盡管鼻咽癌腫瘤微環(huán)境中存在大量CD8+ T細(xì)胞浸潤，但在臨床試驗(yàn)中，抗PD -1免疫治療的有效率并不理想，受到免疫抑制信號(hào)的阻礙。為了了解微環(huán)境特征如何改變免疫穩(wěn)態(tài)并限制鼻咽癌的免疫治療效果，作者在此建立了一個(gè)基于公開數(shù)據(jù)的多中心單細(xì)胞隊(duì)列，包含來自50例患者樣本的357206個(gè)細(xì)胞。作者揭示了鼻咽癌細(xì)胞通過CD70-CD27相互作用增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和抑制活性。CD70阻斷可逆轉(zhuǎn)Treg介導(dǎo)的抑制，從而重新激活CD8+T細(xì)胞免疫。抗CD70 +抗PD -1治療在異種移植類器官和人源化小鼠中進(jìn)行了評(píng)估，顯示出更好的腫瘤殺傷效果。在機(jī)制上，CD70敲除抑制了CD4+ na?ve和涉及線粒體完整性、膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的集體脂質(zhì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。此外，ATAC-Seq表明NFKB2通過Epstein-Barr病毒依賴性表觀遺傳修飾上調(diào)CD70的轉(zhuǎn)錄水平。作者的研究結(jié)果確定CD70+鼻咽癌細(xì)胞作為一個(gè)代謝開關(guān)，強(qiáng)制脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的發(fā)展，功能特化和Tregs的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致免疫逃避。本研究還表明，CD70阻斷可與抗PD -1治療協(xié)同作用，重新激活T細(xì)胞對(duì)鼻咽癌的免疫。本文于2023年4月發(fā)表在《Nature Communications》期刊上，IF=16.6。

技術(shù)路線

主要研究結(jié)果

1、腫瘤內(nèi)Treg豐度和激活通過鼻咽癌介導(dǎo)的相互作用進(jìn)行調(diào)節(jié)

      為了在單細(xì)胞分辨率下全面研究鼻咽癌細(xì)胞對(duì)腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的發(fā)育和功能動(dòng)力學(xué)的影響，作者建立了一個(gè)大規(guī)模的隊(duì)列，包含來自36個(gè)鼻咽癌組織并被分成41個(gè)亞型的189,750個(gè)T細(xì)胞，10個(gè)配對(duì)的鼻咽癌外周血樣本和4個(gè)來自3個(gè)鼻咽癌研究的INP組織（圖1a）。在T細(xì)胞亞群中，作者鑒定了三種FOXP3+ Treg亞型，即nTregs、rTregs和eTregs，它們具有不同的轉(zhuǎn)錄組特征。單細(xì)胞軌跡分析推斷出兩種CD4+ T細(xì)胞的發(fā)育譜系，其中na?ve T細(xì)胞在BATF和FOXP3的轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)下分化為輔助T細(xì)胞或eTregs（圖1b, 1c）。

      為了了解CD4+ T細(xì)胞亞型是如何在TME中發(fā)生譜系轉(zhuǎn)移的，作者首先量化了患者中每種亞型的標(biāo)準(zhǔn)化豐度。炎癥組織和鼻咽癌外周血樣本中含有豐富的CD4+ na?ve T細(xì)胞和SELL+ nTregs部分，而在TME中，這些部分是有限的（圖1d）。在分化的CD4+T細(xì)胞亞型中，rTregs和eTregs表現(xiàn)出對(duì)TME的偏好，而濾泡輔助T（TFH）細(xì)胞和中央記憶T（Tcm）細(xì)胞在INP組織中更加豐富（圖1d）。然后，為了證實(shí)TME中Treg和樸素的CD4+T細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡受到損害，作者建立了兩個(gè)使用eTreg和na?ve T細(xì)胞特異性信號(hào)的多元線性回歸模型，以基于NPC Bulk RNA-Seq隊(duì)列計(jì)算Treg免疫抑制活性和T細(xì)胞na?veness。基于功能模塊，作者闡明了高Treg和低na?ve T細(xì)胞浸潤是NPC患者的惡性標(biāo)志，并與預(yù)后不良相關(guān)（圖1e，f）。基于scRNAseq信號(hào)的CIBERSORTx去卷積進(jìn)一步證實(shí)，在NPC患者中，更高的腫瘤內(nèi)浸潤和Tregs的抑制活性共同導(dǎo)致更差的預(yù)后，但與其他臨床參數(shù)無關(guān)。作為TME中最發(fā)達(dá)的亞型，eTregs在STAT、TGF-β和干擾素信號(hào)共同誘導(dǎo)下，表達(dá)最高的免疫抑制信號(hào)，如CTLA4、LAYN和TNFRSF4，并具有最強(qiáng)的細(xì)胞因子通訊、代謝和T細(xì)胞抑制活性（圖1g，h）。相反，受規(guī)范的WNT信號(hào)調(diào)節(jié)的nTregs和rTregs對(duì)T細(xì)胞的激活、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用最小（圖1h）。考慮到鼻咽癌中eTreg極化的CD4+T細(xì)胞格局，作者假設(shè)腫瘤內(nèi)Treg豐度和抑制活性的共同增加可能是由腫瘤介導(dǎo)的CD4+ na?ve T細(xì)胞到Treg的發(fā)展和Treg的激活共同引起的。

