摘要

       肝細胞癌（HCC）是世界范圍內最常見和最致命的癌癥之一。腫瘤微環境（TME）導致HCC患者對當前治療的反應較差，而腫瘤血管內皮細胞（ECs）是顯著促進腫瘤進展的基本TME組分。然而，腫瘤血管內皮細胞在肝癌中的具體功能和機制尚不清楚。本文通過篩選并驗證特異性二酰基甘油激酶γ（DGKG）在HCC腫瘤血管內皮細胞中高表達。通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）、質譜流式細胞術（CyTOF）以及體外和體內研究來研究內皮DGKG的功能和機制。采用多重免疫組織化學（mIHC）染色和流式細胞術評價TME的變化。在功能上，內皮DGKG促進HCC中的腫瘤血管生成和免疫抑制調節性T（Treg）細胞分化。重要的是，作者發現缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在缺氧條件下通過直接與DGKG的啟動子區域結合來激活DGKG的轉錄。上調的DGKG通過募集泛素特異性肽酶16（USP16）促進鋅指E盒結合同源盒2（ZEB2）去泛素化和細胞因子轉化生長因子-β1（TGF-β1）正反饋環激活，從而誘導腫瘤血管生成和Treg分化，從而促進HCC進展。重要的是，靶向內皮DGKG增強PD-1和VEGFR-2雙重阻斷的效率。缺氧誘導的EC特異性DGKG高表達通過ZEB2/TGF-β1軸促進腫瘤血管生成和免疫逃避，提示EC特異性DGKG是HCC的潛在治療靶點。本文于2023年10月發表在《Journal of Hepatology》IF:25.7期刊上。

技術路線

主要實驗結果

1. DGKG在HCC腫瘤血管內皮細胞中高表達并與不良預后相關

       作者對HCC腫瘤血管EC進行轉錄組分析，所述HCC腫瘤血管EC從三對HCC樣品的腫瘤和鄰近正常組織中分離和鑒定，以鑒定肝癌發生后腫瘤血管EC中的基本分子變化（圖1A和1B）。結果顯示，DGKG、ZNF192P2和PCDHB18P是HCC腫瘤血管EC中基于倍數變化的三個主要升高的基因。基于差異表達基因（DEGs）的GO和KEGG途徑分析也揭示這些DEGs與細胞分化、增殖、代謝和運動途徑顯著相關（圖1C和1D）。qRT-PCR分析進一步揭示DGKG在腫瘤血管EC（CD31⁺CD45^-）中特異性高度表達，但在白細胞（CD31^-CD45⁺）和其它細胞（CD31^-CD45^-；圖1E-1H）中很少表達。此后，作者專注于內皮DGKG的進一步研究。組織微陣列（TMA）的IF染色證明DGKG在腫瘤-EC中特異性高度表達（圖1I-1K）。此外，臨床病理學數據顯示，隨著腫瘤進展，內皮DGKG的表達水平顯著增加（圖1L）。同時，內皮DGKG的高表達增加HCC患者的腫瘤轉移發生率并顯著降低無病生存期（DFS）和總生存數（OS）（圖1M-1O）。總之，這些發現表明DGKG主要在HCC腫瘤血管EC中表達，并且其水平與HCC進展強烈相關。

圖1 DGKG在HCC腫瘤血管內皮細胞中表達上調，并與不良預后相關

2. 缺氧以HIF-1α依賴方式上調DGKG表達

       缺氧通常發生在HCC中，并且與腫瘤進展和不良臨床結果密切相關。在缺氧條件下，HIF-1α穩定并促進下游基因的轉錄。多重免疫組織化學（mIHC）染色顯示HIF-1α表達與內皮DGKG正相關，這為缺氧介導的DGKG上調提供證據（圖2A和2B）。在此基礎上，作者研究HIF-1α在常氧和缺氧條件下對內皮細胞（HUVECs）和肝癌細胞（Huh7）DGKG表達的影響。結果顯示，缺氧條件下，HIF-1α過表達和HIF-1α敲低的HUVECs中DGKG的表達水平升高和降低。然而，在Huh7細胞中沒有觀察到這種現象，表明HIF-1α誘導具有EC特異性的DGKG轉錄（圖2C和2D）。

