhuǎn)移相關(guān)特征評分，作者通過計算Pearson相關(guān)系數(shù)(PCC)進一步探索TCGA數(shù)據(jù)集中ER+乳腺癌中脂肪酸代謝與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果顯示，脂肪酸代謝的特征評分與轉(zhuǎn)移相關(guān)程序，包括細胞遷移、EMT和血管生成呈正相關(guān)(圖4j)，提示脂肪酸代謝可能參與促進乳腺癌轉(zhuǎn)移。先前的研究報道FASN在乳腺癌轉(zhuǎn)移和進展中起著至關(guān)重要的作用。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移明顯依賴于FASN介導(dǎo)的脂質(zhì)生物合成，表明FASN可以作為基因或藥物抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的靶點。作者還分析了TCGA數(shù)據(jù)集中其他癌癥類型的數(shù)據(jù)，以評估脂肪酸代謝與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。結(jié)果顯示，脂肪酸代謝與轉(zhuǎn)移相關(guān)程序之間的正相關(guān)性在大多數(shù)癌癥類型中并未普遍觀察到，而僅在睪丸生殖細胞瘤(TGCT)、BRCA和葡萄膜黑色素瘤。此外，作者發(fā)現(xiàn)在TCGA數(shù)據(jù)集的MBC患者中，FASN表達與T細胞和B細胞特征評分呈負相關(guān)(圖4k)，表明激活脂肪酸代謝可能介導(dǎo)低免疫浸潤。因此，作者進行了一項泛癌分析，以評估TCGA數(shù)據(jù)集中FASN表達與免疫浸潤之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，在大多數(shù)腫瘤中，FASN表達與腫瘤純度呈正相關(guān)，而T細胞和B細胞浸潤評分與FASN表達呈負相關(guān)。這些結(jié)果提示FASN表達升高可能與免疫排斥有關(guān)。作者對TCGA泛癌癥數(shù)據(jù)集的總生存期(OS)、無進展間期(PFI)和疾病特異性生存期(DSS)進行了分析。結(jié)果顯示，FASN表達對許多類型癌癥的OS、DSS和PFI具有預(yù)后影響，尤其是對男性癌癥患者。FASN表達較高的男性BRCA患者預(yù)后相對較差，但可能由于TCGA中僅存在12個MBC樣本，因此沒有統(tǒng)計學意義。此外，FASN高表達可以預(yù)測膀胱尿路上皮癌(BLCA)和腎透明細胞癌(KIRC)男性患者的OS和PFI較差。FASN高的男性腎乳頭狀細胞癌(KIRP)和葡萄膜黑色素瘤(UVM)患者的PFI也明顯較差。FASN高表達的男性肺鱗狀細胞癌患者的DSS明顯低于FASN低表達的患者。然而，這些癌癥女性患者的預(yù)后與FASN表達無關(guān)。值得注意的是，較高的FASN表達是PRAD患者DSS差的預(yù)后因素，這與先前的一項研究一致，該研究表明靶向FASN可以抑制侵襲性和耐藥PRAD。這一結(jié)果提示FASN可能是這些癌癥男性患者的潛在治療靶點。

