銅是生物體必需的微量元素，參與細(xì)胞生長和代謝。銅穩(wěn)態(tài)失調(diào)與多種腫瘤相關(guān)，癌癥患者血清銅水平升高與癌癥分級和化療耐藥相關(guān)。如果銅的濃度超過一定的閾值，就會產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡形式，即銅中毒。當(dāng)銅直接與三羧酸循環(huán)的脂基化組分結(jié)合時(shí)，就會發(fā)生銅死亡，導(dǎo)致隨后含鐵-硫簇的蛋白質(zhì)喪失、蛋白毒性應(yīng)激并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鐵氧化還原蛋白1（FDX1）編碼一種還原酶，可將Cu²⁺還原為毒性更強(qiáng)的Cu¹⁺；硫辛酸二氫硫辛酰胺S-乙酰轉(zhuǎn)移酶（DLAT）是銅中毒所必需的酶。然而，細(xì)胞凋亡在腫瘤中的啟動、傳播和執(zhí)行機(jī)制仍不清楚。m6A是真核細(xì)胞中最豐富的RNA修飾，在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用。METTL16在多種腫瘤中以m6A依賴的方式表現(xiàn)出腫瘤發(fā)生和促進(jìn)腫瘤的能力，但控制METTL16活性的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。乳酸源性乳糖化是新近發(fā)現(xiàn)的一種翻譯后修飾（PTM）。乳酸被腫瘤細(xì)胞攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體進(jìn)行氧化提供能量，同時(shí)衍生組蛋白賴氨酸殘基的乳糖化來刺激基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白乳糖化修飾已被證明涉及多個(gè)病理過程，如巨噬細(xì)胞極化和腫瘤發(fā)生。細(xì)胞中非組蛋白的豐度和特異性仍高于組蛋白。非組蛋白是否存在大量的乳糖化修飾，以及這些乳糖化的非組蛋白如何在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮作用和被調(diào)節(jié)，這些都亟待探索。該研究發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。

技術(shù)路線

結(jié)果

1. 胃癌組織中銅含量較高，且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)

       銅死亡是由銅濃度過高引起的，但銅死亡在腫瘤中的調(diào)控機(jī)制仍需探索。由于銅主要通過胃和小腸上部吸收，因此胃腸道系統(tǒng)的腫瘤適合研究銅突的發(fā)生和傳播。研究者分析了48對胃癌組織和癌旁組織中的銅濃度，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的銅濃度高于正常胃組織（圖1a）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ⅲ期胃癌患者的相對銅含量高于ⅰ期和ⅱ期胃癌患者（圖1b），表明銅含量與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。此外，銅含量與胃癌患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）呈負(fù)相關(guān)（圖1c, d）。同時(shí)，銅含量與細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)（圖1e）。同樣，銅含量與患者血清標(biāo)本中的血小板/淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值呈正相關(guān)，兩者都是與炎癥相關(guān)的胃癌侵襲性惡性腫瘤的預(yù)后生物標(biāo)志物（圖1f, g）。這些結(jié)果表明，銅的高含量參與了氣相色譜的發(fā)生和發(fā)展。

       此外，研究者還檢測了銅在不同GC類型中的濃度差異，尤其是在惡性腫瘤中。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)黏液腺癌中的銅濃度高于整個(gè)胃腫瘤（圖1h）。黏液腺癌是胃癌的一種罕見組織學(xué)亞型，與非黏液腺癌相比，黏液腺癌的分期更晚，5年OS和DFS更差。黏液腺癌作為一種難治性胃癌，具有放化療抵抗的特點(diǎn)，迫切需要更有效的治療方法。

       最近，研究人員發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的高銅濃度觸發(fā)了還原酶FDX1，將Cu²⁺還原為毒性更強(qiáng)的Cu¹⁺，導(dǎo)致銅死亡。研究者發(fā)現(xiàn)FDX1在胃癌中的蛋白水平高于正常胃組織（圖1k）。由于FDX1蛋白水平和銅含量在GC中都較高，因此可能更容易觸發(fā)銅突。這為胃癌尤其是惡性腫瘤——黏液腺癌提供了潛在的治療策略。

圖1 胃癌組織中銅含量較高，且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)

