老年手術患者圍手術期神經認知障礙（PND）的發生率很高，這與麻醉誘導的長時間神經毒性密切相關。麻醉誘導的神經毒性的神經形態病理學基礎一直難以捉摸。這項研究表明，長時間麻醉會引發NF-κB炎癥通路激活、神經炎癥、神經元興奮性抑制、認知功能障礙和焦慮樣行為。RNA 測序發現，長時間麻醉后，不同類型突觸的基因下調。小膠質細胞的遷移、活化和吞噬作用增強。同時還觀察到小膠質細胞形態的改變。補體級聯的啟動子 C1qa 和 C3 增加，標記突觸的 C1qa 也升高。然后，作者發現 "Eat Me "補體途徑介導了長時間麻醉后海馬的小膠質細胞突觸吞噬。之后，海馬突觸明顯丟失。此外，樹突棘減少，其基因也被下調。敲除小膠質細胞可以改善神經炎癥和補體的激活，并挽救突觸丟失、認知功能障礙和焦慮樣行為。當神經炎癥受到抑制或 C1q 中和時，補體也會減少，突觸消失也會中斷。這些研究結果表明，長時間麻醉會引發神經炎癥和補體介導的小膠質細胞突觸吞噬，從而在病理上導致 七氟醚誘導的神經毒性（SIN）中的突觸消失。本文證明了 SIN 的神經形態病理學基礎，這對 PND 患者有直接的治療意義。本文于2023年1月發表在《BMC Medicine》IF: 9.3期刊上

技術路線

主要實驗結果

1、長時間麻醉會引發認知功能障礙和焦慮樣行為

       第一次實驗的時間表如圖1a所示。圖1的MWM、OFT以及EPM實驗表明長時間七氟烷暴露誘導的 SIN 大鼠模型表現出一些神經行為改變，包括認知功能障礙和焦慮樣行為。

圖1 長時間麻醉引起大鼠認知功能障礙和焦慮樣行為

2、長時間麻醉誘導神經炎癥，上調NF-κB炎癥通路，下調神經元興奮性，使凋亡信號失活

       臨床上，PND 主要發生在手術和麻醉后 1 周內。結合行為實驗的結果，在七氟烷暴露后的第一天采集了大鼠的腦組織。ELISA表明，七氟烷暴露后，大腦皮層和海馬中的促炎細胞因子，包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 都增加了（圖 2 A、B）。與對照組相比，Sevo 組海馬中磷酸-NF-κB p65 的表達上調（圖 2 D）。七氟烷暴露后，海馬中 Phospho-NF-κB p65 向細胞核的轉位增加（圖 2 E）。然后，關注七氟烷暴露對神經元的影響，神經元是認知功能的執行細胞基礎。HE 染色顯示，兩組患者海馬中神經元的形態完好無損（圖 2 C）。IF 染色顯示，作為海馬 CA1 區神經元興奮性參數的 C-fos 在七氟醚暴露后下調（圖 2 F）。同樣，腦電圖也顯示海馬中的突發性抑制。圖 2 G 顯示了具有代表性的海馬腦電圖原始軌跡（上圖）和功率頻譜圖（下圖），它們顯示了七氟烷暴露后向突發性抑制的過渡。如圖 2 H 所示，BSR 的顯著增加也證明了這一變化。這種神經興奮性的抑制促使作者探索它是否受到神經元凋亡的影響。七氟醚暴露后，海馬 CA1 區和皮層的 TUNEL 檢測呈陰性，無神經元凋亡（圖 2 I）。Nissl 染色也表明，七氟與對照組海馬 CA1 區的 Nissl 體數量沒有差異（圖 2 J）。凋亡相關蛋白表達也沒有明顯改變（圖2 K-M）。因此，七氟醚暴露對細胞凋亡信號轉導沒有影響。更重要的是，長時間麻醉會誘導神經炎癥激活，激活 NF-κB 炎癥通路，并下調神經元的興奮性。

