甲基轉移酶樣3（METTL3）/METTL14的復合物主要催化m6A修飾，影響mRNA的穩定性。盡管METTL14 R298P突變在多種癌癥類型中被發現，但是其生物學作用還未被完全理解。在這里，研究展示了雜合R298突變促進了癌癥細胞增殖，而純合突變減少增殖。甲基化RNA免疫沉淀測序分析表明，R298P突變減少了典型基序上的m6A修飾。而且，這種突變誘導了m6A修飾的異常基序，這只在含有純合突變的細胞系中是最明顯的。對m6A修飾位點的異常識別改變了周圍典型基序的甲基化效率。一個例子是c-MET mRNA，它高度甲基化，規范基序靠近異常甲基化位點。因此，c-MET mRNA嚴重不穩定，降低c-Myc表達并抑制細胞增殖。這些數據表明METTL14 R298P突變影響m6A修飾的靶識別，擾亂基因表達模式和細胞生長。本研究于2023年7月發表于《Cell Rep》上，IF：8.8。

圖形摘要

技術路線

主要研究內容

1、雜合子和純合子METTL14 R298P突變對癌細胞增殖的影響相反

       為了研究癌癥相關的METTL14 R298P突變如何影響m6A甲基化模式及其生物學后果，研究首先利用基于CRISPR-Cas9的同源重組建立了攜帶METTL14 R298P突變的子宮內膜癌細胞系（HEC108），并成功獲得了在雜合狀態（METTL14^+/Mu）或純合狀態（METTL14^Mu/Mu）下攜帶METTL14 R298P突變的多個克隆，并插入用于增加同源重組的沉默突變（SMs）（圖1B和1C）。研究觀察到METTL14 R298P突變不影響METTL14或Mettl3的蛋白表達（圖1D）。此外，與公共數據庫中METTL14在HEC108細胞中的拷貝數為2一致，研究觀察到研究建立的METTL14突變的HEC108細胞系中也含有METTL14基因的兩個拷貝（圖1E和1F）。

       然后，研究在體外和體內評估了METTL14 R298P突變如何影響細胞增殖。與野生型（METTL14^+/+）細胞相比，攜帶METTL14^+/Mu突變的HEC108細胞在體外表現出更強的細胞增殖率（圖2A）。相反，METTL14^Mu/Mu突變顯著降低了細胞增殖率；對所有檢測的克隆也觀察到類似的結果。研究通過在單獨含有SMs的METTL14轉基因的HEC108細胞中表達METTL14蛋白來檢測SMs的作用。這些分析表明，SMs不影響蛋白表達和細胞活性（圖S2A和S2B），這表明細胞增殖率的差異是由雜合和純合的R298P突變引起的，而不是SMs。為了在體內評估這種差異，研究通過裸鼠皮下注射HEC108細胞建立異種移植瘤小鼠模型。研究觀察到METTL14^+/Mu細胞形成的腫瘤明顯大于METTL14^+/+細胞，而攜帶METTL14^Mu/Mu突變的細胞形成的腫瘤明顯較小（圖2B和S2C）。此外，當腹腔注射到小鼠體內時，METTL14^+/Mu細胞形成的腹膜腫瘤明顯更多。另一方面，METTL14^Mu/Mu細胞形成的腫瘤明顯較少（圖2C和S2D）。

       接下來，研究從ICGC中檢索了RNA-seq結果，并確定了癌癥患者中METTL14突變的合子性。研究在這些患者中沒有觀察到METTL14基因拷貝數的改變（圖S2E）。相反，在大多數情況下，METTL14 R298P和R298H突變的等位基因頻率均小于50%，這表明該突變在大多數癌癥樣本中為雜合突變（圖2D）。這些數據表明，在雜合狀態下，在癌癥樣本中發現的METTL14 R298P突變促進致瘤性，而在純合狀態下，它對癌癥進展具有抑制作用。

圖1：基因組編輯技術構建METTL14 R298P突變子宮內膜癌細胞系

圖2：雜合和純合METTL14 R298P突變對癌細胞增殖的相反作用

圖S2：METTL14 R298P突變在體內確實影響腫瘤進展

2、METTL14 R298P突變減少了m6A修飾

       為了闡明METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu突變對癌細胞增殖產生相反影響的分子機制，研究比較了每種基因型中m6A修飾的數量。質譜分析顯示，METTL14^+/Mu細胞中m6A修飾水平顯著降低，METTL14^Mu/Mu細胞中m6A修飾水平進一步降低（圖3）。研究進一步證實SMs不影響m6A修飾（圖S2F）。這些結果表明METTL14 R298P突變以突變蛋白劑量依賴的方式降低m6A修飾的總水平；然而，簡單的酶活性喪失或靶標識別并不一定是造成METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu細胞增殖率差異的明顯原因。