      因此，為了闡明Tregs在TME中發(fā)展和激活的腫瘤依賴機(jī)制，作者建立了CD4+ na?ve T細(xì)胞與鼻咽癌細(xì)胞系C666或正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP460和NP69（圖1i）直接或間接共培養(yǎng)的體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。與在無腫瘤細(xì)胞和Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)CD4+ na?ve T細(xì)胞產(chǎn)生Treg相比，直接共培養(yǎng)系統(tǒng)顯示C666細(xì)胞增強(qiáng)了從CD4+ na?ve T細(xì)胞到FOXP3+Treg的極化，并上調(diào)了重要的eTreg標(biāo)志物CTLA4（圖1j-l）。通過選擇與Treg譜系測定和功能相關(guān)的基因面板的qRT-PCR（圖1m），以及共培養(yǎng)系統(tǒng)中分泌的免疫抑制因子，包括IL-10、TGF-β和腺苷的ELISA分析（圖1n），進(jìn)一步驗(yàn)證了C666細(xì)胞的treg極化和激活作用。總之，轉(zhuǎn)錄組分析和功能分析初步表明，鼻咽癌中Tregs的發(fā)育和激活受細(xì)胞接觸而不是細(xì)胞因子通訊的調(diào)節(jié)。

圖1 極化CD4+ T na?ve-to-Treg的發(fā)展和激活是鼻咽癌的腫瘤特異性特征

2、腫瘤限制性CD70通過與CD27相互作用與Treg豐度和激活相關(guān)

      為了進(jìn)一步確定CD4+ na?ve T細(xì)胞、Tregs和NPC細(xì)胞之間的確切作用模式，作者使用了兩個(gè)成熟的程序，CellPhoneDB和CellChat，它們基于scRNA數(shù)據(jù)評(píng)估細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的強(qiáng)度和方向。CD70-CD27信號(hào)是鼻咽癌細(xì)胞、原始CD4+T細(xì)胞和Treg亞型之間最主要的相互作用之一，并以CD70/CD27表達(dá)依賴的方式發(fā)生（圖2a，b）。盡管已發(fā)現(xiàn)與Treg發(fā)育和功能相關(guān)的其他相互作用，包括TIGIT、CD226、4-1BB和LGALS9，但它們似乎在CD4+ na?ve T細(xì)胞和Treg亞型中都沒有上調(diào)，在NPC微環(huán)境中的eTregs中也沒有明顯增強(qiáng)。因此，CD70-CD27信號(hào)被確定為在CD4+ na?ve T細(xì)胞、Treg細(xì)胞和NPC細(xì)胞之間發(fā)生的重要的接觸相互作用，從而具有調(diào)節(jié)TME中從頭Treg發(fā)展和抑制活性的潛力。

      CD70-CD27信號(hào)是促進(jìn)Treg增殖的共刺激途徑，但CD70-CD27信號(hào)在腫瘤浸潤性Treg的發(fā)生和激活中的確切作用和分子機(jī)制尚不清楚。因此，作者最初基于Visium數(shù)據(jù)分析了鼻咽癌細(xì)胞、Tregs和CD70表達(dá)之間的空間接近性，其中整合的鼻咽癌scRNA-seq數(shù)據(jù)作為參考，通過基于錨定的反卷積和細(xì)胞定位推斷腫瘤和Treg部分。在空間上，Tregs不僅與NPC細(xì)胞高度共定位，而且與CD70表達(dá)顯著相關(guān)（圖2c, 2d），表明CD70+ NPC細(xì)胞在調(diào)節(jié)近端Tregs中起積極作用。作者進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了從新鮮內(nèi)鏡活檢中分離的鼻咽癌細(xì)胞中的CD70表達(dá)，顯示大約60%的EPCAM+腫瘤細(xì)胞是CD70+，而在EPCAM-浸潤的免疫/基質(zhì)細(xì)胞中只有10%的CD70+細(xì)胞（圖2e）。此外，IHC和IF染色顯示原發(fā)性鼻咽癌組織中的CD70表達(dá)和FOXP3+/CTLA4+ eTreg浸潤明顯高于非惡性鼻咽淋巴樣組織（圖2f、g）。

      盡管少數(shù)效應(yīng)T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在激活后短暫表達(dá)CD70，但單細(xì)胞分析證實(shí)，CD70在TME中的表達(dá)高度局限于鼻咽癌細(xì)胞（圖2h）。作者根據(jù)中位CD70表達(dá)水平將整合scRNA-seq隊(duì)列中的患者分為CD70-高和CD70-低兩組，結(jié)果顯示CD70-高的患者含有豐富的rTregs和eTregs，但減少了nTregs和CD4+ na?ve T細(xì)胞的含量（圖2i）。這種現(xiàn)象在原發(fā)性鼻咽癌活檢qRT-PCR上得到了的證實(shí)，cd70-高的患者中Treg譜系和激活標(biāo)志物FOXP3、IL2RA和CTLA4的表達(dá)更高（補(bǔ)充圖2h），并根據(jù)上述流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)行分層（圖2e）。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性/增殖與Treg分?jǐn)?shù)之間的負(fù)相關(guān)僅在CD70高的患者中是明顯的（圖2j），這意味著CD70、Treg和T細(xì)胞免疫之間存在反饋回路。

      在大量RNA-seq隊(duì)列中，CD70表達(dá)在NPC患者中持續(xù)上調(diào)，并與較差的生存率相關(guān)（圖2k, l）。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，C666細(xì)胞中CD70+的比例是NP460和NP69細(xì)胞的3倍（圖2m），從而誘導(dǎo)了CD70-CD27結(jié)合時(shí)從共培養(yǎng)的CD4+初始T細(xì)胞表面切割出更高的可溶性CD27（SCD27）（圖2n）。在誘導(dǎo)CD4 + na?ve T細(xì)胞向Treg分化的時(shí)間分辨轉(zhuǎn)錄組分析中，計(jì)算出的Treg抑制評(píng)分隨著FOXP3、CTLA4和CD27的表達(dá)成比例地增加，而na?ve評(píng)分在此過程中呈現(xiàn)相反的趨勢（圖2o）。在大量RNA-seq隊(duì)列中，作者確定CD70表達(dá)與抑制評(píng)分呈正相關(guān)，與na?ve評(píng)分負(fù)相關(guān)（圖2p）。這些結(jié)果提示CD70+鼻咽癌細(xì)胞具有treg極化和激活作用，但它可能雙重依賴于鼻咽癌細(xì)胞中的CD70+部分和CD4+ na?ve T細(xì)胞和treg中的CD27+部分。