圖2 長時間麻醉誘導神經炎癥，上調NF-κB炎癥通路，下調神經元興奮性，使凋亡信號失活

3、長時間麻醉誘導小膠質細胞激活，促炎表型標志物增加，抗炎表型標志物減少，海馬小膠質細胞形態改變

       小膠質細胞作為中樞神經系統（CNS）的常駐吞噬細胞，是應激源的第一反應者，它們會迅速調整表型并發生功能變化，并參與 SIN 的病理過程。與對照組相比，七氟醚暴露后海馬中的促炎表型標志物，包括 TNF-α mRNA、IL-1β mRNA、IL-6 mRNA、CD86 mRNA 和 iNOS mRNA 均上調（圖 3 A）。此外，與對照組相比，抗炎表型標記物，包括海馬中的 IL-4 mRNA、IL-10 mRNA、CD206 mRNA 和 Arg1 mRNA 均下調（圖 3 B）。iba1（一種小膠質細胞活化標記物）的 IF 染色顯示，與對照組相比，七氟醚暴露后海馬中的小膠質細胞數量增加（圖 3 C、E），這意味著小膠質細胞活化。與對照組相比，七氟醚暴露后海馬 CA1 區的抗炎標記物 Arg-1 下調（圖 3 D, I）。使用 Sholl 分析來確定海馬 CA1 區的小膠質細胞形態學改變，以確認其激活和功能變化（圖 3 F）。圖中的intersection mask圖描述了小膠質細胞偽足的空間分布和數量（圖 3 F）。七氟烷暴露后，小膠質細胞固縮增加，最大交集數減少（圖 3 G、H），這意味著小膠質細胞面積擴大，小膠質細胞偽足數量減少。交叉圖顯示，七氟烷暴露后，偽足分布更靠近小膠質細胞體（圖 3 K），這說明小膠質細胞偽足回縮。此外，利用小膠質細胞的三維圖像來觀察小膠質細胞的形態學改變。如圖 3 J 所示，小膠質細胞的細胞體增大，偽足減少并變短，七氟烷暴露強烈誘導了這些小膠質細胞形態的改變。

圖3長時間麻醉誘導小膠質細胞激活，促炎表型標志物增加，抗炎表型標志物減少，海馬小膠質細胞形態改變

4、RNA-seq分析顯示長時間麻醉后海馬DEGs富集至不同突觸通路中，突觸相關基因下調

       使用 RNA-seq 篩選通路和基因，以確定導致 SIN 的可能神經形態病理學基礎。令人驚訝的是，KEGG通路富集和GO富集分析都強烈表明，大多數DEGs與不同的突觸或突觸成分有關（圖4）。

圖4 RNA-seq分析顯示，長時間麻醉后海馬DEGs富集至不同突觸通路中，突觸相關基因下調

5、長時間麻醉會增強小膠質細胞的吞噬和趨化能力，并通過補體介導的小膠質細胞修剪導致海馬突觸消失

       根據 RNA-seq 的結果，尋找將突觸丟失與補體介導的小膠質細胞修剪聯系起來的證據。有報道稱，小膠質細胞的突觸修剪可持續監測突觸和大腦發育，補體驅動的病理性突觸修剪也在許多中樞神經系統疾病中有所報道，包括阿爾茨海默病和額顳葉癡呆。首先，作者發現與對照組相比，Sevo 組海馬中的突觸標記物，包括 PSD95 mRNA、SYN1 mRNA 和 SYP mRNA 均出現下調（圖 5 A）。此外，與對照組相比，Sevo 組海馬中的 PSD95、SYN1 和 SYP 蛋白水平也出現了下調（圖 5 E、G-I）。突觸相關蛋白下調，這與 RNA 序列結果一致。隨后證實海馬中的補體標志物，包括 C1qa 和 C3，在蛋白和 mRNA 水平上也出現了上調（圖 5 B、E、F）。其次，CD68 作為小膠質細胞吞噬標記物，在海馬中的蛋白和 mRNA 水平都有所增加（圖 5 C-E）。此外，海馬 CA1 區與 CD68 共定位的小膠質細胞數量也有所增加（圖 5 J、K）。CX3CR1由小膠質細胞和神經元共同表達，介導小膠質細胞的粘附、趨化和遷移功能。第三，與對照組相比，Sevo 組海馬 CA1 區標記有 CX3CR1 的小膠質細胞數量增加（圖 5 M、N）。第四，檢測到七氟烷暴露后海馬 CA1 區小膠質細胞標記 PSD95 的數量增加，表明小膠質細胞吞噬了 PSD95 點（圖 5 L, O, P）。最后，觀察到小膠質細胞定植 C1qa 的數量增加，表明長時間麻醉誘導小膠質細胞產生補體 C1qa（圖 5 Q、R）。因此，吞噬能力增強、活性亢進、粘附性和趨化性增強的小膠質細胞會分泌補體，吞噬不同的突觸，導致突觸丟失和突觸蛋白減少。