2. METTL16是銅死亡的關(guān)鍵介導(dǎo)因子

       有研究表明，與良性胃病患者和健康對照患者相比，胃癌患者的總m6A水平顯著升高，并促進(jìn)胃癌的發(fā)生、生長、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移甚至多藥耐藥的過程。此外，m6A修飾還參與多種細(xì)胞死亡類型，包括凋亡、壞死性凋亡、鐵死亡和焦亡。然而，m6A修飾與銅死亡的關(guān)系尚不清楚。有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)銅含量與GC組織中總m6A水平呈正相關(guān)（圖2a）。此外，銅顯著上調(diào)胃癌細(xì)胞中m6A修飾的總水平（圖2b）。鑒于甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白（METTL）家族在促進(jìn)m6A修飾中起主導(dǎo)作用，研究者分析了以1:1的比例用來來洛莫/雙硫侖和銅處理METTL敲低的細(xì)胞時(shí)的活力。結(jié)果表明，METTL16敲低導(dǎo)致對來來洛莫/雙硫侖-銅處理的耐藥性（圖2c-e）。此外，在對照組和METTL16敲低的細(xì)胞中，四硫鉬酸鹽處理均抑制了銅綠假單胞菌脫除，表明METTL16參與了銅綠假單胞菌脫除（圖2f）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，研究者成功構(gòu)建并驗(yàn)證了METTL16敲除克隆細(xì)胞系，觀察到與METTL16敲除細(xì)胞相似的結(jié)果（圖2g, h）。這些結(jié)果表明，METTL16在銅突病中起著至關(guān)重要的作用。

圖2 METTL16是銅死亡的關(guān)鍵介導(dǎo)因子

3. METTL16通過靶向FDX1促進(jìn)銅死亡

       METTL16在許多轉(zhuǎn)錄本中負(fù)責(zé)m6A的沉積。因此，研究者在穩(wěn)定的Ctrl-Sh和METTL16-Sh細(xì)胞系中進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）測序（圖3a）。使用HOMER軟件預(yù)測每個(gè)樣本中潛在的m6A修飾，m6A修飾主要映射到經(jīng)典的GGAC基序（圖3b）。根據(jù)MeRIP-seq結(jié)果，研究者進(jìn)一步分析了mRNA的總m6A分布模式，發(fā)現(xiàn)m6A峰主要富集在CDS和3'UTR區(qū)域。GO富集分析顯示METTL16修飾基因富集的前15條通路，其中部分與線粒體通路相關(guān)（圖3c）。此外，研究者從METTL16-sh組中鑒定出10個(gè)典型的與m6A甲基化水平低以及mRNA水平下調(diào)相關(guān)的因子（圖3d）。qPCR分析顯示，在METTL16-Sh細(xì)胞中，F(xiàn)DX1、MTF1、PDHB、ATP7A和DLD的mRNA水平降低。與對照細(xì)胞相比，F(xiàn)DX1在METTL16-sh細(xì)胞中表現(xiàn)出最顯著的mRNA水平降低（圖3e）。此外，在METTL16-Sh或-KO細(xì)胞中檢測到FDX1的蛋白水平顯著降低（圖3f, g）。考慮到FDX1是銅離子載體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，研究者推測METTL16誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是FDX1依賴的。

       接下來，研究者評估了METTL16是否通過影響FDX1的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。鑒于蛋白質(zhì)脂化是銅胞嘧啶的關(guān)鍵因素，研究者使用硫辛酸特異性抗體作為DLAT脂化的指標(biāo)，評估了METTL16敲低是否影響蛋白質(zhì)脂化。結(jié)果表明，如免疫印跡測定的那樣，METTL16敲低導(dǎo)致DLAT脂化降低（圖3h）。此外，F(xiàn)DX1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了在來來洛莫/雙硫侖-cu處理后，METTL16敲低和敲除細(xì)胞系中銅突亡的拮抗作用（圖3i, j）。FDX1敲低可抑制METTL16過表達(dá)誘導(dǎo)的銅突（圖3k）。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明METTL16通過靶向FDX1促進(jìn)銅死亡。

