摘要

       乳腺癌腦轉移（BCBM）是一種致命的疾病，沒有有效的治療方法。先前的研究表明，腦癌和轉移瘤密集地浸潤著抗炎、促腫瘤的腫瘤相關巨噬細胞，但大腦駐留小膠質細胞的作用仍然存在爭議，因為它們很難與其他腫瘤相關巨噬細胞區分開來。利用單細胞 RNA 測序、遺傳和人源化小鼠模型，我們專門鑒定了小膠質細胞，并發現它們在 BCBM 中發揮著獨特的促炎癥和腫瘤抑制作用。缺乏小膠質細胞的動物表現出轉移增加、存活率降低以及自然殺傷細胞和 T 細胞反應減少，這表明小膠質細胞對于促進抗腫瘤免疫以抑制 BCBM 至關重要。我們發現促炎癥反應在人類小膠質細胞中是保守的，并且其反應標志物與 BCBM 患者更好的預后相關。這些發現確立了小膠質細胞在抗腫瘤免疫中的重要作用，并強調它們作為腦轉移的潛在免疫治療靶點。

       該研究于2023年11月發表在《Nature cell biology》，IF：21.3。

技術路線

結果

1、BCBM 中 TAMs 的單細胞分析

       我們使用 scRNA-seq 通過 MDA-MB-231-BR (231BR) 模型來測試小膠質細胞對 BCBM 的反應。在此模型中，綠色熒光蛋白（GFP）標記的231BR細胞通過心內注射遞送至動脈循環，并在第28天形成實質腦轉移（圖1a，b）。與人類 BCBM 一樣，轉移灶被離子化鈣結合接頭分子 1 (IBA1+) TAMs 高度浸潤（圖 1b、c）。對于 scRNA-seq，從對照和腦轉移分離細胞，并通過流式細胞術分離髓系細胞（圖 1d）。將癌細胞和星形膠質細胞作為對照（圖 1d）。對通過質量控制過濾的 42,891 個細胞的分析揭示了由經典的marker識別的七種不同的細胞類型（圖 1e、f）。這包括目標細胞類型：星形膠質細胞（Aldoc 和 Atp1a2）、小膠質細胞（Tmem119 和 P2ry12）和非小膠質細胞髓系細胞（Lyz2 和 Plac8）（圖 1e、f）。我們還回收了少量室管膜細胞（Ccdc153和Rarres2）、少突膠質細胞（Mbp和Ptgds）、血管細胞（Cldn5和Vtn）和淋巴細胞（Cd3g和Gzma）（圖1e、f）。淋巴細胞和非小膠質髓系細胞群優先來自轉移狀態，表明這些細胞是從外周招募的。我們發現對照和腦轉移的星形膠質細胞聚類差異有限。

圖1| BCBM 中 TAMs 的單細胞分析。

2、小膠質細胞對 BCBM 表現出強烈的促炎癥反應

       與星形膠質細胞相反，對髓系細胞的分析揭示了對照和轉移條件的強烈分離（圖2a）。通過由 Bowman 等人 (2016) 開發的特征，對每個細胞的核心小膠質細胞特征進行評分，將小膠質細胞與其他髓系細胞群區分開來（圖 2b）。這確定了兩個大的小膠質細胞群體（Tmem119、P2ry12、Sparc 和 Gpr34），其中一個包含來自對照和腦轉移的小膠質細胞，另一個幾乎完全來自腦轉移（圖 2a、b）。我們還發現了兩個小膠質細胞群體，它們的應激反應增加，這是組織操作后常見的。還鑒定出中性粒細胞（Camp 和 S100a9）、單核細胞/巨噬細胞（Ly6c2 和 Lyz2）、成熟樹突細胞（Ccr7 和 Flt3）和 B 細胞（Igkc 和 Cd79a）（圖 2b)。