       隨后，使用在線工具Jaspar預測DGKG啟動子中潛在的HIF-1α結合位點（HBS），揭示4個推定的HBS（圖2E）。HBS位點缺失或定點誘變的熒光素酶報告基因測定表明，DGKG啟動子中的HBS2和3誘導HIF-1α增強的啟動子活性（圖2F）。染色質免疫沉淀（ChIP）結果顯示，HIF-1α僅被募集到含有HBS2和3的啟動子區（圖2G）。這些結果表明，HBS2和3對于HIF-1α轉錄激活DGKG是必需的（圖2H）。

圖2 缺氧條件下HIF-1α激活內皮細胞DGKG轉錄

3. scRNA-seq和CyTOF分析揭示內皮DGKG在HCC進展中的關鍵作用

       作者構建內皮特異性DGKG敲除小鼠和腺相關病毒（AAV）遞送的內皮特異性DGKG敲減小鼠，其不改變組織學形態和主要器官中的基礎血管穩態。探討DGKG在腫瘤血管內皮細胞中的作用。首先，作者開發一種肝毒素誘導的肝癌發生模型，通過將二乙基亞硝胺（DEN）與重復CCl4（圖3A）組合來描述內皮DGKG在HCC進展中的作用。使用該模型，作者驗證DGKG敲除在攜帶HCC的小鼠中導致較低的腫瘤數量、較小的腫瘤體積和最大化的OS（圖3B-3F）。一致地，在HCC的原位移植模型中，作者觀察到在注射AAV遞送的DGKG敲低的EC的小鼠中對腫瘤進展的類似抑制（圖3G-3L）。

       為更好地定義腫瘤內皮異質性和DGKG的潛在作用，作者使用10 x Genomics平臺對來自DGKG^flox/flox和DGKG^Tek-/-小鼠的HCC腫瘤組織進行scRNA-seq。比較DGKG^flox/flox和DGKG^Tek-/-小鼠之間的DEGs顯示，與上皮細胞遷移和粘著斑相關的生物過程和途徑在DGKG^flox/flox組中富集，表明DGKG是侵襲性腫瘤血管生成所需的（圖3M和3N）。由于腫瘤血管內皮細胞對免疫微環境的調節已被廣泛報道，作者使用CyTOF分析DGKG在TME重構中的作用。總共70000個免疫細胞，根據它們的標志物表達聚類成10個亞型（圖3O和3P）。如圖3Q中所示，TGKG^Tek-/-小鼠中的Tregs顯著降低。scRNA-seq和CyTOF數據分析表明，內皮DGKG表達與腫瘤血管生成和免疫逃避之間呈正相關，表明DGKG上調在HCC進展中的作用。

圖3 scRNA-seq和CyTOF分析揭示內皮細胞DGKG在HCC進展中的關鍵雙重作用

4. 內皮特異性DGKG缺陷促進血管正常化并促進Treg分化

       如上所述，內皮DGKG促進腫瘤血管生成和Treg浸潤。因此，為證實DGKG的作用，進行體內研究，其顯示在肝癌發生模型中，與DGKG^flox/flox小鼠相比，DGKG^Tek-/-小鼠中CD31標記的腫瘤血管減少（圖4A）。同時，在DGKG^Tek-/-小鼠中沿著腫瘤血管的NG2⁺周細胞覆蓋顯著增強，表明內皮DGKG缺失有效地促進腫瘤血管的完整性（圖4B）。此外，作者檢查內皮DGKG缺失對腫瘤浸潤免疫細胞的影響。HCC腫瘤的流式細胞術分析顯示，在DGKG^Tek-/-小鼠中，浸潤性T淋巴細胞的存在減少，細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的存在增加（圖4C和4D）。一致地，AAV遞送的特異性DGKG敲低在受損的腫瘤血管生成和Treg支持的免疫抑制方面表現出相似的表型（圖4E-4H）。此外，作者將患有HCC的患者分類為低和高內皮DGKG表達組，這表明CD31⁺血管EC中的DGKG高表達與更致密的血管顯著相關（圖4I和4J）。此外，mIHC染色的結果顯示，與DGKG低表達組相比，DGKG高表達組中Tregs（CD4⁺和FOXP3⁺）和CTLs（CD8⁺和粒酶B⁺）的積累分別顯著增加和減少（圖4K-4M）。這些發現有力地表明，內皮DGKG缺陷抑制腫瘤血管生成和Treg分化，促進血管完整性和CTLs擴增，表明內皮DGKG在HCC進展中是必需的。