圖4、MBC腫瘤細胞特異性激活代謝途徑的鑒定

4、MBC和FBC之間T細胞亞群功能特征的差異

        為了揭示乳腺癌中T細胞群的功能亞型，作者對MBC和FBC樣本中的T細胞進行了聚類分析。共鑒定出13個細胞簇，包括7個CD8+細胞簇、4個CD4+細胞簇和2個NKT細胞簇(圖5a)。CD8+ T細胞分為GZMK + T-1、GZMK + T-2、CAPG + T、IFIT + T、KLRC2 + T、KRT8 + T和TRDV2 + T細胞。CD4 + T細胞分為FOXP3 + T調(diào)節(jié)性(Treg)細胞、CXCL13 + T輔助(Th)細胞、CCR7+na?ve和FOS+ na?ve T細胞。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)CD8 + KRT8+細胞簇在MBC樣本中顯著富集，而CD4 + CXCL13 + Th細胞簇在MBC樣本中顯著減少。此外，FGFBP2 + NKT在MBC中富集，NCAM1 + NKT在FBC中富集(圖5b)。這些觀察結(jié)果表明，MBC和FBC患者之間的T細胞功能可能存在差異。作者進一步整合scRNA-seq和scTCR-seq數(shù)據(jù)，比較MBC和FBC樣品的富集程度和克隆大小(圖5c)。作者發(fā)現(xiàn)，一些CD8 + T細胞的克隆大小，如CD8 + CAPG+和CD8 + IFIT1+簇，在MBC樣本中明顯大于在FBC樣本中(圖5d)。此外，來自MBC的CD8 + T細胞的p38 MAPK特征評分明顯高于FBC(圖5e)，表明MBC的CD8 + T細胞衰老。高表達PDCD1和CTLA4的CXCL13 + Th細胞在MBC樣品中有明顯的缺失和較小的克隆大小(圖5b-d)。先前報道CXCL13 + Th細胞的富集與結(jié)腸直腸癌患者靶向PD1或CTLA4的免疫治療的高敏感性有關(guān)29。因此，作者的數(shù)據(jù)暗示男性乳腺癌患者可能對PD1/PDL1或CTLA4抑制劑不敏感。此外，作者比較了MBC和FBC樣本中CD4 +、CD8 +和NKT細胞的轉(zhuǎn)錄模式和功能。在不同性別間，可以觀察到特異性表達的基因和顯著不同的功能(圖5f, g)。在MBC T細胞中，上調(diào)的基因顯著豐富了線粒體凋亡途徑。與上述結(jié)果一致(圖5e)，報道中與T細胞功能障礙和衰老相關(guān)的p38 α / β MAPK下游通路在MBC T細胞中富集。值得注意的是，在MBC微環(huán)境中，所有三種亞型T細胞都有激活的BDNF信號通路，這可以增強脂質(zhì)氧化。一系列證據(jù)表明，脂質(zhì)氧化是功能失調(diào)或耗竭的T細胞最重要的特征之一。作者還觀察到AZGP1在MBC T細胞中的高表達。據(jù)報道，AZGP1是癌癥轉(zhuǎn)移和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵啟動子。相比之下，FBC樣品表現(xiàn)出高水平的細胞毒性t細胞標志物，如GZMK、KLRB1、KLRD1、XCL1和KLRC1(圖5f)。此外，FBC T細胞中特異性表達的基因在免疫調(diào)節(jié)細胞因子介導(dǎo)的多種途徑中富集，如IL-2、IL-5、IL-4和TNF- α信號傳導(dǎo)(圖5g)。此外，作者發(fā)現(xiàn)，與FBC樣品中的T細胞相比，MBC T細胞中的脂肪酸代謝途徑被高度激活。總的來說，作者的數(shù)據(jù)表明，MBC微環(huán)境中的T細胞功能失調(diào)，可能是由脂質(zhì)代謝介導(dǎo)的，而FBC中的T細胞具有活性的細胞毒性。

圖5、基于scRNA-seq和scTCR-seq的MBC和FBC中T細胞亞群和克隆大小的表征

5、脂肪酸代謝水平高的KRT8+T細胞在MBC微環(huán)境中富集

        根據(jù)作者的對比分析，KRT8 + T細胞在MBC樣品中特異性富集(圖5b)。此外，上皮細胞標記物，如KRT8、KRT18和KRT19，在MBC T細胞中的表達明顯更高(圖5f)。作者進一步說明了CD3E和KRT8在單細胞分辨率下的共表達(圖6a)，發(fā)現(xiàn)CD3E + KRT8 + T細胞在MBC樣品中趨于富集(圖6b)。此外，作者對一名MBC患者的新鮮腫瘤組織進行了流式細胞術(shù)實驗，以驗證和量化CD3 + KRT8+雙陽性T細胞(圖6d)。使用單抗體標記的補償樣品和熒光減一(FMO)對照來確定門的設(shè)置位置。首先，通過正向和側(cè)向散射門控排除碎片，并使用FSC-A/FSC-H剖面對單個細胞進行門控。使用Zombie活/死染色進一步排除死細胞。其次，利用KRT8和CD45分別區(qū)分上皮細胞(KRT8 + CD45?，24.0%)、免疫細胞(KRT8-CD45 +， 5.1%)和KRT8 + CD45+雙陽性細胞(5.3%)。KRT8 + CD45+雙陽性細胞中，86.2%為KRT8 + CD45+ CD3 + T細胞。同樣，87.8%的KRT8-CD45+免疫細胞是CD3 + T細胞。為了更好地確定T細胞亞群，KRT8 + CD45 + CD3+和KRT8-CD45 + CD3+ T細胞被backgated并覆蓋在FSC-A/SSC-A圖上。結(jié)果表明，KRT8 + CD45 + CD3+和KRT8-CD45 + CD3+ T細胞均位于淋巴細胞門。在所有T細胞(CD45 + CD3 +)中，KRT8+和KRT8?細胞在該MBC樣本中分別占50.5%和49.5%。因此，這些結(jié)果表明KRT8 + CD45 + CD3 + T細胞的生物學存在。此外，作者試圖探索這些ecd3e + KRT8 + T細胞的功能意義。首先，作者詢問這些細胞在不同的T細胞類型中是否具有富集偏好。結(jié)果顯示這些T細胞傾向于CD8+ 。通過比較CD3E + KRT8+和CD3E + KRT8?T細胞的基因表達，作者發(fā)現(xiàn)CD3E + KRT8+細胞下調(diào)了細胞毒性相關(guān)基因，如GZMA、GZMK、IFNG和KLRD1(圖6e)。在CD3E + KRT8 + T細胞中，TCR信號通路啟動的重要基因FYN也出現(xiàn)下調(diào)。相比之下，與T細胞衰老相關(guān)的基因如GATA3和與組蛋白相關(guān)的基因如HIST1H1E在CD3E + KRT8+細胞中表達水平更高。值得注意的是，一些參與脂肪酸代謝的基因在CD3E + KRT8+細胞中顯著上調(diào)，包括FASN、HADHA、ELOVL5和HACD3(圖6f)。先前的研究表明，HADHA編碼了催化長鏈脂肪酸線粒體β氧化的多酶復(fù)合物的一個亞基。此外，作者還研究了CD3E + KRT8+和CD3E + KRT8?T細胞的細胞毒活性，發(fā)現(xiàn)CD3E + KRT8+細胞的細胞毒活性較低。作者發(fā)現(xiàn)CD3E + KRT8 + T細胞中與免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)的基因，如顆粒酶- a和T細胞受體介導(dǎo)的凋亡途徑的表達水平明顯較高，但與細胞應(yīng)激相關(guān)的凋亡并不富集。此外，CD3E + KRT8 + T細胞中氧化磷酸化和BDNF信號通路被顯著激活(圖6g)，進一步證實了MBC患者脂質(zhì)代謝與T細胞功能障礙之間的關(guān)聯(lián)。值得注意的是，AR信號、蛋白水解和轉(zhuǎn)錄調(diào)控在CD3E + KRT8 + T細胞的上調(diào)基因中富集得分最高(圖6g)。先前的研究表明，AR調(diào)控的轉(zhuǎn)錄程序可以驅(qū)動男性癌癥患者的腫瘤浸潤性CD8 + T細胞耗竭，從而導(dǎo)致抗腫瘤免疫的性別差異。綜上所述，作者的分析表明，CD3E + KRT8 + T細胞以脂質(zhì)代謝水平升高和AR調(diào)節(jié)為特征，可能參與了MBC患者的免疫功能障礙。