       對小膠質細胞的進一步分析揭示了 BCBM 的劇烈變化。我們鑒定了對照和腦轉移小膠質細胞之間差異表達的 3,715 個基因。基因本體論 (GO) 分析表明，最上調的途徑與促炎癥反應相關，例如“細胞因子產生”、“抗原加工和呈遞”和“對 IFN-β 的反應”（圖 2c）。進一步的分析表明，并非所有小膠質細胞都一致上調這些程序。我們使用了一種稱為潛在狄利克雷分配（LDA）的概率聚類方法，也稱為主題建模，來評估小膠質細胞異質性（圖2d）。與標準細胞聚類方法不同，主題建模將每個細胞分配給多個基因模塊或主題，這可以更好地了解不同但重疊的基因模塊在細胞群體中的表達方式。該分析確定了四個核心主題。主題 12 是最廣泛上調的，代表干擾素 (IFN) 反應程序（Bst2、Ifitm3、Ifit3b 和 Isg15），此前已在其他疾病背景下小膠質細胞報道過該程序（圖 2e-g）。這可能代表了小膠質細胞對轉移性浸潤和組織損傷的最初感知。主題 15 顯示出更受限的表達模式，并且富含與抗原呈遞 (AP) 相關的基因（Cd74、H2-Aa 和 H2-D1）（圖 2e-g），這也在神經膠質瘤和阿爾茨海默病中觀察到。 AP 基因使 AP 能夠作用于 T 細胞，這就提出了小膠質細胞是否向中樞神經系統中的 T 細胞呈遞抗原的問題。主題 14 由一小部分小膠質細胞表達，并與分泌表型相關（圖 2e-g）。該主題富集了與外泌體（Cd63）、脂質代謝（Apoe 和 Lpl）和細胞因子（Spp1、Csf1、Il1b 和 Tnf）相關的基因（圖 2e，g）。這個主題與疾病相關小膠質細胞或“DAM”的特征強烈重疊，“DAM”是在神經退行性變中發現的一群吞噬細胞小膠質細胞。 IFN 反應和 AP 主題均包括編碼多種免疫細胞運輸趨化因子的基因（圖 2e、g）。最后一個主題（主題 3）富含核糖體基因，這可能表明細胞的轉錄能力或應激反應增加。這些數據表明，小膠質細胞上調多種促炎癥程序，表明它們在 BCBM 的免疫反應中發揮著不同的作用。

圖2|小膠質細胞對 BCBM 表現出強烈的促炎癥反應

3、小膠質細胞反應在不同的 BCBM 模型中是保守的

       我們通過流式細胞術、原位免疫熒光（IF）和細胞因子陣列在蛋白質水平驗證了小膠質細胞促炎癥反應。我們通過流式細胞術評估了三個關鍵標志物：骨髓基質抗原 2 (BST2)、主要組織相容性復合物 II (MHC-II) 和 CD74 。我們發現每個標記的表達增加在五種不同的 BCBM 模型中是保守的（圖 3a），顯示小膠質細胞對轉移的保守性。

       我們使用多重 IF 系統（索引聯合檢測，CODEX）進行原位驗證。我們對 MHC-II、CD74 和 IFN 刺激基因 15 (ISG15) 以及 TMEM119 和 GFP 進行共染色，以分別識別小膠質細胞和腫瘤細胞。我們發現促炎性小膠質細胞位于腫瘤細胞的近端，而遠端小膠質細胞呈陰性（圖3b，c）。小膠質細胞共表達所有三種標記的頻率最高（MHC-II+ CD74+ ISG15+，29%）（圖3c）。我們還觀察到僅表達 AP 標記物（MHC-II+ CD74+ ISG15?，11%）或 IFN 反應標記物（MHC-II? CD74? ISG15+，11%）的小膠質細胞亞群（圖 3c）。這些數據與我們的主題模型一致，顯示出明顯的標記重疊，但 AP 和 IFN 反應程序對小膠質細胞的不同子集具有顯著的排他性。

       我們使用細胞因子陣列研究了小膠質細胞的促炎功能。與我們的 scRNA-seq 一致，我們發現來自腫瘤大腦的小膠質細胞上調多種促炎細胞因子，包括巨噬細胞集落刺激因子 (CSF1)、趨化因子配體 5 (CCL5)、趨化因子配體 9 (CXCL9) 和趨化因子配體 10 （CXCL10）（圖3d）。總而言之，這些數據在蛋白質水平上驗證了我們的 scRNA-seq 結果，并證明小膠質細胞對 BCBM 表現出促炎癥反應。