圖4 內皮DGKG促進腫瘤血管生成和免疫逃逸

5. ZEB2是DGKG的功能性結合伴侶

       為揭示內皮DGKG介導的HCC進展的潛在機制，作者進行免疫沉淀-質譜（IP-MS）分析以探索與DGKG相互作用的蛋白質（獨特肽>2），并將其與蛋白質組學（倍數變化>1.5；p<0.05）組合以鑒定與DGKG過表達相關的豐度改變的蛋白質（圖5A-5C）。結果顯示ZEB2作為與DGKG相互作用并受DGKG調節的潛在靶標（圖5D）。ZEB2是上皮-間質轉化（EMT）的調節劑，據報道，EMT參與血管生成和免疫應答。因此，作者推測ZEB2可能是DGKG功能所必需的。隨后，作者通過外源性免疫共沉淀（Co-IP）、內源性Co-IP和谷胱甘肽S-轉移酶（GST）下拉測定驗證DGKG和ZEB2之間的直接相互作用（圖5E-5G）。進一步的分子作圖測定揭示，鋅指（ZF）結構域（殘基256-429）是DGKG的主要片段，其負責與ZEB2的同源結構域（HD;殘基488-703）結合（圖5H-5J）。

6. DGKG防止ZEB2泛素化降解

       此外，基于蛋白質組學數據，作者研究DGKG對ZEB2表達的影響。蛋白質印跡顯示，在DGKG過表達后，ZEB2蛋白表達增加，并且在DGKG敲低后，ZEB2蛋白表達降低（圖5K）。另外，DGKG的上調在蛋白質合成抑制劑CHX（圖5L和5M）的存在下維持ZEB2的穩定性。蛋白酶體抑制劑MG132而不是氯喹（CQ）逆轉DGKG敲減誘導的ZEB2水平的降低，表明DGKG以蛋白酶體介導的方式調節ZEB2穩定性（圖5N）。因此，ZEB2的泛素化分別通過DGKG的下調和上調而增強和抑制（圖5O）。此外，DGKG抑制ZEB2的K48連接的泛素化（圖5P和5Q）。總之，這些結果表明DGKG以泛素依賴的方式穩定ZEB2。

圖5 DGKG與ZEB2相互作用并促進其與k48相關的去泛素化

7. DGKG通過招募USP16增強ZEB2去泛素化

       考慮到DGKG不能直接影響蛋白質泛素化，作者假設存在一種介導DGKG調控的ZEB2表達的泛素化酶。在IP-MS數據庫中，USP16、USP39、TRIM21和NEDD4是負責DGKG介導的ZEB2表達的潛在候選物（圖6A）。值得注意的是，僅USP16與DGKG和ZEB2相互作用并抑制ZEB2的K48連接的泛素化和蛋白質降解（圖6B-6E）。更重要的是，DGKG特異性增強USP16和ZEB2之間的相互作用（圖6F）。GST下拉測定顯示DGKG充當促進ZEB2-USP16相互作用的平臺（圖6G）。此外，DGKG特異性增強由USP16誘導的ZEB2的K48連接的去泛素化（圖6H）。

       此外，作者模擬DGKG/ZEB2/USP16三聯體的3D結構，對接結果顯示DGKG的256-429區域中的氨基酸Q359、S360、R375和K376與ZEB2的488-703區域中的氨基酸M571、I572、E573、N574和N576相互作用（圖6I和6J）。因此，作者突變DGKG和ZEB2之間的結合位點，所有這些位點都突變為丙氨酸。Co-IP實驗表明，DGKG和ZEB2之間的相互作用DGKG（Flag-DGKG-BS-Mut）或ZEB2（HA-ZEB2-BS-Mut）結合位點中的突變所消除（圖6K）。此外，當DGKG與ZEB2的結合位點突變時，DGKG在募集USP16與ZEB2結合、減少ZEB2泛素化和增加ZEB2蛋白表達中的作用被消除（圖6L和6M）。總的來說，作者認為DGKG可能是一個支架，用于增強ZEB2和USP16的結合，從而形成一個調節復合物，增強ZEB2的去泛素化和穩定化。

圖6 DGKG通過增強ZEB2和USP16的相互作用來增強ZEB2的去泛素化

8. 內皮細胞DGKG以TGF-β1依賴的方式通過ZEB2促進腫瘤血管生成和Treg分化

       由于細胞因子在腫瘤血管生成和免疫中起著至關重要的作用，作者推斷內皮DGKG調節細胞因子的產生，從而重塑TME。為驗證這一點，使用人類炎癥陣列來檢測DGKG過表達后介質釋放的變化。結果顯示，與對照相比，TGF-β1分泌在DGKG過表達的HUVEC中變化最顯著（圖7A和7B）。TGF-β1是TME中促進腫瘤血管生成和Treg分化的必需細胞因子，考慮到ZEB參與激活TGF-β1正反饋環以促進TGF-β1產生，作者假設DGKG通過穩定ZEB2來調節TGF-β1分泌。作者對腫瘤切片進行mIHC染色，發現DGKGflox/flox小鼠中ZEB2、TGF-β1和p-SMAD的表達顯著高于DGKGTek-/-小鼠（圖7C和7D）。