      由于鼻咽癌是一種獨(dú)特的EBV+頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC），作者隨后探討了上述CD70+腫瘤細(xì)胞與Tregs之間的反饋回路是否存在于其他人類乳頭瘤病毒+ （HPV+） HNCs中。通過分析兩個(gè)獨(dú)立的HNSCC scRNA-seq隊(duì)列，作者發(fā)現(xiàn)與正常扁桃體微環(huán)境相比，rTregs和eTregs在HPV+ HNSCC微環(huán)境中沒有顯著浸潤。此外，CD70在HNSCC細(xì)胞中的表達(dá)極低，也與HNC患者的預(yù)后不良無關(guān)。這些結(jié)果支持CD70介導(dǎo)的Treg免疫抑制是npc特異性的特征，可能不會(huì)導(dǎo)致HPV+ HNSCC患者的腫瘤進(jìn)展或免疫治療失敗這一觀點(diǎn)。

圖2 CD70 +鼻咽癌細(xì)胞通過與CD4+/CD27+ T細(xì)胞相互作用，促進(jìn)豐富和抑制性Treg浸潤

3、在鼻咽癌細(xì)胞中敲除CD70可通過抑制Treg的發(fā)育和功能來減輕免疫抑制

       為了闡明CD70對(duì)Treg發(fā)育和激活的直接影響，作者用活性重組CD70蛋白處理CD4+ na?ve T細(xì)胞。激動(dòng)劑治療通過CD70-CD27相互作用上調(diào)CD4+ na?ve T細(xì)胞FOXP3和CTLA4的表達(dá)，并增加免疫抑制因子的分泌（圖3a-d）。隨后，作者在C666細(xì)胞中進(jìn)行了CRISPR介導(dǎo)的CD70（CD70-KO）基因敲除，這不影響C666細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)或細(xì)胞增殖。然而，CD70-KO通過阻斷CD27的相互作用（圖3E-G）顯著地減少了來自CD4+ na?ve T細(xì)胞的Treg的發(fā)展和激活，并抑制了sCD27、IL-10、TGF-β和腺苷的Treg分泌組（圖3g，h）。其他Treg激活標(biāo)志物包括ICOS、TNFRSF4、4-1BB（由TNFRSF9編碼）、GITR（由TNFRSF18編碼）和TIGIT的流式細(xì)胞儀和qRT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)了Treg抑制活性受損（圖3i）。TIGIT是小組中only不受CD70-KO影響的標(biāo)記，但這一結(jié)果與先前的研究一致，即TIGIT在Treg上的表達(dá)不受CD70-CD27共同刺激的影響。Treg抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了CD70-KO功能抑制了配對(duì)CD8+T細(xì)胞增殖的Treg抑制活性，這與上述結(jié)果相呼應(yīng)。

       考慮到受損Tregs的抑制活性可能會(huì)重振CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫，正如大量RNA-Seq數(shù)據(jù)GSEA分析所分析的那樣，作者建立了以CD4+為主的腫瘤-外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）共培養(yǎng)體系。作者發(fā)現(xiàn)C666細(xì)胞中的CD70-KO大大增強(qiáng)了細(xì)胞毒性依賴性腫瘤細(xì)胞的死亡（圖3j - 1），特別是在與鼻咽癌患者生理T細(xì)胞全局相似的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD4+ T細(xì)胞上CD27的表達(dá)更高。較高的腫瘤細(xì)胞死亡率可能直接歸因于CD70- NC C666細(xì)胞誘導(dǎo)的共培養(yǎng)CD4+ na?ve T細(xì)胞和Tregs中CD70共刺激的缺失，而不是共培養(yǎng)系統(tǒng)中的CD4+和CD8+ T細(xì)胞。在CD70-KO系統(tǒng)中，CD8+/顆粒酶A+和CD8+/穿孔素+ T細(xì)胞組分、TNF-α和IFN-γ分泌以及CD8+ T細(xì)胞增殖均升高，PD-1和TIM-3表達(dá)降低（圖3m-q），這表明受損的Treg抑制活性可以重新激活抗腫瘤CD8+ T細(xì)胞。

       為了更全面地證明CD70-CD27相互作用對(duì)NPC浸潤性T細(xì)胞的免疫抑制作用，作者設(shè)計(jì)了CD19+CD70-NC/ CD19+ CD70-KO C666細(xì)胞與抗CD19 CAR-T細(xì)胞的自體共培養(yǎng)系統(tǒng)。自體共培養(yǎng)系統(tǒng)可以激活CD4+和CD8+ T細(xì)胞中的抗原特異性T細(xì)胞，并對(duì)CD19+ CD70-NC和CD19+ CD70-KO C666細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性殺傷。與同種異體共培養(yǎng)系統(tǒng)的結(jié)果相比，CD70-KO在自體共培養(yǎng)系統(tǒng)中的C666細(xì)胞中持續(xù)抑制Treg極化、激活和抑制活性，從而增強(qiáng)抗原特異性T細(xì)胞殺傷和細(xì)胞毒性。此外，作者通過PBMC連續(xù)攻擊親代C666細(xì)胞來模擬鼻咽癌進(jìn)展過程中的漸進(jìn)性免疫逃逸，建立了免疫耐藥的C666細(xì)胞。作者發(fā)現(xiàn)CD70在免疫耐受細(xì)胞中的表達(dá)持續(xù)上調(diào)，驗(yàn)證了CD70+NPC細(xì)胞在促進(jìn)免疫逃避中的積極作用。