圖3|小膠質細胞促炎癥反應在不同的 BCBM 模型中是保守的

4、缺乏小膠質細胞的動物顯示腫瘤進展加快

       先前的工作確定了 TAMs 在腦癌和轉移中的促腫瘤作用。這些研究主要利用 CSF1R 抑制劑和針對小膠質細胞和其他類型 TAMs1 的 CX3CR1 靶向基因消融策略。最近開發了一種遺傳模型，由于 Csf1r 基因座中稱為 fms 內含子調節元件 (FIRE) 的關鍵超級增強子的缺失，該模型特別缺乏小膠質細胞（圖 4a）。Csf1rΔFIRE/ΔFIRE（FIRE-敲除(KO)）模型缺乏小膠質細胞，同時保留了大多數大腦駐留巨噬細胞和骨髓來源的髓系細胞，我們通過流式細胞術證實了這一點（圖 4b）。我們通過比較 FIRE 野生型 (WT) 和 FIRE-KO 動物的腫瘤進展，研究了小膠質細胞在 BCBM 中的作用。給小鼠注射 GFP 和熒光素酶標記的 EO771 細胞，并通過體內生物發光 (IVIS) 進行監測（圖 4c）。令人驚訝的是，許多 FIRE-KO 小鼠很快出現了晚期疾病的明顯臨床癥狀（圖 4d，e）。 14 只 FIRE-KO 小鼠中有 5 只在終點前死亡（死亡率為 36%），而所有 19 只 FIRE-WT 小鼠均存活（死亡率為 0%）（圖 4d）。與 FIRE-WT 相比，存活的 FIRE-KO 小鼠的體重也減少了 20% 以上，表明發病率增加（圖 4e）。 IVIS 成像揭示了腫瘤生長動力學隨時間的變化。我們在 19 只 FIRE-WT 小鼠中的 8 只中觀察到腫瘤抑制，而所有 14 只 FIRE-KO 動物中的信號持續增加（圖 4f）。我們使用連續稀釋方法進一步比較了 FIRE-KO 和 FIRE-WT 小鼠的腫瘤移植情況。這表明與 FIRE-WT 小鼠相比，FIRE-KO 小鼠的移植效率更高，腫瘤生長更大。總之，這些數據表明，缺乏小膠質細胞的動物表現出腫瘤生長和植入增加，以及腫瘤抑制能力下降。

圖4|缺乏小膠質細胞的動物表現出腫瘤抑制能力降低

5、小膠質細胞促進 NK 和 T 細胞對 BCBM 的反應

       鑒于我們在 FIRE-KO 小鼠中觀察到腫瘤抑制減少，我們假設小膠質細胞通過 T 細胞促進腫瘤抑制。我們通過確定 FIRE-KO 小鼠是否表現出對 BCBM 的 T 細胞反應減弱來檢驗這一假設。我們將 EO771 細胞注射到 FIRE-WT 和 FIRE-KO 動物中，并在第 7 天開始觀察腫瘤抑制時通過流式細胞術比較大腦中 NK、T 和骨髓細胞群的數量和頻率（圖 5a）。盡管離體分析顯示此時腫瘤大小沒有顯著差異，但 FIRE-KO 小鼠所有 T 細胞亞群的數量和頻率均減少，包括 CD4+、CD8+ 和 T 調節性 (Treg) 細胞（圖 5b,c)。 FIRE-KO 動物中 NK 和 NKT 細胞幾乎完全不存在（圖 5b、c）。功能標記物分析顯示 FIRE-KO 中 CD8+ 和 CD4+ 效應器以及中央記憶 T 細胞的數量持續減少。我們還發現 FIRE-KO 中脫粒 CD107a+ NK 和 CD8+ 細胞的數量顯著減少（圖 5d）。 CD11b+ Ly6c+ 單核細胞的分析顯示 FIRE-WT 和 FIRE-KO 之間的數量沒有顯著差異。進一步分析表明，FIRE-WT 中 CD8+ T 細胞頻率與 Tregs 呈負相關，但在 FIRE-KO 中呈正相關。這意味著，在 FIRE-WT 中，具有較多 CD8+ T 細胞的小鼠具有較少的 Tregs，而在 FIRE-KO 中，具有較多 CD8+ T 細胞的小鼠也具有較多的 Tregs。因此，在沒有小膠質細胞的情況下，CD8+ T 細胞誘導腫瘤抑制的效果可能較差，因為存在相對較多的免疫抑制性 Tregs。總之，這些數據表明小膠質細胞通過支持 NK、NKT 和 T 細胞對 BCBM 的反應來促進抗腫瘤免疫微環境。

