非酒精性脂肪性肝炎（NASH）以脂肪變性、小葉炎癥、肝細胞球囊變形和纖維化為特征，所有這些增加了NASH發展為終末期肝病的風險。骨橋蛋白（OPN，SPP1）在巨噬細胞（MF）中發揮重要作用，但MF衍生的OPN是否影響NASH進展是不知道的。研究分析了來自NASH患者的公開轉錄組數據集，并使用在髓系細胞和肝臟MFs中條件性過表達或敲除SPP1的小鼠，模擬西方飲食給予它們高脂、果糖和膽固醇飲食，以誘導NASH。本研究證明高表達SPP1的MFs在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）患者和小鼠中富集，并表現出代謝但非促炎特性。在髓系細胞中條件性敲除SPP1（SPP1^{KI Mye}）或在肝巨噬細胞中條件性敲除SPP1（SPP1^{KI LvMF}）可提供保護作用，而在髓系細胞中條件性敲除SPP1（SPP1^ΔMye）可加重NASH。這種保護作用是通過誘導精氨酸酶-2（ARG2），增強肝細胞中脂肪酸氧化（FAO）來介導的。ARG2的誘導源于SPP1^{KI Mye}小鼠MFs中制瘤素- M（OSM）產量的增加。OSM激活STAT3信號，從而上調ARG2。除了肝臟作用外，SPP1^{KI Mye}還通過性別特異性的肝外機制發揮保護作用。MF來源的OPN通過上調OSM，通過STAT3信號增加ARG2，從而保護NASH。進一步，ARG2介導的FAO增加減少了脂肪變性。因此，增強MFs和肝細胞之間的OPN - OSM - ARG2對話可能對NASH患者有益。本研究于2023年6月發表在期刊《Gastroenterology》上，IF=29.4。

技術路線

主要研究內容

1、Kupffer cells (KCs)中SPP1信使RNA表達較高的患者脂肪變性評分相對較低

       轉錄組數據集GSE135251（206位NAFLD患者）揭示了SPP1 mRNA表達與NAFLD活性評分（NAS）和纖維化評分有著顯著相關性（圖1A）。轉錄組數據集GSE126848，GSE135251和GSE167523（335位NAFLD患者）顯示，45個基因均與SPP1表達相關。將這45個基因與人類scRNA seq數據集GSE136103（健康個體和肝硬化患者）進行比對，鑒定出9個在髓系細胞中表達的基因，其中3個是骨髓細胞特異性的（TREM2, MMP9, OLR1）（圖1B）。scRNA seq數據集GSE136103的細胞聚類鑒定出SPP1高表達的MF集群（SPP1^High MFs），TREM2（LAM的標記物）也高表達。此外，NASH患者原發Kupffer cells（KC）的RNA-seq顯示，KCs中SPP1表達較高的患者脂肪變性評分相對較低（圖1C）。因此，盡管肝中SPP1 mRNA與NASH進程相關，是否MF源性的OPN保護或傷害了肝臟，需要進一步的調查。

圖1- KCs中SPP1 mRNA表達較高的患者脂肪變性評分相對較低

2、在NASH病人和小鼠中，OPN蛋白表達的增加

       為證實NASH中OPN主要的細胞來源，研究分別對NASH患者肝臟進行活檢，對NASH小鼠組織進行免疫染色。NASH患者的OPN染色隨著纖維化分期逐漸增加，伴隨著OPN ⁺ MF簇，通過免疫組織化學鑒定OPN（或SPP1）和CD68共定位（圖1D）。對照組小鼠在膽管上皮細胞中OPN表達受限，周圍肝細胞和非實質性肝細胞中的染色很少（圖1E，top left）。NASH小鼠的肝細胞和MF中OPN表達受到誘導（圖1F，bottom left），后者進一步說明了SPP1和EMR1的共定位。這些結果證實，MF增加了人類和小鼠NASH中OPN的表達。

3、OPN mRNA表達上調的MF在NASH中顯示代謝表型

       為理解OPN⁺MFs的功能，研究分析了NASH小鼠的一個公共的單細胞測序數據GSE129516。MF群體的亞聚類 鑒定出5個簇（KC[1]， cyclin -KC, LAM[1]， LAM[2]，SPP1^High MFs）與對照組相比，在NASH中SPP1表達增加。其中，SPP1^High MFs中SPP1的表達最高，同時和LAM標記物（Trem2、Gpnmb、Cd9）的表達最高（圖1F）。差異表達（DE）分析揭示了SPP1^High MFs具有相對較低水平的參與炎癥（Il1b、S100a4）和纖維化（Tgfb）的基因，但參與脂質代謝（Cd36、Lpl、Fabp5、Fabp4、Fabp7）和細胞外基質重塑（Mmp12、Mmp13）的基因水平較高（圖1F）。同樣，與其他LAMs相比，這些差異在SPP1^High MFs中也被觀察到；然而，與LAM[2]相比，它們的SPP1表達水平為中等水平。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）預測與其他MFs相比，SPP1^High中參與炎癥的通路（白細胞外滲、IL6、HMGB1）受到抑制，但在脂質代謝（LXR / RXR、PPAR α / RXR α）中上調。這些結果表明，OPN在MFs中的上調賦予了NASH的代謝特性，而不是炎癥特性。

