骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種常見的全身性骨疾病，成骨細(xì)胞的程序性死亡與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，c-fos可引起成骨細(xì)胞凋亡。此外，lncRNA在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的生物學(xué)中起著普遍的作用。然而，lncRNA在成骨細(xì)胞死亡中與c-Fos相關(guān)的轉(zhuǎn)錄水平的確切作用和機(jī)制仍不確定。與正常成骨細(xì)胞相比，血清剝奪導(dǎo)致成骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子c-Fos和凋亡相關(guān)Fas蛋白顯著上調(diào)。此外，與c-Fos相關(guān)的lncRNA GM15416表達(dá)顯著升高。c-Fos過表達(dá)導(dǎo)致下游Fas蛋白增加，進(jìn)而導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡，阻礙成骨。lncRNA GM15416表達(dá)減少導(dǎo)致c-Fos/Fas表達(dá)減少，從而阻礙成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成骨。我們的研究結(jié)果表明lncRNA GM15416對成骨細(xì)胞凋亡具有抑制作用，是骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防因子。因此，GM15416成為與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的重要lncRNA，并有望成為未來的治療靶點(diǎn)。本文于2023年11月發(fā)表于“International Journal of Biological Macromolecules”（IF=8.2）上。

技術(shù)路線：

結(jié)果：

1）成骨細(xì)胞凋亡促進(jìn)骨質(zhì)疏松

        為了研究細(xì)胞凋亡在骨質(zhì)疏松癥中的作用，我們使用了Sham和OVX小鼠兩種動物模型。我們通過micro-CT和H&E染色的初步評估顯示，與假手術(shù)組相比，OVX組顯示骨小梁減少，脂肪細(xì)胞增加(圖1A、1B、1C)。OVX組中ARS和Von Kossa的表達(dá)水平顯著降低(圖1D, 1E)。Western blot驗(yàn)證顯示，OVX組Bax水平顯著升高，Bcl2水平顯著降低。另一個關(guān)鍵的凋亡分子-caspase-3的水平顯著升高(圖1F, 1G)。為了促進(jìn)體外成骨細(xì)胞凋亡模型的建立，我們在先前研究的基礎(chǔ)上采用了血清饑餓誘導(dǎo)模型。值得注意的是，誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡水平明顯升高。Bcl2表達(dá)降低，Bax、caspase-3、cleaved - caspase-3表達(dá)顯著升高(圖1H、圖1I)。

2）c-fos和Fas的升高與成骨細(xì)胞凋亡顯著相關(guān)

        為了建立c-Fos與骨質(zhì)疏松之間更強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，我們特意選擇了已被證實(shí)的凋亡關(guān)鍵分子Fas，并對Sham和OVX組進(jìn)行了western blot分析。研究結(jié)果顯示，OVX組中c-Fos和Fas蛋白水平顯著增加(圖2A, 2B)。同樣，在體外實(shí)驗(yàn)，觀察到SD組c-Fos和Fas蛋白水平顯著升高(圖2C, 2D)。隨后，我們進(jìn)行了co-IP實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證c-Fos和Fas在MC3T3-E1細(xì)胞中的存在，從而表明兩者之間存在內(nèi)在的相關(guān)性(圖2E)。在c-Fos敲除后，免疫熒光分析顯示，與NC組相比，si-Fos組的c-Fos熒光強(qiáng)度顯著降低(圖2F和2G)。si-Fos的體外驗(yàn)證表明，Fos表達(dá)的減少與Fas水平的降低相對應(yīng)，因此，這導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved caspase-3的抑制以及Bcl2水平的部分恢復(fù)(圖2H-2I)。此外，敲除c-Fos后，細(xì)胞凋亡顯著減少(圖3A-3D)。以上結(jié)果表明，c-Fos通過作用于Fas誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

3）lncRNA GM15416在OVX小鼠和血清饑餓誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中高表達(dá)

        為了建立上述c-Fos基因之間的聯(lián)系，我們進(jìn)行了生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)庫比較的綜合分析，鑒定出15個與c-Fos相關(guān)的差異表達(dá)lncRNA。此外，對GM15416進(jìn)行GSEA富集分析，以確定其參與凋亡途徑(圖3E-3G)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示，血清饑餓誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞中lncRNA GM15416的表達(dá)水平顯著升高(圖3H)。此外，OVX模型中GM15416的表達(dá)水平顯著超過其他14種lncRNA的表達(dá)水平(圖3I)。此外，我們評估了GM15416在OVX小鼠的7個器官中的表達(dá)水平，其中骨中GM15416的表達(dá)水平第二高(圖3J)。

4）GM15416通過c-fos/fas軸促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致成骨分化能力降低

        我們將通過分子對接和分子動力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)來模擬lncRNA GM15416與c-Fos之間的關(guān)系。利用PyMOL，我們發(fā)現(xiàn)了蛋白與核酸CCCATCTGTCTTTCTGC之間的相互作用。在這些作用力的作用下，確定fos-核酸的得分為?291.81，表現(xiàn)出較好的性能(圖4A)。通過動態(tài)模擬，我們可以得出蛋白質(zhì)和核酸在原有的結(jié)合構(gòu)象上進(jìn)行了優(yōu)化，使得復(fù)合物的結(jié)合更加穩(wěn)定(圖4B-4E)。此外，GM15416在細(xì)胞核內(nèi)具有顯著的豐度(圖4F)。western blot分析表明，GM15416的體外下調(diào)導(dǎo)致c-Fos和Fas的表達(dá)水平降低，從而導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡減少(圖4G, 4H)。抑制GM15416可顯著減少細(xì)胞凋亡(圖4I-4L)。