       此外，來自HCC患者的TMA的mIHC染色顯示內皮DGKG表達與內皮ZEB2表達、TGFβ1表達、血管密度和Tregs百分比正相關（圖7E-7H）。關于DGKG功能對TGF-β1的需求，作者在內皮DGKG敲低小鼠中施用r.TGF-β1來過表達TGF-β1（圖7I），并證明r.TGF-β1在很大程度上恢復DGKG敲低對腫瘤生長的抑制作用（圖7J和7K）。這些結果表明，HCC中內皮DGKG的功能主要取決于ZEB2誘導的TGF-β1過量產生，表明內皮DGKG/ZEB2/TGF-β1軸在HCC的TME中起重要作用（圖7L）。

圖7 內皮DGKG促進TGF-β1在TME中的表達和分泌

9. 靶向內皮DGKG改善小鼠中PD-1和VEGFR-2雙重阻斷的結果

       最近，靶向TME的治療策略已成為一種有前途的癌癥治療方法。在HCC小鼠模型中，雙重免疫檢查點抑制劑（抗PD-1）和抗血管生成劑（抗-VEGFR-2）阻斷具有持久的治療效果并且克服對單獨治療的抗性。由于作者的數據顯示內皮DGKG缺陷抑制腫瘤血管生成和Treg分化，基于其有希望的功效，添加抗PD-1和抗VEGFR-2可能提供協同和上級治療效果。因此，作者在小鼠原位移植腫瘤模型中評估DGKG抑制（AAV-shDGKG）、抗PD-1和抗VEGFR-2（DC101）的組合療法的功效和效用。治療3周后，DGKG抑制性小鼠顯示出顯著延緩的腫瘤生長，并且通過添加抗PD-1和DC101進一步增強這種作用，顯示出最強的腫瘤生長抑制和改善的OS（圖8A-8D）。同時，在21天的治療期間，在所有組中沒有觀察到體重的顯著變化，表明這些治療方案沒有嚴重的不良反應（圖8E）。此外，腫瘤切片中的mIHC染色顯示，三聯治療具有上級效果，導致腫瘤血管密度顯著降低，周細胞覆蓋增強，并且Treg積累降低（圖8F-8I）。表明三聯免疫療法可能提供更好和更持續的血管控制，并重塑免疫抑制微環境以產生更有效的抗腫瘤應答。

圖8 內皮DGKG抑制、免疫檢查點抑制劑和抗血管生成藥物的三聯用有效地抑制HCC的進展。

       總之，作者的研究結果表明，缺氧誘導內皮細胞特異性DGKG過表達通過募集USP16進行K48連接的去泛素化并誘導隨后的ZEB2穩定化，從而增加TGF-β1分泌，從而促進HCC中的血管生成和免疫逃避。最重要的是，內皮DGKG抑制、DC101和抗PD-1的三重組合大大改善DC101和抗PD-1的雙重組合在小鼠HCC模型中的功效，顯著抑制HCC的惡性進展并改善存活率。這項研究支持靶向內皮DGKG作為精確治療HCC的潛在策略。

實驗方法

scRNA-seq、三維（3D）共培養系統、質譜細胞術（CyTOF）、流式細胞術、Western blotting、多重免疫組化（IHC）測定、免疫熒光染色、qRT-PCR、熒光素酶報告試驗、染色質免疫沉淀（ChIP）測定、檢測磷脂酸（PA）的產生、無標記蛋白質組學分析、共免疫沉淀、GST-pull down、IP-MS、泛素化試驗、分子對接、EdU分析、遷移試驗、管形成試驗、ELISA。

參考文獻

Zhang L, Xu J, Zhou S, Yao F, Zhang R, You W, Yu K, Zhang Y, Baheti T, Pu L, Xu J, Qian X, Xia Y, Dai X, Li Q, Wang X. Endothelial DGKG promotes tumor angiogenesis and immune evasion in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 2023 Oct 12:S0168-8278(23)05170-X. doi: 10.1016/j.jhep.2023.10.006. Epub ahead of print. PMID: 37838036.