4、髓系細胞SPP1敲入小鼠（SPP1^{KI Mye}）可預防NASH

       為了解MFs中OPN的誘導如何促進NASH進展，研究準備了SPP1^{KI Mye}小鼠。SPP1^{KI Mye}和WT小鼠用對照或NASH誘導的飲食喂養6個月。WT小鼠（雄和雌均有）發展為NASH，表現為嚴重的脂肪變性、炎癥和肝細胞氣球樣變，分別在靠近中央和門靜脈區的微血管和大血管脂肪變性分布精細（圖2A和B）。WT雄性（NAS ? 6.4）比雌性（NAS ? 4.8）表現出更嚴重的病理改變。與WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}的兩種性別小鼠的NAS、肝體比、脂滴、肝臟TGs和膽固醇（CHO）以及谷丙轉氨酶活性均顯著降低 NASH（圖2B - D）。值得注意的是，與WT小鼠相比，飼料對照組雄性和雌性SPP1^{KI Mye}小鼠NAS和肝臟TGs水平更低（圖2B - D）。

       與SPP1^{KI Mye}相比，WT小鼠SPP1^{KI Mye}肝臟中MoMFs（CD45 α β CD11b^HighF4 / 80^LowLy6G）數量減少（圖2E）。Chicken-wire纖維化存在于伴有NASH的WT小鼠中，而SPP1^{KI Mye}小鼠無此表現（圖2F）。

圖2-SPP1^{KI Mye}小鼠可免受NASH的侵害

5、肝臟駐留MFs中敲入SPP1的小鼠也可預防NASH

       正如Lyz2 . Cre同時靶向肝內和肝外MFs（4A），過表達SPP1小鼠（SPP1^{KI Lv MF}）僅存在于肝臟MFs中。雖然SPP1^{KI Mye}在循環的單核細胞中有顯著的SPP1過表達，但在SPP1^{KI LvMF}小鼠中卻沒有。喂養NASH誘導飲食6個月后，H & E染色顯示SPP1^{KI LvMF}小鼠免于NASH，肝體比、NAS、肝臟TGs和CHO降低。然而，與SPP1^{KI Mye}不同的是，雄性和雌性同樣受到保護。因此，肝臟駐留的MFs在SPP1^{KI Mye}小鼠對NASH的保護作用中發揮主要作用。

6、骨髓細胞SPP1消融的小鼠（SPP1^ΔMye）加速發展為NASH

       為研究去除髓系細胞中的SPP1是否會加重NASH，研究構建了SPP1^ΔMye小鼠，并將其飼喂對照或NASH誘導的飲食長達6個月。研究通過H & E染色、NAS、肝臟TGs和CHO發現，與WT小鼠相比，SPP1^ΔMye加重了NASH，特別是在（1個月和3個月）的早期時間點，與6個月相比。在6個月時，肝臟有更多的炎癥，表現為炎癥灶增加，冠狀樣結構，以及Tnf和Mpo表達。因此，SPP1^ΔMye在早期時間點加速進展為NASH，并在后期增加炎癥。

7、患有NASH的SPP1^{KI Mye}小鼠含有較少的飽和與單不飽和脂肪酸

       為了確定與WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}中FA代謝的變化是否對NASH具有保護作用，研究對其肝臟進行了非靶向代謝組學和脂質組學分析。從鑒定的TGs的峰強度發現，SPP1^{KI Mye}和WT小鼠之間的倍數變化（fold change，FC）與TGs的總碳原子數呈強正相關，與飽和狀態呈中度相關。統計分析發現，與WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}合并NASH小鼠有35個TG發生了顯著變化。在主要的變化中，大多數含有飽和脂肪酸的TGs下調，而含有超長鏈多不飽和脂肪酸的TGs在SPP1^{KI Mye}小鼠NASH中上調（圖3A）。