       此外，缺乏小鼠鼻咽癌細(xì)胞系、自發(fā)的小鼠模型以及小鼠無法感染EBV一直阻礙著鼻咽癌免疫學(xué)和免疫治療的轉(zhuǎn)化研究。因此，作者建立了移植PBMC的人源化NSG小鼠模型，以研究CD70-KO C666細(xì)胞對(duì)浸潤性Tregs發(fā)育和抑制活性的體內(nèi)影響。與體外結(jié)果一致，CD70-KO在免疫缺陷的NSG小鼠中沒有改變NPC的體內(nèi)致瘤性（圖3r），但在人源化的NSG小鼠中導(dǎo)致顯著的腫瘤縮小（圖3s），進(jìn)一步證實(shí)了CD70在抗腫瘤免疫中的抑制作用。但是H&E染色在CD70-NC和CD70-KO腫瘤中的總免疫浸潤之間沒有顯著差異，但CD70-KO腫瘤中FOXP3+Tregs的比例減少且活性受損，從而降低了TME中IL-10和TGF -β的濃度（圖3t-v）。因此，CD70-KO腫瘤通過促進(jìn)細(xì)胞毒性細(xì)胞因子的釋放和防止T細(xì)胞耗盡來重振CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)譜（圖3t，u）。這些結(jié)果提示，鼻咽癌患者中治療性的CD70抑制可能是克服Treg免疫抑制進(jìn)而激活T細(xì)胞免疫的有效策略。

圖3 鼻咽癌細(xì)胞中CD70基因缺失可恢復(fù)Treg抑制活性，增強(qiáng)TME中CD8+ T細(xì)胞功能

4、Cusatuzumab在患者衍生模型中增強(qiáng)抗腫瘤免疫并與抗PD-1治療協(xié)同作用

       考慮到CD27在T細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞上的高表達(dá)，在使用CD27阻斷時(shí)可能導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，CD70已成為一個(gè)更有效和安全的靶標(biāo)，因?yàn)樗诜€(wěn)態(tài)期間不會(huì)在正常組織和造血細(xì)胞系上表達(dá)。Cusatuzumab是一種人αCD70單克隆抗體，可有效阻斷CD70-CD27相互作用及其下游信號(hào)通路。到目前為止，cusatuzumab正在多個(gè)臨床試驗(yàn)（NCT04023526和NCT04150887）中對(duì)急性髓系白血病（AML）患者進(jìn)行評(píng)估，并顯示出對(duì)CD70 +白血病干細(xì)胞的有效殺傷效果及可控的不良事件。然而，還沒有在臨床前的實(shí)體瘤中全面描述cusatuzumab的療效。通過用5 μg/mL cusatuzumab處理C666細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)在CD4+ na?ve T細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中，Treg發(fā)育、活化、分泌免疫抑制因子以及抑制CD8+ T細(xì)胞增殖的能力被抑制到與CD70-KO相當(dāng)?shù)某潭龋▓D4a-d）。因此，在PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中，通過促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性，cusatuzumab治療誘導(dǎo)了更高的腫瘤細(xì)胞死亡（圖4e-i）。作者還評(píng)估了在PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD70封閉性抗體對(duì)免疫抑制的抑制作用。C666細(xì)胞中的CD70阻斷顯示了與cusatuzumab治療相當(dāng)?shù)哪[瘤殺傷和細(xì)胞毒性增強(qiáng)效果，進(jìn)一步證實(shí)了CD70抑制在誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗腫瘤免疫中是有效的。接下來，在患者來源的原代NPC細(xì)胞和自體PBMCs之間的共培養(yǎng)系統(tǒng)中，進(jìn)一步驗(yàn)證了cusatuzumab的免疫激活作用。與IgG治療相比，cusatuzumab治療抑制了Tregs的抑制活性，這反過來激活了CD8+ T細(xì)胞的效應(yīng)子功能，最終導(dǎo)致增強(qiáng)的腫瘤殺傷功效。

       在這項(xiàng)研究中，cuatuzumab被證明通過緩解鼻咽癌中Treg的發(fā)展和抑制活性來增強(qiáng)T細(xì)胞免疫。或者，抗PD-1治療通過防止T細(xì)胞耗盡直接釋放CD8+/PD-1+ T細(xì)胞的增殖和激活。因此，聯(lián)合抗CD70和抗PD-1治療可達(dá)到增強(qiáng)抗腫瘤免疫的協(xié)同作用。為了研究這種潛在的協(xié)同效應(yīng)，作者首先使用TIDE方法預(yù)測CD70高和CD70低的鼻咽癌患者的ICB反應(yīng)性和T細(xì)胞特征。CD70高的鼻咽癌患者預(yù)計(jì)對(duì)ICB阻斷更有抵抗力，表現(xiàn)出更低的T細(xì)胞毒性和炎癥，但T細(xì)胞排斥率更高。除NPC外，CD70在其他實(shí)體腫瘤如黑色素瘤中也優(yōu)先表達(dá)。一些黑色素瘤研究已經(jīng)從接受ICB的應(yīng)答者和無應(yīng)答者中生成了TME轉(zhuǎn)錄組圖譜，這些圖譜的計(jì)算分析表明CD70表達(dá)與T細(xì)胞功能障礙和較差的ICB結(jié)果相關(guān)。為了驗(yàn)證CD70在黑色素瘤中的促腫瘤作用，作者在小鼠黑色素瘤細(xì)胞系中進(jìn)行了CD70-KO：B16-F10，以及在C57BL/6J小鼠中原位注射CD70-NC和CD70-KO B16-F10細(xì)胞。CD70-KO導(dǎo)致黑色素瘤顯著縮小，但作者也觀察到CD70-KO對(duì)腫瘤的特異性反應(yīng)，可能是由于小鼠特異性的TME。