圖3：METTL14 R298P突變減少子宮內膜癌細胞系中m6A修飾

3、突變體METTL14（R298P）識別異常基序進行m6A修飾

       鑒于METTL14在靶標識別中發揮作用，研究接下來考察了R298P突變是否影響m6A修飾模式。研究進行了MeRIP-seq分析，通過使用抗m6A抗體進行RNA免疫沉淀，將m6A修飾位點確定為測序reads的增加高度，即一個峰值。這些分析表明，大部分靶基因在METTL14^+/+、METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu細胞中共享（圖4A）。此外，三種基因型的MeRIP-seq峰均在終止密碼子周圍高度富集（圖4B）；這種分布模式與之前的MeRIP-seq研究相似。然而，盡管[U/A/C]GGAC[U/A]（=HGGACW）序列基序對應于已知的m6A修飾位點的典型基序，但通常富集在METTL14^+/+和METTL14^+/Mu細胞來源的RNA的峰值中，研究在METTL14^Mu/Mu細胞來源的RNA的峰值中檢測到了一個不同的基序，即G[G/A]A[C/U]U（=GRAYU）。在該基序中，靶向A的30位為C和U的混合物，目前尚未見報道。然而，CentriMo分析顯示，該異常基序位于MeRIP-seq峰的中心區域，與METTL14^+/+和METTL14^+/Mu樣品中發現的典型基序相似（圖S3A-S3C），這支持了研究分析的穩健性。這些結果表明，R298P突變可能改變了METTL14的靶標識別。

       研究進一步分析了突變體METTL14識別基序，通過使用exomePeak和MetDiff分析，重點關注每個基因型之間差異甲基化的MeRIP-seq峰。exomePeak分析表明，與METTL14^Mu/Mu細胞相比，METTL14^+/+和METTL14^+/Mu細胞中甲基化程度更高的峰中顯著富集了一個典型的含5’-AC-3’的基序（圖S4A）。相比之下，METTL14^Mu/Mu細胞中異常的5’-AU-3’基序富集在296個峰中，與METTL14^+/+細胞相比，METTL14^Mu/Mu細胞中甲基化程度更高。在這296個峰中，有512個典型的m6A修飾位點在m6A-Atlas數據庫（http://180.208.58.19/m6A-Atlas/）中注冊。在這些位點中，無論METTL14基因型如何，抗m6A抗體RNA免疫共沉淀獲得的平均測序reads深度均顯著高于所有腺苷，這表明這些典型位點仍然可以被突變體METTL14（R298P）甲基化（圖4D）。相比之下，GGAUU和GAAUU基序中腺苷的免疫沉淀測序reads的平均深度在METTL14^+/Mu樣本中顯著富集，而在METTL14^+/+樣本中未觀察到。這種富集在METTL14^Mu/Mu樣本中進一步增強（圖4D）。此外，MeTDiff分析檢測到的差異甲基化峰比exomePeak檢測到的多，在METTL14^Mu/Mu細胞中甲基化程度較低的峰中再次檢測到典型的5’-AC-3’基序，而在METTL14^Mu/Mu細胞中甲基化程度較高的峰中富集了異常的5’-AU-3’基序。這些數據表明，雖然METTL14（R298P）可以在一定程度上識別典型的模體，但該突變蛋白也可以甲基化異常的5’-AU-3’模體中的腺苷。

圖4：純合子METTL14 R298P突變誘導的靶標異常識別

圖S3：MeRIP-Seq峰內基序的分布

4、在METTL14^Mu/Mu細胞中，盡管m6A修飾減少，但c-Myc mRNA的表達減少

       為了鑒定受m6A修飾調控并參與細胞增殖分子通路的基因，研究利用基因集富集分析（GSEA）比較了不同METTL14基因型之間的基因表達情況。分析發現，與METTL14^+/+細胞相比，METTL14^+/Mu細胞中原癌基因c-Myc所靶向基因的表達水平顯著增加（圖5A）。c-Myc抑制劑以劑量依賴的方式降低HEC108細胞的活力，表明c-Myc有助于這些細胞的增殖（圖5B）。已知c-Myc mRNA的表達受m6A修飾調控，研究在MeRIP-seq分析中觀察到多個甲基化峰，其中包括典型位點（圖5C）。為了檢測HEC108細胞中c-Myc mRNA的穩定性是否受m6A修飾的調控，研究檢測了加入Act.D抑制轉錄后c-Myc mRNA的降解率。該分析顯示，METTL14^+/Mu和METTL14^Mu/Mu細胞中m6A的降解率均顯著降低（圖5D），表明METTL14（R298P）突變導致m6A修飾的減少穩定了c-Myc mRNA。