圖3 METTL16通過靶向FDX1促進(jìn)銅突

4. METTL16通過對FDX1 mRNA的m6A修飾促進(jìn)FDX1的積累

       為了進(jìn)一步探索METTL16如何調(diào)控m6A修飾進(jìn)而影響FDX1 mRNA水平，研究者進(jìn)行了基因特異性MeRIP-qPCR檢測。研究者發(fā)現(xiàn)，在METTL16敲低和敲除細(xì)胞中，F(xiàn)DX1 mRNA上的m6A水平顯著降低，而在轉(zhuǎn)染METTL16過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中，F(xiàn)DX1 mRNA上的m6A水平顯著升高（圖4a, b）。當(dāng)用ActD停止轉(zhuǎn)錄時(shí)，METTL16敲低細(xì)胞中FDX1 mRNA的衰減速率比對照細(xì)胞快（圖4c）。這些結(jié)果表明，METTL16介導(dǎo)的甲基化導(dǎo)致FDX1 mRNA的穩(wěn)定性。對FDX1富集的m6A峰的綜合基因組學(xué)觀察(IGV)分析顯示，與對照細(xì)胞相比，METTL16-sh細(xì)胞中的m6A水平降低，表明METTL16可能促進(jìn)FDX1在CDS或3'UTR區(qū)域的m6A修飾（圖4d）。因此，研究者將FDX1的部分CDS和3'UTR區(qū)融合到pGL3熒光素酶報(bào)告基因的下游，構(gòu)建FDX1-WT熒光素酶報(bào)告基因。共轉(zhuǎn)染FDX1熒光素酶報(bào)告基因和不同劑量的METTL16-OE質(zhì)粒，研究者發(fā)現(xiàn)METTL16顯著促進(jìn)FDX1熒光素酶的活性（圖4e）。

       為了進(jìn)一步研究，研究者使用基于序列的m6A修飾位點(diǎn)預(yù)測器SRAMP預(yù)測了FDX1 mRNA上可能的m6A修飾位點(diǎn)。綜合圖4e中的預(yù)測結(jié)果和數(shù)據(jù)，研究者確定了兩個(gè)潛在的m6A修飾位點(diǎn)，它們的置信度非常高:位于CDS區(qū)域的位點(diǎn)602a和位于FDX1轉(zhuǎn)錄本UTR區(qū)域的位點(diǎn)820 A（圖4f, g）。接下來用特異性引物進(jìn)行的MeRIP-qPCR分析證明，F(xiàn)DX1轉(zhuǎn)錄本上的602位點(diǎn)是METTL16介導(dǎo)的甲基化的直接底物（圖4h）。此外，研究者基于FDX1-WT熒光素酶報(bào)告基因，通過將m6A基序中的特異性腺苷（A）替換為胸腺嘧啶（T），設(shè)計(jì)并構(gòu)建了FDX1-602-Mut和FDX1-820-Mut熒光素酶報(bào)告基因（圖4g）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明METTL16不能促進(jìn)602位點(diǎn)突變的FDX1-CDS/UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性（圖4i）。GEPIA數(shù)據(jù)庫中METTL16和FDX1的表達(dá)分析表明，METTL16和FDX1在GC中呈正相關(guān)（圖4j）。此外，免疫組織化學(xué)染色顯示，在包含54對胃癌和癌旁正常組織的組織芯片中，METTL16和FDX1的表達(dá)呈正相關(guān)（圖4k）。綜上所述，這些結(jié)果證實(shí)了METTL16介導(dǎo)的FDX1 mRNA的m6A修飾對FDX1 mRNA的穩(wěn)定性至關(guān)重要。