       在實(shí)驗(yàn)上，作者評(píng)估了CD70+PD-1在模擬鼻咽癌原發(fā)腫瘤生理狀態(tài)的鼻咽癌器官中的阻斷效果。作者從2018年建立的EBV+NPC患者來源的異種移植（Xeno76）中建立了NPC有機(jī)化合物，并相應(yīng)地評(píng)估了CD70和PD-L1在Xeno76中的表達(dá)水平（圖4j）。在有機(jī)物-PBMC共培養(yǎng)體系中，抗CD70單藥和抗PD-1單藥均顯著增加腫瘤細(xì)胞死亡率，但聯(lián)合治療在有機(jī)物數(shù)量、大小和存活率方面顯示出更好的殺瘤效果（圖4k-n）。作者進(jìn)一步比較了聯(lián)合療法和單一療法在移植了Xeno76的PBMC和移植了人源化NSG的NSG小鼠中的體內(nèi)療效。一直以來，抗CD70+抗PD1聯(lián)合治療在抑制患者來源的異種移植（PDX）生長方面顯示出最高的療效（圖4o，p）。同時(shí)，腫瘤浸潤性Tregs和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例在接受聯(lián)合治療后分別顯著減少和增加（圖4Q），這表明聯(lián)合抗CD70和抗PD-1治療獲得了通過克服Treg介導(dǎo)的免疫抑制來刺激T細(xì)胞免疫的協(xié)同效應(yīng)。

圖4 治療抑制CD70促進(jìn)抗腫瘤免疫和抗PD-1療效

5、CD70-CD27信號(hào)參與Tregs的脂代謝重編程

       Treg是一種有彈性的T細(xì)胞亞型，具有很強(qiáng)的組織適應(yīng)性和分子靈活性，有助于它們在不同的生態(tài)系統(tǒng)中存活、穩(wěn)態(tài)和代謝，包括外周、淋巴結(jié)、胸腺和腫瘤。由于作者證明了CD70-KO和鼻咽癌細(xì)胞中的抑制通過限制Treg的活性來增強(qiáng)抗腫瘤免疫，作者進(jìn)一步研究了CD70-CD27信號(hào)如何影響Treg下游的動(dòng)態(tài)平衡，特別是在NPC的TME中。因此，作者在與CD70-NC和CD70-KO C666細(xì)胞共培養(yǎng)的PBMC中應(yīng)用了額外的3‘scRNA-seq（圖5a）。與作者的體外和體內(nèi)結(jié)果一致，CD70-KO降低了nTregs、rTregs和eTregs的豐度，擴(kuò)大了促炎亞型，包括CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞、CD4+TFH細(xì)胞和CD4+ na?veT細(xì)胞（圖5B）。

       此外，與CD70-KO C666細(xì)胞共培養(yǎng)的PBMCs中的Tregs （KO-Tregs）表現(xiàn)出譜系特異性（FOXP3, IL2RA和SOX4），活化（CTLA4和LAYN）和共刺激（TNFRSF4和TNFRSF9）標(biāo)記的表達(dá)較低，但na?ve （SELL）特征標(biāo)記的表達(dá)較高（圖5c）。特別是，一些共培養(yǎng)的eTreg轉(zhuǎn)變?yōu)榇嗳鯛顟B(tài)，其先前的特征是FOXP3表達(dá)保留，但I(xiàn)FN-γ產(chǎn)生異常。然而，在與CD70共同培養(yǎng)的Treg中，PD-1的上調(diào)保護(hù)了這些細(xì)胞免受干擾素誘導(dǎo)的脆弱性，同時(shí)保持了功能穩(wěn)態(tài)（圖5c）。因此，在抗CD70治療中加入PD-1阻斷后觀察到的協(xié)同作用也可能通過誘導(dǎo)Treg脆弱性來部分減少免疫抑制。CD70-KO組CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖（MKI67）、細(xì)胞毒性（GZMA和LTB）和活化（TNFRSF1B和CD28）標(biāo)志物的表達(dá)增加，而na?ve （Tcf7和CCR7）和衰竭（LAYN、LAG3和HAVCR2）標(biāo)志物的表達(dá)降低，進(jìn)一步證實(shí)阻斷Tregs的抑制活性促進(jìn)了CD8+T細(xì)胞的增殖、激活和緩解衰竭（圖5d）。CD70介導(dǎo)的Treg免疫抑制也阻礙了CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，從而降低了它們的抗腫瘤效果。

       為了進(jìn)一步闡明CD70-CD27信號(hào)在Tregs中的下游機(jī)制，作者對(duì)CD70誘導(dǎo)的Tregs和KO-Tregs進(jìn)行了GSEA。CD70+C666細(xì)胞通過增強(qiáng)由復(fù)雜的脂質(zhì)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動(dòng)的氧化磷酸化（OXPHOS），有效地重新編程共培養(yǎng)的Treg的代謝譜（圖5e）。Treg經(jīng)常需要強(qiáng)健的新陳代謝來維持它們在TME中的發(fā)育和抑制活動(dòng)。特別是，Treg具有高能量驅(qū)動(dòng)的可塑性，因此可以利用不同的代謝資源，包括乳酸、葡萄糖和脂肪酸（FAs），在代謝物缺乏的環(huán)境中維持功能平衡。通路分析表明，脂肪酸代謝、膽固醇穩(wěn)態(tài)和線粒體功能是CD70誘導(dǎo)的Tregs中最豐富的信號(hào)，最近報(bào)道這些信號(hào)有助于Treg譜系確定、功能適應(yīng)和免疫抑制（圖5e）。例如，由脂肪酸氧化驅(qū)動(dòng)的OXPHOS增加是TME中Treg發(fā)展和抑制活性的標(biāo)志。同時(shí)，上調(diào)的解毒和氧化還原穩(wěn)態(tài)保護(hù)CD70誘導(dǎo)的Tregs免受OXPHOS和ATP產(chǎn)生的高水平活性氧物種的影響，同時(shí)保持線粒體的完整性（圖5f）。相反，KO-Tregs由于脂質(zhì)外流和清除增加以及線粒體完整性喪失而表現(xiàn)出功能動(dòng)態(tài)平衡受損（圖5f）。