圖5 長時間麻醉增強小膠質細胞吞噬和趨化性，然后觸發小膠質突觸吞噬，導致突觸丟失

       有報道稱，C1qa 和 C3 參與突觸丟失，在突觸修剪過程中標記神經元之間不適當的突觸連接，以便被吞噬小膠質細胞清除。在海馬 CA1 區，Sevo 組與對照組相比，標記有 PSD95 點的 C1qa 數量增加（圖 6 A、D），這表明七氟烷暴露誘導了補體介導的突觸修剪。采用 IF 染色法檢測突觸數量和突觸密度。PSD95（突觸后蛋白標記）、SYN1（突觸前蛋白標記）和 SYP（突觸前蛋白標記）用于檢測突觸數量和突觸密度。與對照組相比，Sevo 組海馬 CA1 區的突觸密度（SYN1 點）降低（圖 6 B，F）。此外，七氟醚暴露后海馬 CA1 區的突觸數量（PSD95 與 SYP 點相連）也減少了（圖 6 E、G）。用掃描電鏡觀察突觸的超微結構改變，以檢測突觸小泡、突觸前膜和突觸后膜、活動區和突觸間隙。在 Sevo 組，突觸小泡減少，突觸后膜連續性中斷（圖 6 C）。因此，突觸數量和密度的減少以及突觸超微結構的改變與補體介導的小膠質細胞修剪有關。

       根據 RNA-seq 結果，發現樹突棘和樹突中富集的 DEGs 大多被下調（圖 6 H、I 和圖 4 B）。這顯然表明樹突棘和樹突在七氟烷暴露后受到破壞。使用高爾基染色和 Sholl 分析檢測了海馬 CA1 區樹突棘和樹突的結構變化（圖 6 J）。與對照組相比，Sevo 組樹突棘（蘑菇狀、粗壯狀、細長狀和總狀）的數量減少了（圖 6 K、N）。在 Sholl 分析中，Sevo 組神經元的最大交集數低于對照組（圖 6 L、M）。圖 6 M 顯示了樹突和樹突棘的空間分布和數量。

圖6 長時間麻醉通過補體介導的突觸消融和樹突棘及其基因減少引起海馬突觸消融

6、小膠質細胞耗竭挽救了SIN大鼠的認知功能障礙并改善了焦慮樣行為

       接下來，研究過度活躍的小膠質細胞是否會在認知功能障礙和焦慮樣行為中發揮關鍵作用。第二個實驗的時間表如圖 7 A 所示。利用補充了 PLX3397 的飲食喂養大鼠，以消除小膠質細胞群，同時又不會對正常動物造成明顯的認知損傷。PLX3397能有效減少海馬中的小膠質細胞數量和iba1蛋白水平（圖7 B-D）。在MWM測試中，PLX3397增加了穿越平臺的次數和在平臺象限中游泳的時間，從而緩解了七氟烷暴露造成的認知障礙（圖7 E和F）。在 OFT 試驗中，PLX3397 治療增加了進入中心區的次數和時間，緩解了焦慮和壓力（圖 7 G、H）。在 EPM 試驗中，開放臂的停留時間和進入開放臂的次數增加了，這同樣改善了焦慮樣行為（圖 7 I、J）。令人驚訝的是，小膠質細胞耗竭后，與 SYP 點定位的補體急劇減少，這意味著小膠質細胞耗竭改善了由補體驅動的病理性突觸修剪（圖 7 K、L）。

圖7 小膠質細胞耗竭挽救了SIN大鼠的認知功能障礙并改善了焦慮樣行為

7、RNA-seq分析表明消耗小膠質細胞可挽救海馬突觸相關基因的下調

       為研究小膠質細胞缺失是否能挽救突觸消融，再次使用 RNA-seq 鑒定 DEGs 及其富集，如圖8所示，不出所料，這些 DEGs 和富集途徑也與突觸相關。

圖8 RNA-seq分析顯示，小膠質細胞缺失后海馬中DEGs富集至不同突觸通路，且突觸相關基因上調

8、小膠質細胞缺失改善了NF-κB炎癥通路的激活、海馬炎癥、補體激活和突觸消融

       隨后研究PLX3397 治療是否能破壞小膠質細胞的吞噬功能、炎癥反應、補體生成和突觸丟失。ELISA顯示，海馬中的促炎細胞因子 IL-1β 和 TNF-α 有所減少（圖 9 A、B）。此外，PLX3397 通過下調磷酸-NF-kB p65 的表達，顯著抑制 NF-κB 的炎癥通路（圖 9 E、F）。此外，PLX3397 還能抑制小膠質細胞的吞噬（下調 CD68 表達）和補體生成（圖 9 C、D）。然后，通過 PLX3397 處理消耗小膠質細胞可挽救突觸的消除并恢復突觸蛋白的表達（圖 9 G-J）。因此，PLX3397 誘導的小膠質細胞缺陷阻止了小膠質細胞介導的病理生理效應，包括神經炎癥、補體產生、突觸修剪和突觸消除。