       然而，盡管METTL14^+/Mu細胞中c-Myc mRNA的表達顯著增加，但在METTL14^Mu/Mu細胞中c-Myc mRNA的表達降低（圖5E）。相應地，GSEA結果顯示，與METTL14^+/+細胞相比，METTL14^Mu/Mu細胞中c-Myc靶基因的表達水平顯著降低（圖5F）。突變體METTL14（R298P）識別的異常基序在c-Myc mRNA中未發生甲基化（圖5C）。總的來說，這些數據表明m6A修飾的減少穩定了c-Myc mRNA，這可能有助于在METTL14^+/Mu細胞中發現的細胞增殖增加，而在METTL14^Mu/Mu細胞中，c-Myc mRNA表達降低的某種機制很可能主導了m6A修飾對c-Myc mRNA的影響。

圖5：Myc mRNA被METTL14 R298P突變穩定

5、異常的m6A修飾使c-MET mRNA不穩定，導致c-Myc表達減少

       為了檢測異常識別基序的m6A修飾對基因表達的影響，研究比較了METTL14^+/+和METTL14^Mu/Mu細胞中含有差異甲基化峰的基因的表達水平。與METTL14^Mu/Mu細胞相比，METTL14^+/+細胞中甲基化程度更高的峰值基因顯著上調（圖6A）。然而，研究沒有觀察到與突變體METTL14（R298P）識別的異常基序富集的峰的基因有類似的差異。因此，研究進一步將METTL14^Mu/Mu細胞中甲基化水平較高的基因（285個基因）分為兩個亞組，一個具有典型m6A位點（174個基因），另一個不具有典型m6A位點（111個基因），并分析了相應基因的表達情況，觀察到具有典型m6A位點的基因表達水平顯著降低（圖6B）。這些數據表明，異常的m6A修飾可能會改變典型基序的甲基化效率，從而影響相應mRNA的穩定性。

       為了確定受異常m6A修飾影響并參與c-Myc上游信號通路的基因，研究重點關注c-MET，這是另一個受m6A修飾調控的原癌基因，已知在子宮內膜癌中發揮關鍵作用。作者的GSEA證明，在METTL14^Mu/Mu細胞中c-MET靶標的表達強烈下調（圖7A）。相應地，METTL14^Mu/Mu中c-MET mRNA表達量顯著降低，導致c-MET蛋白表達量降低（圖7B、7C）。在METTL14^+/Mu細胞中未觀察到這種變化。有趣的是，exomePeak分析檢測到與METTL14^+/+細胞相比，METTL14^Mu/Mu在終止密碼子周圍甲基化程度更高的MeRIP-seq峰，其中包括4個異常基序（圖7D）。

       研究測定了加入Act.D抑制轉錄后c-MET mRNA的降解率。該分析證明METTL14^Mu/Mu細胞中的降解率顯著增加（圖7E）。此外，c-MET抑制劑foretinib的加入降低了METTL14^+/+和METTL14^+/Mu細胞中c-Myc的表達和細胞活力（圖7F和圖7G）。綜上所述，在METTL14^Mu/Mu細胞中，靠近異常m6A修飾位點的典型基序甲基化效率的增加很可能促進了c-MET mRNA的去穩定化，從而導致c-Myc的表達降低，細胞增殖受到抑制（圖S6）。

圖6：突變體METTL14（R298P）介導的異常m6A修飾在規范m6A位點存在時降低基因表達

圖7：突變METTL14介導的異常m6A修飾破壞c-MET mRNA的穩定性

圖S6：細胞增殖受m6A修飾c-MET和cMyc mRNA的調控

實驗方法

表達Cas9和gRNA質粒的構建，METTL14 R298P突變敲入細胞，METTL14穩定表達細胞系的建立，Western blot，定量PCR，質譜法測定m6A含量，抗m6A抗體對m6A進行定量，體外和體內細胞增殖，細胞活力，拷貝數量變異檢測，異種移植瘤小鼠模型，MeRIP-seq，GSEA，公共數據庫中RNA-Seq分析，聯合分析MeRIP-seq和RNA-Seq

參考文獻

Miyake K, Costa Cruz PH, Nagatomo I, Kato Y, Motooka D, Satoh S, Adachi Y, Takeda Y, Kawahara Y, Kumanogoh A. A cancer-associated METTL14 mutation induces aberrant m6A modification, affecting tumor growth. Cell Rep. 2023 Jul 25;42(7):112688. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112688. Epub 2023 Jun 23. PMID: 37355987.