圖5|小膠質細胞促進 NK 和 T 細胞對 BCBM 的反應

6、小膠質細胞和 T 細胞協調抗腫瘤反應

       我們通過評估缺乏 T 細胞的 FIRE-WT 動物的腫瘤生長，進一步研究了小膠質細胞的腫瘤抑制作用是否是通過 T 細胞介導的。我們使用兩種方法來靶向T細胞，用S1P抑制劑（FTY720）治療（阻止T細胞運輸到CNS），以及缺乏T細胞的RAG1-KO小鼠（圖6a）。首先在第 0 天給動物注射 EO771 細胞。從第 0 天開始每天注射 FTY720 和載體，直到第 12 天結束。流式細胞術分析證實使用這兩種方法都可以消除大腦中的 T 細胞（圖 6b）。小膠質細胞和單核細胞的頻率在各組之間沒有顯著差異。在FTY720和RAG1-KO組中，我們發現相對于對照動物，腫瘤植入和腫瘤負荷增加（圖6c、d）。這表明，在沒有 T 細胞的情況下，充滿小膠質細胞的動物抑制 BCBM 的能力較差，這表明小膠質細胞至少部分通過支持 T 細胞反應來抑制 BCBM。

       我們還發現 WT 和 T 細胞缺陷動物之間小膠質細胞標記物表達存在有趣的差異。 FTY720 處理小鼠的小膠質細胞顯示 AP 標記物 MHC-II+ 和 CD74+ 的百分比分別降低了 3.1 倍和 1.6 倍（圖 6e）。這些蛋白質的表達減少在 RAG1-KO 小鼠中更為明顯（圖 6e），表明這不僅僅是 FTY720 治療的效果。此外，FTY720處理的小鼠和RAG1-KO小鼠的IFN反應蛋白BST2陽性小膠質細胞的百分比分別是2倍和9.4倍（圖6e）。這表明T細胞可能需要完全許可小膠質細胞上調 AP 程序，如果沒有 T 細胞，小膠質細胞僅限于 IFN 反應程序。

圖6|小膠質細胞和 T 細胞協調抗腫瘤反應

7、缺乏 T 細胞的動物中小膠質細胞活化的改變

       我們使用 scRNA-seq 來確定 AP 程序的小膠質細胞上調是否依賴于 T 細胞浸潤。我們將 EO771 細胞移植到 C57BL/6 和 RAG1-KO 小鼠中，并在第 4 天和第 10 天這兩個時間點評估分選的免疫細胞中的基因表達（圖 7a）。聚類和標記基因分析確定了九種主要免疫細胞類型（圖 7b）。亞群分析顯示，從第 4 天到第 10 天，T 細胞的頻率增加了 2 倍以上，表明隨著腫瘤進展，T 細胞浸潤增加。 RAG1-KO 小鼠中未檢測到 T 細胞。我們還發現 T 細胞多樣性從第 4 天到第 10 天劇烈擴展。最值得注意的是naive T 細胞的減少以及增殖和 CD8 效應 T 細胞的增加，表明大腦中激活 T 細胞的相對頻率隨著時間的推移而增加。

       我們對小膠質細胞進行了亞群分析，以確定它們的基因表達如何隨著時間的推移與 T 細胞激活并行變化（圖 7b）。小膠質細胞的亞聚類顯示出與我們之前確定的相似的群體（圖7b）。我們對數據集中每個小膠質細胞的與每個主題相關的 top 基因的表達、IFN 反應、分泌和 AP 進行評分（圖 7c）。這表明，在 C57BL/6 動物中，從第 4 天到第 10 天，所有三個程序都隨著時間的推移而增加。在第4天，我們觀察到分泌程序的平均得分最高，AP程序的平均得分最低，這表明在早期時間點，比AP程序更多的小膠質細胞表達分泌（圖7c）。我們發現缺乏 T 細胞的 RAG1-KO 小鼠的小膠質細胞中 AP 程序僅限于不表達（圖 7c-f）。相反，我們發現 C57BL/6 和 RAG1-KO 小鼠中分泌和 IFN 反應程序的表達相似，表明 AP 而不是分泌和 IFN 反應程序依賴于淋巴細胞。每個程序的 top 標志物顯示出相似的模式，其中大量小膠質細胞在第4天表達CD63（分泌）和BST2（IFN反應），但有限的小膠質細胞表達CD74（AP）（圖7d-f）。偽時間分析（Monocle）表明，小膠質細胞遵循從穩態到分泌和干擾素反應的過程，最終以 AP 和循環簇結束（圖 7g）。這些數據支持這樣一種模型：小膠質細胞最初上調分泌和干擾素反應程序以響應大腦中癌細胞的出現，隨后在淋巴細胞浸潤后上調 AP 基因。這可能有助于維持大腦局部 T 細胞的激活，并解釋為什么小膠質細胞損失會導致 T 細胞反應減弱。值得注意的是，我們還觀察到免疫抑制細胞（Treg 和單核細胞）在稍后時間點的擴增，這可能會抵消抗腫瘤免疫并解釋為什么腫瘤在某些動物中繼續生長。