圖5 單細(xì)胞分析顯示CD70-CD27信號(hào)增強(qiáng)Tregs中脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的OXPHOS

6、線粒體的完整性、膽固醇的穩(wěn)態(tài)和脂肪酸的氧化共同促成了Treg的功能特化

       為了從機(jī)制上了解CD70誘導(dǎo)的復(fù)雜脂質(zhì)網(wǎng)絡(luò)如何在鼻咽癌微環(huán)境中增強(qiáng)Tregs的功能特化和動(dòng)態(tài)平衡，作者評(píng)估了CD70-NC和CD70KO C666細(xì)胞共同培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞內(nèi)總脂和關(guān)鍵脂成分（如膽固醇和脂肪酸）的變化。首先，鼻咽癌細(xì)胞中CD70的基因缺失和治療抑制顯著降低了共培養(yǎng)的Treg細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)總脂質(zhì)和膽固醇（圖6a，b）。其次，從FOXP3-非Tregs、FOXP3+/CTLA4-rTregs到FOXP3+/CTLA4+eTregs，細(xì)胞內(nèi)膽固醇增加，這表明細(xì)胞內(nèi)膽固醇積累與Treg的發(fā)展和抑制活性有關(guān)（圖6c）。在整合的NPC scrna-seq隊(duì)列中，作者證實(shí)eTregs具有更強(qiáng)勁的膽固醇代謝和生物合成，但膽固醇輸出較低。

       考慮到脂質(zhì)信號(hào)是一個(gè)高度復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，涉及各種代謝物的細(xì)微變化，作者進(jìn)行了基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)，以量化共培養(yǎng)CD4+ T細(xì)胞中極性分子和脂肪酸的細(xì)胞內(nèi)代謝變化（圖6c）。質(zhì)譜分析顯示，CD70-KO組細(xì)胞內(nèi)膽固醇和腺苷持續(xù)下降，CD39表達(dá)降低（圖6d）。同時(shí)，增加甘油可以保護(hù)Tregs免受脂質(zhì)累積毒性，后者損害FOXP3的穩(wěn)定性（圖6d）。OXPHOS衍生的代謝物被積極代謝，包括琥珀酸鹽、2-羥基戊二酸鹽（2-HG）和蘋果酸鹽，被積極代謝（圖6d），這些代謝物之前被報(bào)道與Treg發(fā)育受損和通過PD-1的表觀遺傳抑制活性相關(guān)。而CD70-NC組、CD70-KO組和CD4+ T組細(xì)胞中的檸檬酸鹽、天冬氨酸和谷氨酰胺保持不變。脂肪酸組，CD70-KO組總脂肪酸含量明顯降低（圖6d）。幾乎所有細(xì)胞內(nèi)脂肪酸衍生物C4到C26的濃度都降低了，這表明阻斷Tregs中CD70-CD27信號(hào)通路可能會(huì)破壞新生脂肪酸的攝取、合成和氧化。

       基于觀察到的Tregs在CD70/CD27介導(dǎo)的脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)中的代謝適應(yīng)，作者提出線粒體完整性、膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪酸代謝共同促成了Tregs在NPC微環(huán)境中通過CD70-CD27信號(hào)傳導(dǎo)的代謝優(yōu)勢和功能特化。作者推測CD70作為一個(gè)主代謝開關(guān)，重新編程CD4+ na?ve T細(xì)胞和Treg的脂質(zhì)代謝，以滿足這些細(xì)胞在惡劣環(huán)境中Treg發(fā)育、穩(wěn)態(tài)和激活的代謝需求。為了驗(yàn)證作者的假設(shè)，作者首先在電鏡下發(fā)現(xiàn)KO-Tregs的線粒體較少且不健康（圖6e），導(dǎo)致海馬實(shí)驗(yàn)和JC-1染色顯示的ATP生成、OXPHOS和線粒體電位減少（圖6f-h）。此外，作者評(píng)估了Tregs中46個(gè)參與脂質(zhì)合成、運(yùn)輸和氧化的代表性基因的變化，其中超過70%的選定特征受到CD70-CD27信號(hào)傳導(dǎo)的顯著影響（圖6i）。

       鑒于CD70誘導(dǎo)的Tregs細(xì)胞內(nèi)膽固醇升高，作者首先檢查了參與調(diào)節(jié)膽固醇攝取的LDLR的變化。有趣的是，在CD70誘導(dǎo)的Tregs中，LDLR的表達(dá)并未增加，而膽固醇外排相關(guān)基因（如SCARB1和SDC1）被發(fā)現(xiàn)下調(diào)，這表明膽固醇積累是由抑制膽固醇輸出引起的。此外，通過甲羥戊酸途徑參與膽固醇代謝和Treg穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和酶，包括SREBF1、SREBF2、HMGCS1、SOAT1、SOAT2、FNTB、PGGT1B、GGPS1、RAC2和PD-1，促進(jìn)Treg的發(fā)育和維持，也被CD70-CD27信號(hào)增強(qiáng)（圖6i）。

       脂肪酸攝取和重新合成引起的Tregs細(xì)胞內(nèi)脂肪酸積累積極參與IL-2依賴性增殖和TCR依賴性活化。通過BODIPY C12示蹤和FAO通路中的三種酶（ACADVL、ACADM和HADHA）水平確定，CD70-KO在共培養(yǎng)的CD4+ T細(xì)胞中損害了脂肪酸攝取和氧化。在CD70共培養(yǎng)的CD4+ na?ve T細(xì)胞中，增加的ACACA而不是FASN，也可能通過重新合成FA促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸積累，從而上調(diào)TCR依賴的Treg激活和成熟標(biāo)記TNFRSF18和CD44（圖6i）。如上所述的代謝實(shí)驗(yàn)表明，CD70誘導(dǎo)的Treg中積累的脂肪酸庫通過線粒體OXPHOS為FAO提供了足夠的資源，這些資源持續(xù)產(chǎn)生ATP，足以滿足Treg功能化和TME中生存的高能量需求。