圖4 METTL16通過對FDX1 mRNA的m6A修飾促進(jìn)FDX1的積累

5. 在銅脅迫下，METTL16在K229處發(fā)生乳酸化

       接下來，研究者評估了METTL16是否對GC中的銅脅迫有響應(yīng)。在銅處理后，METTL16的mRNA和蛋白水平?jīng)]有變化，但FDX1的蛋白水平顯著增加（圖5a, b）。為了驗(yàn)證在銅脅迫下FDX1表達(dá)的上調(diào)是否依賴于METTL16，研究者檢測了在銅存在或不存在的情況下，METTL16敲低或敲除細(xì)胞中FDX1蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，METTL16缺陷消除了銅誘導(dǎo)的FDX1上調(diào)（圖5c, d）。由于METTL16的mRNA和蛋白水平在銅脅迫下沒有變化，研究者隨后使用質(zhì)譜檢測了METTL16的PTM的變化。分析顯示METTL16蛋白序列上有11個(gè)乳糖化位點(diǎn)和2個(gè)乙酰化位點(diǎn)（圖5e）。在乳酸處理后，6個(gè)乳糖化位點(diǎn)的PTM水平顯著升高，這意味著這6個(gè)位點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞中可能受到調(diào)控。然后，研究者證實(shí)了銅脅迫下存在乳糖化或乙酰化反應(yīng)。結(jié)果表明，銅處理顯著增加了METTL16的乳糖化水平而不是乙酰化水平（圖5f）。為了確定METTL16在銅相關(guān)代謝中重要的乳化位點(diǎn)，研究者產(chǎn)生了這6個(gè)乳化位點(diǎn)的乳化缺陷突變體（K→R）和K410。研究者發(fā)現(xiàn)，只有METTL16-K229R突變體在銅脅迫下顯示出乳糖化降低（圖5g）。隨后，LC-MS/MS分析顯示METTL16-K229與其他乳糖化位點(diǎn)的b-y離子匹配圖見圖5e（圖5h）。為了進(jìn)一步證實(shí)銅脅迫下METTL16-K229的乳糖化，研究者制備了METTL16 lacty-K229抗體，并利用lacty-K229肽段和表達(dá)METTL16-WT、-K229R或-K229E的細(xì)胞驗(yàn)證了其有效性和特異性（圖5i, j）。銅和乳酸處理均誘導(dǎo)K229處METTL16的強(qiáng)乳糖化（圖5k, l），表明K229是銅相關(guān)代謝中必不可少的乳糖化位點(diǎn)。這些結(jié)果表明，在銅脅迫下，METTL16在K229發(fā)生乳酸化。

       在穩(wěn)定的METTL16挽救細(xì)胞系中，F(xiàn)DX1蛋白水平進(jìn)一步得到保證，其中內(nèi)源性METTL16被野生型（WT）、乳酸化缺陷型（K229R）或乳酸化模擬型（K229E）取代。結(jié)果顯示，F(xiàn)DX1蛋白水平在METTL16 -敲低的細(xì)胞中降低，在METTL16-WT或-K229E拯救細(xì)胞后恢復(fù)，但在METTL16-K229R拯救細(xì)胞后沒有恢復(fù)（圖5m）。銅脅迫誘導(dǎo)METTL16-K229乳糖化，促進(jìn)METTL16甲基轉(zhuǎn)移酶活性。

圖5 在銅脅迫下，METTL16在K229處發(fā)生乳酸化

6. SIRT2使METTL16- k229脫酰化并抑制METTL16活性

       上述數(shù)據(jù)證實(shí)銅激活METTL16-K229的乳糖化，但具體參與腫瘤細(xì)胞的乳糖化酶和乳糖化轉(zhuǎn)移酶尚不清楚。研究者研究了銅是否介導(dǎo)了對METTL16的乳糖基轉(zhuǎn)移酶或脫乳糖基酶的調(diào)節(jié)。SIRT2被鑒定為METTL16的結(jié)合蛋白，是一種典型的去乙酰化酶，分為主要的脫乙酰酶和乳糖基轉(zhuǎn)移酶組（圖6a）。EIF3b也被鑒定為METTL16的結(jié)合蛋白，這與之前的研究一致。為了研究和驗(yàn)證METTL16和SIRT2之間的相互作用，研究者在HGC-27細(xì)胞中檢測到METTL16-SIRT2的結(jié)合（圖6b）。METTL16-SIRT2的直接關(guān)聯(lián)通過His-pull-down試驗(yàn)得到驗(yàn)證（圖6c）。SIRT2過表達(dá)顯著抑制METTL16-K229的乳糖化（圖6d），而SIRT2敲低或SIRT2抑制劑AGK2處理則促進(jìn)METTL16-K229的乳糖化（圖6e）。此外，銅誘導(dǎo)的METTL16-K229的乳糖化被SIRT2過表達(dá)抑制，而被SIRT2敲低或AGK2處理增加（圖6f, g）。綜上所述，這些結(jié)果表明SIRT2在K229位點(diǎn)與METTL16相互作用并使其脫酰化。

       研究者進(jìn)一步探索了SIRT2對METTL16的調(diào)控作用在穩(wěn)定的METTL16挽救細(xì)胞株中的作用。SIRT2過表達(dá)抑制了METTL16- wt細(xì)胞中的FDX1 m6A水平，但未抑制METTL16-K229r或-K229E細(xì)胞中的FDX1 m6A水平，表明SIRT2通過METTL16-K229的乳糖化抑制了METTL16的活性（圖6h, i）。此外，SIRT2過表達(dá)抑制FDX1蛋白水平（圖6j），而SIRT2敲低和AGK2處理促進(jìn)FDX1蛋白水平（圖6k）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，在胃癌組織芯片中，SIRT2蛋白水平與FDX1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)（圖6l）。綜上所述，這些結(jié)果表明SIRT2通過在K229上去乙酰化來負(fù)調(diào)控METTL16的活性。