        為了研究c-Fos對GM15416的影響，我們進(jìn)行了RIP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)c-Fos能夠拉下GM15416(圖5A)。此外，RNA下拉證實(shí)了相互作用，揭示生物素化的GM15416可以拉下c-Fos(圖5B)。TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，GM15416過表達(dá)與成骨細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。si-Fos的引入可以部分減輕GM15416誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖5C-5F)。western blot分析顯示，GM15416過表達(dá)導(dǎo)致c-Fos和Fas表達(dá)水平上調(diào)，隨后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡水平升高。Fos敲低后，凋亡蛋白Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3的表達(dá)水平下調(diào)(圖5G, H)。免疫熒光染色分析顯示GM15416過表達(dá)后c-Fos的相對熒光表達(dá)增加(圖5I, J)。為了確定GM15416在成骨分化過程中的作用，我們使用western blot分析評估了成骨分化基因Runx2、Opn和Osx的蛋白表達(dá)水平(圖5K, L)。結(jié)果顯示，GM15416過表達(dá)導(dǎo)致的成骨分化異常可以通過抑制c-Fos得到改善。ALP和ARS的染色數(shù)據(jù)表明，GM15416對成骨分化能力有負(fù)面影響，可通過抑制c-Fos部分恢復(fù)成骨分化能力(圖5M-5P)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GM15416可通過上調(diào)c-Fos和Fas誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致成骨分化受損。

5）抑制GM15416可挽救c-Fos介導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡和成骨分化功能障礙

        為了研究GM15416對c-Fos的影響，采用了c-Fos和敲除GM15416的共培養(yǎng)。TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，GM15416敲低可有效減輕c-Fos過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(圖6A-6D)。通過免疫熒光染色和western blot分析初步證實(shí)c-Fos成功過表達(dá)。隨后，在功能驗(yàn)證階段觀察到c-Fos過表達(dá)。隨著Fas表達(dá)的增加，凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3的表達(dá)水平升高，Bcl2的表達(dá)水平降低。然而，與c-Fos過表達(dá)組相比，共培養(yǎng)組顯示出更高的細(xì)胞凋亡表達(dá)水平(圖6E-6H)。隨后，通過western blot分析評估成骨分化能力，研究GM15416基因敲低對成骨分化的影響。數(shù)據(jù)顯示，c-Fos過表達(dá)導(dǎo)致成骨分化能力降低，而GM15416的敲低部分減輕了上述損傷(圖6I, J)。應(yīng)用ALP和ARS染色技術(shù)評估成骨礦化能力表明，c-Fos的上調(diào)會影響成骨礦化，而GM15416的下調(diào)會增強(qiáng)成骨礦化(見圖6K-6N)。這些發(fā)現(xiàn)證明GM15416抑制可通過調(diào)節(jié)c-Fos和Fas的表達(dá)水平，減輕成骨細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)成骨分化功能。

6）LncRNA GM15416減輕OVX小鼠骨丟失

        我們評估了GM15416在體內(nèi)減輕骨質(zhì)流失的治療潛力。與OVX + si-NC組相比，OVX + si-GM15416組的骨礦物質(zhì)密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)和小梁數(shù)(Tb.N)水平明顯較高，小梁間隙(Tb.Sp)水平較低(圖7A, B)。此外，si-GM15416顯著增加骨小梁體積，促進(jìn)骨形成過程。H&E圖像的組織學(xué)檢查進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果(圖7C)。western blot結(jié)果顯示，與OVX + si-NC組相比，si-GM15416組對細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。此外，在OVX + si-GM15416組中，Fos和Fas蛋白各自的表達(dá)水平下調(diào)(圖7D, E)。此外，小鼠股骨的免疫組織化學(xué)圖像(圖7F)顯示，OVX + si-GM15416組與OVX + si-NC組相比，Runx2、Osx和Opn的表達(dá)水平更高。相反，OVX + si-GM15416組Fos、Fas、Bax、cleaved-caspase-3、Caspase-3的表達(dá)降低。western blot分析結(jié)果還顯示，與對照組相比，GM15416敲低后成骨分化標(biāo)志物Runx2、Osx、Opn的表達(dá)均有顯著改善(圖7G, H)。此外， si- GM15416組ARS和Von Kossa的相對表達(dá)水平顯著高于si-NC組(圖7I, J)。綜上所述，上述研究結(jié)果證實(shí)了GM15416通過c-Fos/Fas途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)流失，如圖7K所示。

結(jié)論：本研究提示lncRNA GM15416通過特異性影響c-Fos/Fas通路，對成骨細(xì)胞凋亡具有抑制作用，并可作為預(yù)防骨質(zhì)疏松的因子。因此，GM15416成為與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的重要lncRNA，并有望成為未來的治療靶點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)方法：OVX動物模型的建立，qPCR，Micro-CT，HE染色，免疫組化，免疫熒光，茜素紅染色，堿性磷酸酶染色，Masson染色，Von Kossa染色，流式，TUNEL染色，WB，FISH，RIP，RNA pull down，Co-IP，分子對接。

參考文獻(xiàn)：Zhao D, He J, Zhao X, Sheng X, Feng Z, Wang X, Zhang C, Wang S, Geng B, Xia Y. A novel lncRNA GM15416 regulates osteoblast apoptosis and differentiation through the c-Fos/Fas axis and mitigates osteoporosis. Int J Biol Macromol. 2023 Nov 2;254(Pt 2):127824. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.127824.