       以前已經(jīng)證明線粒體復(fù)合物III對(duì)于Treg抑制活性和增強(qiáng)FAO驅(qū)動(dòng)的OXPHOS是必需的。與線粒體復(fù)合體III的完整性和功能相關(guān)的UQCRFS1，UQCRQ和CYC1，在由CD70-CD27信號(hào)激活的Tregs中上調(diào)，與電子顯微鏡圖像協(xié)調(diào)一致（圖6e，i）。作者還發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)和電子傳遞鏈（ETC）中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和酶的上調(diào)，包括NR4A1、NR4A2、MDH1、MDH2、ECHS1和ECH1（圖6i）。其他轉(zhuǎn)錄因子，包括STAT5A和cAMP誘導(dǎo)因子，如CREB1和CEBPB，與Tregs的代謝適應(yīng)性相關(guān)，可能確保Tregs在NPC微環(huán)境中的功能特化（圖6i）。然而，其他幾個(gè)重要的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，包括SQLE，SCAP，HMGCR，ATF4，CCDC5B，LAGLS3，CTNB1和EGR1，沒有差異表達(dá)（圖6i），表明在腫瘤特異性的神經(jīng)干細(xì)胞內(nèi)，Tregs中存在一種可替代的和獨(dú)立于CD70之外的脂質(zhì)信號(hào)。

       作者進(jìn)一步構(gòu)建了脂質(zhì)信號(hào)模塊，其包含基于多元線性回歸從qPCR組中選擇的15個(gè)代表性簽名基因，以定量評(píng)估單細(xì)胞和大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中Tregs和其他CD4+ T細(xì)胞中的脂質(zhì)信號(hào)活性。

       首先，NPC細(xì)胞中CD70的基因去除顯著損害了共培養(yǎng)Tregs中的脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)（圖6j）。同時(shí)，在整合的NPC單細(xì)胞群組中，eTregs具有最高的脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)活性，超過rTregs、nTregs和其他CD4+亞型，包括T_FH細(xì)胞、T_CM細(xì)胞和na?ve細(xì)胞（圖6k）。在時(shí)間分辨的Treg分化模型中，脂質(zhì)信號(hào)活性與na?ve T細(xì)胞至Treg分化期間的Treg抑制評(píng)分和CD25表達(dá)正相關(guān)，與幼稚評(píng)分和IL7R表達(dá)負(fù)相關(guān)（圖6l）。在大量RNA-seq群組中，脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)活性與Tregs的抑制活性和NPC患者的不良預(yù)后高度相關(guān)（圖6m，n）。此外，在GTEx的337份全血樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，15個(gè)代表性特征基因與CD70、CD27、FOXP3、CTLA4和CD25之間的相關(guān)性得到了獨(dú)立驗(yàn)證（圖6o），表明脂質(zhì)模塊與Treg活性在個(gè)體中一致相關(guān)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明脂質(zhì)代謝重編程和CD70-CD27信號(hào)在譜系確定、穩(wěn)態(tài)和NPC浸潤Tregs抑制活性中的密切合作。

       為了驗(yàn)證脂質(zhì)代謝在CD70誘導(dǎo)的鼻咽癌微環(huán)境中Treg的發(fā)展和激活中的重要性，作者評(píng)估了CD70-NC和CD70-KO與去脂微環(huán)境共培養(yǎng)時(shí)的功能和代謝變化。在去脂共培養(yǎng)系統(tǒng)中，CD70+ NPC細(xì)胞不再誘導(dǎo)CD4+ na?ve T細(xì)胞分化出更高比例的總活化treg，也不再誘導(dǎo)更強(qiáng)的CD8+ T細(xì)胞增殖抑制（圖6p, q）。在脂質(zhì)耗盡系統(tǒng)中，CD4+ T細(xì)胞與CD70-NC和CD70-KO C666細(xì)胞共培養(yǎng)的免疫抑制分泌組譜也沒有差異（圖6r）。因此，脂質(zhì)缺失也導(dǎo)致CD70-CD27相互作用不能調(diào)節(jié)NPC-PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中的Treg免疫抑制，導(dǎo)致CD70-NC組和CD70-KO組的抗腫瘤免疫增強(qiáng)（圖6s）。此外，由于缺乏可被吸收和合成的游離脂，NC-Tregs和KO-Tregs的細(xì)胞內(nèi)總脂質(zhì)含量保持不變（圖6T）。代謝分析進(jìn)一步表明，即使在CD70-CD27信號(hào)活躍的情況下，脂肪缺失時(shí)，Tregs的ATP生成、OXPHOS、線粒體完整性和脂肪酸氧化也顯著受損（圖6u-x）。這些結(jié)果成功地證明了CD70CD27相互作用對(duì)于促進(jìn)鼻咽癌浸潤性樹突狀細(xì)胞的發(fā)育、動(dòng)態(tài)平衡和抑制活性是必不可少的脂代謝。