圖7|缺乏 T 細胞的動物中小膠質細胞活化的改變

8、促炎癥反應在人類小膠質細胞中是保守的

       我們研究了人類小膠質細胞的促炎癥反應及其與 BCBM 患者的相關性。我們基于先前的工作開發了 BCBM 人源化小鼠模型，其中 MITRG 小鼠（人 CSF1、IL3 和 TPO 敲入 Rag2?/?Il2rγ?/? 小鼠）在移植人誘導多能性后用人小膠質細胞和巨噬細胞重建-衍生的造血祖細胞（iHPSC）進入出生后大腦。與 BCBM 患者樣本相比，我們能夠使用這些動物來研究人類小膠質細胞對腫瘤發生的初始反應。我們給 MITRG 小鼠幼崽注射了 GFP 標記的 iHPSC，使其植入 10 周，并在心內注射了 mCherry 標記的 231BR 細胞（圖 8a）。 3周后收集對照小鼠和轉移小鼠，熒光顯微鏡證實了 GFP+ 人小膠質細胞和 mCherry+ 231BR 轉移瘤的植入。隨后分離并捕獲人類細胞進行測序（圖8a）。

       聚類和標記基因分析揭示了一個獨特的 231BR 細胞群 (VIM) 和幾個髓系細胞群（圖 8b）。這些包括人血管周圍巨噬細胞（CD163）、小膠質細胞（TMEM119、P2RY12）和增殖性髓系細胞群（MKI67）（圖8b）。我們鑒定出 4,904 個基因在對照大腦和轉移大腦的小膠質細胞之間存在差異表達。 GO分析顯示，與在小鼠中觀察到的類似途徑在人類小膠質細胞中上調（圖8c）。我們使用基因評分來研究人類小膠質細胞的異質性和小鼠 BCBM 中上調的核心主題的表達（圖 2d-f）。這表明，人類小膠質細胞亞群中的 IFN 反應、AP 和分泌程序有明顯但重疊的表達，就像在小鼠中觀察到的那樣。重要的是，該模型中 IFN 反應和 AP 主題的上調并不像在小鼠小膠質細胞中觀察到的那樣強勁。這與 MITRG 小鼠中更嚴重的免疫缺陷以及我們的發現一致，即 T 細胞對于小膠質細胞激活很重要。

       我們使用人類 BCBM 腫瘤的批量 RNA-seq 數據集比較了 BCBM 患者小膠質細胞特征的預后相關性。我們發現，典型小膠質細胞標志物高表達的患者的總體生存率顯著提高，這表明小膠質細胞浸潤增加與更好的預后相關（圖8d）。我們進一步發現，AP (MHC-II) 和分泌程序 (CSF1) 關鍵基因特征的較高表達與總生存期增加相關，而 IFN 反應基因 BST2 的較高表達與生存期下降相關。這些數據表明，小膠質細胞促炎癥反應對患者具有臨床益處，并支持以下假設：T 細胞激活小膠質細胞（即上調 AP 程序）是抗腫瘤小膠質細胞的關鍵特征，并且不完全激活（即僅 IFN 應答計劃）會導致更糟糕的結果。總之，我們的研究支持一個模型，其中小膠質細胞對于支持 CNS 中的抗腫瘤免疫反應和抑制 BCBM 至關重要（圖 8e）。

圖8|促炎癥反應在人類小膠質細胞中是保守的，并且與 BCBM 患者更好的預后相關。

實驗方法

BCBM、IF 分析、CODEX 成像、scRNA-seq、流式細胞術分析、iHPCs、MULTI-seq、FTY720 HCl 給藥、細胞因子篩選、聚類和差異表達、GO術語分析和基因評分、LDA topic模型、擬時序分析、生存分析。

參考文獻

Evans, K.T., Blake, K., Longworth, A. et al. Microglia promote anti-tumour immunity and suppress breast cancer brain metastasis. Nat Cell Biol (2023).