圖6、CD3E + KRT8 + T細胞的特性

6、腫瘤細胞與T細胞之間的通訊參與了MBC的免疫抑制

        作者對MBC和FBC樣品中不同細胞類型之間的細胞間通訊進行了分析，以確定免疫微環(huán)境的差異。結(jié)果顯示，MBC樣品中癌細胞與T細胞相互作用的數(shù)量大約是FBC樣品的兩倍(圖7a)。與FBC樣品相比，MBC中大多數(shù)T細胞亞型與癌細胞的相互作用更多(圖7b)。作者進一步確定了癌細胞和T細胞亞群之間共同的、男性特異性的、女性特異性的配體受體相互作用(圖7c, d)，表明了MBC和FBC免疫學的共同和獨特特征。值得注意的是，TGF-β和TGF-β受體的相互作用在MBC樣品的癌細胞和T細胞中被顯著激活(圖7e, f)。先前的研究報道TGF-β信號在T細胞排斥、免疫抑制和腫瘤進展中發(fā)揮重要作用。抑制TGF-β信號可增強免疫檢查點阻斷治療乳腺癌的效果。此外，在MBC樣品中發(fā)現(xiàn)T細胞與癌細胞之間存在TIGITNECTIN2相互作用(圖7e)。TIGIT是腫瘤免疫的關(guān)鍵抑制劑，并且TIGIT- nectin2相互作用與T細胞衰竭有關(guān)。此外，免疫檢查點VSIR在MBC樣本的一些T細胞亞群上表達，并通過TNF與癌細胞相互作用(圖7e)。綜上所述，作者的研究結(jié)果表明，腫瘤細胞與T細胞之間的通訊參與了MBC樣品的免疫抑制。

圖7、MBC和FBC中細胞間通訊的分析

結(jié)論

        總之，作者的研究在單細胞水平上表征了MBC和FBC之間的免疫和代謝差異。作者發(fā)現(xiàn)MBC比FBC有更低的免疫浸潤和更高的轉(zhuǎn)移潛力。在MBC微環(huán)境中，腫瘤細胞和T細胞的脂肪酸代謝均被激活。此外，脂肪酸代謝與MBC轉(zhuǎn)移相關(guān)程序和免疫細胞消耗密切相關(guān)，表明靶向脂肪酸代謝途徑可能緩解MBC患者的免疫抑制微環(huán)境并抑制細胞遷移。

實驗方法

        scRNA-seq和數(shù)據(jù)分析，TCGA數(shù)據(jù)庫分析，主成分分析、聚類和細胞類型識別，代謝途徑分析，細胞-細胞通訊分析，功能富集分析，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，免疫組織化學，免疫熒光染色，細胞培養(yǎng)，流式細胞術(shù)

參考文獻

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