圖6 脂質(zhì)信號(hào)促進(jìn)Treg發(fā)育、動(dòng)態(tài)平衡和抑制活性

       由于CD70在鼻咽癌組織中的過度表達(dá)在臨床上經(jīng)常被觀察到，作者想要探討CD70介導(dǎo)的免疫逃避的上游機(jī)制。單細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，CD70的轉(zhuǎn)錄組水平在EBV+NPC細(xì)胞中顯著過表達(dá)（圖7a）。作者證實(shí)，與EBV-對(duì)應(yīng)物相比，EBV+ NPC43細(xì)胞中的CD70+ 分?jǐn)?shù)更高（圖7a）。NPC的EBV感染導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，因此表觀遺傳學(xué)刺激癌基因的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和免疫逃逸。據(jù)報(bào)道，染色體19上的CD70基因的染色體位點(diǎn)在NPC經(jīng)常被擴(kuò)增。因此，為了描述CD70在NPC的過度表達(dá)是否是由EBV介導(dǎo)的染色質(zhì)可及性改變引起的，作者對(duì)EBV⁺ NPC細(xì)胞、EBV^- NPC細(xì)胞和NPE細(xì)胞進(jìn)行了ATAC序列分析。與EBV-和正常對(duì)應(yīng)物相比，EBV⁺ NPC細(xì)胞中CD70啟動(dòng)子區(qū)域的染色質(zhì)可及性增強(qiáng)，使得轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合更有效，從而促進(jìn)CD70 mRNA轉(zhuǎn)錄（圖7b）。基于ATAC分析，作者鑒定了在EBV⁺ NPC細(xì)胞中具有最高轉(zhuǎn)錄活性的前15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其可能以更高的可及性與CD70啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合（圖7c）。在15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，作者表征了NFKB2是在兩個(gè)NPC RNA-seq隊(duì)列和Visium空間數(shù)據(jù)中驗(yàn)證的與CD70表達(dá)最相關(guān)的一個(gè)，并且具有與JASPER預(yù)測的CD70啟動(dòng)子區(qū)域的最高結(jié)合分?jǐn)?shù)圖（7d，e）。在EBV-感染的淋巴細(xì)胞中，還發(fā)現(xiàn)NFKB2與CD70高度相關(guān)，表明在免疫和上皮細(xì)胞中一致的EBV調(diào)節(jié)的表觀遺傳學(xué)（圖7f）。

       NFKB2是NF-κB通路的主要調(diào)節(jié)因子，NF-κB通路被廣泛認(rèn)為是NPC啟動(dòng)和進(jìn)展的同質(zhì)驅(qū)動(dòng)因子。NFKB2經(jīng)常在EBV+ NPC細(xì)胞中過表達(dá)，而不是在TME中的EBV-腫瘤細(xì)胞、NPE細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞中過表達(dá)（圖7g），并且先前已經(jīng)顯示促進(jìn)腫瘤生長和存活。然而，其對(duì)NPC免疫逃避的調(diào)節(jié)作用以及與CD70上調(diào)的分子連鎖尚未被全面闡明。因此，為了描述NFKB2對(duì)CD70轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用，作者在CD70啟動(dòng)子區(qū)域確定了NFKB2獨(dú)特的結(jié)合基序，該基序因EBV感染而增強(qiáng)了可及性（圖7b）。因此，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)點(diǎn)突變的CD70與熒光素酶結(jié)合的基序，并證明了NFKB2可以特異性地和有效地結(jié)合到這個(gè)位點(diǎn)上，以增強(qiáng)CD70的轉(zhuǎn)錄（圖7h）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證NFKB2作為CD70轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的作用，作者在C666細(xì)胞中進(jìn)行了NFKB2基因敲除和抑制，顯示CD70 mRNA和CD70蛋白持續(xù)下降（圖7i至7k）。C666細(xì)胞中NFKB2的丟失使它們在PBMC共培養(yǎng)系統(tǒng)中對(duì)免疫攻擊敏感（圖7l，m）。這些數(shù)據(jù)揭示了EBV-NFKB2-CD70軸是鼻咽癌細(xì)胞通過上調(diào)Treg免疫抑制來逃避免疫監(jiān)視的重要機(jī)制，Treg免疫抑制降低了T細(xì)胞免疫。

圖7 EBV感染增加CD70啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性并通過NFKB2促進(jìn)CD70轉(zhuǎn)錄

       總之，作者的多組學(xué)驅(qū)動(dòng)的功能研究為在鼻咽癌微環(huán)境中如何發(fā)展、激活和維持Tregs提供了臨床前的見解，并表明CD70抑制是一種治療上可行的方法，可以克服免疫抑制的TME，協(xié)同提高抗PD-1治療的療效。抗CD70+抗PD-1聯(lián)合治療可能對(duì)晚期或耐藥鼻咽癌患者產(chǎn)生特殊的益處，優(yōu)化了這些患者的常規(guī)治療。作者還認(rèn)為，多組學(xué)NPC T細(xì)胞隊(duì)列以及已建立的功能模塊，如Treg抑制、T細(xì)胞幼稚和Treg脂信號(hào)模塊，可以應(yīng)用于其他惡性腫瘤腫瘤浸潤性T細(xì)胞的免疫抑制和代謝重編程的未來研究，或用于定量評(píng)估免疫治療反應(yīng)的常規(guī)臨床應(yīng)用。最后，這種由CD70-CD27信號(hào)誘導(dǎo)的脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的免疫抑制機(jī)制為鼻咽癌患者開辟了CD70靶向精確治療的新途徑，并可能對(duì)黑色素瘤患者有效，這取決于他們特定的TME環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)方法

單細(xì)胞測序、偽時(shí)間發(fā)育軌跡、單細(xì)胞基因集變異分析（GSVA）、細(xì)胞培養(yǎng)、流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、qRT-PCR、細(xì)胞間通訊分析、空間轉(zhuǎn)錄組測序和分析、免疫組化（IHC）、免疫熒光（IF）、Treg抑制試驗(yàn)、細(xì)胞增殖和存活分析、細(xì)胞凋亡分析、CFSE染色和分析、慢病毒包裝、小鼠模型的建立及異種移植、GSEA分析、油O紅染色和定量、代謝組學(xué)、雙熒光素酶報(bào)告基因測定

參考文獻(xiàn)

L. Gong, J. Luo, Y. Zhang, et al. Nasopharyngeal carcinoma cells promote regulatory T cell development and suppressive activity via CD70-CD27 interaction, Nature Communications 14(1) (2023).