9、神經炎癥抑制拯救突觸消除和抑制補體激活

       消除小膠質細胞和抑制神經炎癥的治療效果可以挽救突觸損失。然而，僅抑制神經炎癥是否能逆轉突觸缺失尚不清楚。使用非甾體抗炎藥美洛昔康（NSAID-meloxicam）來減輕神經炎癥，并檢測抗神經炎癥對突觸缺失的影響。美洛昔康可以有效抑制海馬的神經炎癥（圖 9 M）。令人驚訝的是，神經炎癥抑制還能減少突觸消除，降低補體激活，并挽救突觸蛋白的損失（圖 9 L-P）。同時，神經炎癥抑制后與 PSD95 標記的 C1q 數量急劇下降（圖 9 Q）。因此，通過抑制補體介導的突觸丟失來抑制神經炎癥可以逆轉長期麻醉誘導的病理性突觸損傷。

圖9 小膠質細胞缺失改善了NF-κB炎癥通路的激活、海馬炎癥、補體激活和突觸消融，神經炎癥抑制也挽救了突觸消融

10、C1q中和抑制補體介導的突觸消除和抑制小膠質細胞激活，從而改善SIN大鼠的認知功能障礙和焦慮樣行為

       第四次實驗的時間表如圖10A所示。使用 C1q 中和抗體來減少 C1q 并檢測補體對突觸丟失的影響。ELISA 分析表明，C1q 中和抗體能有效降低海馬中的 C1q 水平（圖 10 G）。WB 分析也證實，C1q 中和抗體能顯著下調海馬中 C1qa 的表達（圖 10 E、H）。在 CFC 中，C1q 中和增加了凝固時間的百分比，從而挽救了七氟烷暴露造成的認知障礙（圖 10 B）。在 OFT 中，C1q 中和增加了進入中心區的次數和時間，從而緩解了焦慮和壓力（圖 10 C、D）。在 C1q 中和的同時，iba1 的表達下調（圖 10 F、I）。同時，海馬中突觸蛋白（PSD95、SYN1 和 SYP）的表達也有所增加（圖 10 J-N）。因此，C1q中和可抑制補體介導的突觸消除和抑制小膠質細胞活化，從而挽救突觸丟失，改善SIN大鼠的認知功能障礙和焦慮樣行為。

圖10 SIN大鼠的C1q中和挽救突觸消融，抑制小膠質細胞激活，改善認知功能障礙和焦慮樣行為

       總之，七氟醚對大鼠的長時間麻醉會引發認知障礙、焦慮樣行為、神經炎癥和補體激活。在長時間麻醉后，海馬中的補體和神經炎癥會導致小膠質細胞突觸消失和樹突棘脫落。海馬中吞噬性和趨化性小膠質細胞明顯增加，C1qa在突觸上聚集，突觸蛋白和基因下調。活化的小膠質細胞具有特定的形態結構和表型，會誘發神經炎癥和補體激活，吞噬突觸，導致突觸丟失。通過 PLX3397 治療消耗小膠質細胞可阻止這一過程。此外，用美洛昔康和 C1q 中和抑制神經炎癥也能挽救突觸丟失。     

圖11 SIN 的發病機理圖。

實驗方法

SD大鼠處理和建模，大鼠飼料中PLX3397配方，美洛昔康注射液，莫里斯水迷宮（MWM），礦場實驗（OFT），高架十字迷宮實驗（EPM），電極放置和海馬局部場電位（LFP）記錄，突發抑制識別與分析，RNA-seq，RT-PCR，ELISA，WB，免疫熒光染色，HE，Nissl染色，TUNEL，掃描電子顯微鏡（SEM），高爾基染色法，Sholl分析和定量形態學

參考文獻

Xu F, Han L, Wang Y, Deng D, Ding Y, Zhao S, Zhang Q, Ma L, Chen X. Prolonged anesthesia induces neuroinflammation and complement-mediated microglial synaptic elimination involved in neurocognitive dysfunction and anxiety-like behaviors. BMC Med. 2023 Jan 5;21(1):7. doi: 10.1186/s12916-022-02705-6.