圖6 SIRT2使METTL16-K229脫酰化并抑制METTL16活性

7. SIRT2-METTL16-fdx1細(xì)胞凋亡軸支持一種有前景的治療策略

       FDX1是銅死亡的重要介質(zhì)，而銅死亡是癌癥的潛在治療方法。研究者發(fā)現(xiàn)，在SIRT2抑制或銅誘導(dǎo)METTL16-K229乳糖化后，F(xiàn)DX1蛋白水平升高。接下來，研究者研究了METTL16-K229乳糖化對銅突細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，在銅脅迫下，METTL16敲低介導(dǎo)的DLAT脂化降低在METTL16-WT/-K229E細(xì)胞中被恢復(fù)，但在METTL16-k229r細(xì)胞中沒有恢復(fù)（圖7a）。此外，在銅存在的情況下，來來洛莫處理可誘導(dǎo)METTL16-WT或-K229E細(xì)胞發(fā)生銅中毒，但對METTL16-K229R細(xì)胞未發(fā)生銅中毒（圖7b）。此外，SIRT2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了在銅脅迫下由METTL16-WT引起的DLAT脂化的增加，而不是由METT16-K229E引起的DLAT脂化的增加，表明SIRT2通過去乙酰化METTL16-K229來抑制銅死亡（圖7c）。AGK2處理同樣促進(jìn)了銅脅迫下METTL16-WT細(xì)胞的DLAT脂酰化，但對METTL16-K229R細(xì)胞沒有作用（圖7d）。此外，AGK2處理促進(jìn)了在有來昔洛莫和銅存在的情況下的銅突（圖7e）。

       研究者進(jìn)一步評估了METTL16乳糖化是否可以增強(qiáng)接受來來洛莫治療的小鼠異種移植瘤的治療反應(yīng)。將METTL16-WT、-K229R、-K229E細(xì)胞分別于裸鼠左右后肢上方皮下注射。在METTL16-WT和-K229E組中，接受來來洛莫治療的小鼠的腫瘤生長明顯受到抑制，而在METTL16-K229R組中，腫瘤的體積和重量減少（圖7f-h）。

       腫瘤切片中的FDX1染色顯示，METTL16-WT和-K229E組的腫瘤切片中FDX1染色高于METTL16-K229R組（圖7i）。這些結(jié)果表明，METTL16在K229的泌乳狀態(tài)在決定銅突的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。此外，在異種移植瘤中使用來來洛莫和AGK2聯(lián)合治療。對腫瘤切片的分析表明，AGK2在體內(nèi)可致敏來來洛莫治療，如觀察到的腫瘤體積和重量的減少（圖7j-l）。這些結(jié)果表明，來來洛莫聯(lián)合AGK2治療胃癌，尤其是惡性腫瘤黏液腺癌是一種有前景的治療方法。

圖7 SIRT2 - METTL16 - fdx1細(xì)胞凋亡軸支持一種有前景的治療策略

結(jié)論

       這些結(jié)果表明，METTL16是銅死亡的驅(qū)動力。METTL16在K229上的乳化通過對FDX1 mRNA的m6A修飾上調(diào)FDX1蛋白的表達(dá)，這是銅脅迫下觸發(fā)銅中毒的途徑之一。此外，研究結(jié)果表明METTL16在胃癌中是協(xié)調(diào)葡萄糖和銅代謝的中心樞紐。此外，結(jié)果表明METTL16的乳糖化為評價(jià)銅離子載體藥物的有效性提供了一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。鑒于胃腫瘤比正常組織具有更高的銅和乳酸濃度，利用銅離子載體結(jié)合銅離子和SIRT2特異性抑制劑可能是一種可行的胃癌治療策略。

實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)，小鼠異種移植腫瘤實(shí)驗(yàn)，m6斑點(diǎn)印跡測定，qRT-PCR，熒光素酶報(bào)告基因檢測，蛋白質(zhì)印跡，His-pull-down測定，免疫沉淀，免疫熒光染色，MeRIP-qPCR，RNA穩(wěn)定性檢測，體外乳酸化試驗(yàn)，生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)

Sun L, Zhang Y, Yang B, Sun S, Zhang P, Luo Z, et al. Lactylation of METTL16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 2023 Oct 20;14(1):6523. doi: 10.1038/s41467-023-42025-8.