圖3-尿素循環增加和ARG2上調與SPP1^{KI Mye}小鼠的保護作用相關

8、由于肝細胞中Arg2表達增加，TGs減少與尿素循環上調有關

       接下來，相關性分析發現88個代謝物（圖3B，聚類2）與顯著降低的TGs（圖3B，聚類3）呈高度負相關（平均r > 0.7）。通過Small Molecule Pathway Database對88個代謝物進行富集，提示氨循環、肉堿合成和尿素循環的上調（圖3C）。事實上，無論飲食如何，SPP1^{KI Mye}小鼠的肝臟中，尿素循環的代謝物（L -鳥氨酸、L -瓜氨酸、L -延胡索酸）和下游的L -蘋果酸都顯著上調（圖3D）。這被血清中增加的尿素和減少的氨所證實（圖3E和F）。qPCR結果顯示，無論飲食增加與否，Arg的線粒體亞型Arg2在SPP1^{KI Mye}小鼠肝臟中增加，而尿素循環酶幾乎不受影響（圖3G），并且Arg2在SPP1^ΔMye小鼠肝臟中的表達降低。免疫熒光分析發現SPP1^{KI Mye}小鼠原代肝細胞中存在ARG2的誘導表達（圖3H，上）。同樣，共定位研究進一步表明，在對照飲食的WT小鼠中，ARG2主要在3區的肝細胞中表達，而在NASH中，ARG2在1區和2區的肝細胞中表達增加。值得注意的是，在SPP1^{KI Mye}小鼠中，肝細胞中ARG2的上調是泛小葉（圖3H，底）。因此，3-硝基酪氨酸（3-NT）殘基的存在主要在肝細胞中減少（圖3I），這是一種由過量NO觸發的翻譯后修飾，由精氨酸通過NOS2轉化為瓜氨酸產生。

9、在SPP1^{KI Mye}小鼠中上調ARG2介導FAO升高

       先前的研究表明，ARG2調節線粒體動力學并保護肝臟脂肪變性。代謝組學分析顯示，肉堿穿梭體的組分在SPP1^{KI Mye}小鼠肝臟中顯著上調（圖4A）。脂肪酸氧化（FAO）受NAD +/NADH比值的變構調節。在整個肝臟中，與WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}中NAD+/NADH比值和ATP水平顯著增加（圖4B和C）。Mitotracker染色顯示，與WT肝細胞相比，SPP1^{KI Mye}中線粒體紅色熒光較高，但結構相似（圖4D）。JC - 1染色結果顯示，與WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}小鼠肝細胞JC - 1聚體/單體比例增加，提示線粒體膜電位升高（圖4E）。為檢測棕櫚酸（PA）對線粒體FAO的影響，研究監測了棕櫚酸（PA）處理的肝細胞的耗氧率（OCR）。與WT小鼠相比，來自SPP1^{KI Mye}的肝細胞最小地增加了基礎OCR，但增加了約2倍的最大呼吸容量和約3倍的剩余呼吸容量（圖4F）。與用牛血清白蛋白和PA處理的WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}的肝細胞中ATP生成輕度增加（圖4F）。值得注意的是，與使用牛血清白蛋白和PA的WT小鼠相比，來自SPP1^{KI Mye}的肝細胞中質子泄漏顯著增加，在此過程中能量耗散而不產生ATP（圖4F）。為確定ARG2是否介導了SPP1^{KI Mye}小鼠肝細胞中FAO的增加，研究使用小干擾RNA（siRNA）敲低Arg2，使其減少> 90 %，但不影響細胞活力。OCR檢測發現，敲低Arg2顯著抑制了最大呼吸容量、剩余呼吸容量和質子漏（圖4G）。此外，PA處理過夜的WT與SPP1^{KI Mye}肝細胞相比，具有更多的脂滴，但用Arg2 siRNA處理后則相反。因此，在肝細胞中上調ARG2通過增加線粒體呼吸和FAO來減少脂質積累。為進一步證明ARG2在NASH中的作用，研究構建了肝細胞條件性敲除Arg2的小鼠（Arg2^ΔHep），并給予NASH誘導飲食6周。兩種性別的Arg2^ΔHep均表現出比WT小鼠更嚴重的NASH，這歸因于脂肪變性、炎癥和TG的增加（圖4H和I）。

圖4 -上調ARG2介導SPP1^{KI Mye}小鼠的FAO升高

10、SPP1^{KI Mye}和誘導型飼料驅動了MFS中的性別特異性轉錄組

       為了解SPP1^{KI Mye}是否在肝臟源性的MFs中驅動特定的表型，從飼喂對照或NASH誘導飲食6個月的SPP1^{KI Mye}和WT小鼠中分選出MFs，并通過RNA seq進行轉錄組分析。與對照相比，在NASH的WT小鼠中觀察到未報告的MF轉錄組性別差異。

       與WT相比，飼喂對照組SPP1^{KI Mye}雄性小鼠有362個DE基因（289個上調，73個下調），但大多數只表現出輕微的變化（FC < 2）。與WT小鼠相比，喂食NASH誘導飲食的SPP1^{KI Mye}小鼠DE基因增加到822個（736個上調，86個下調）。然而，飼喂對照或NASH誘導飲食的小鼠之間幾乎沒有重疊的DE基因（5個上調, 1個下調）（圖5A）。Pathway分析顯示，基于正Z - score，對照飲食組的DE基因富集到參與組織重塑的通路（VEGF信號，肝纖維化，凝血酶，G6P信號）（圖5B）。一些炎癥通路上調，而IL6和TREM1信號下調（圖5B）。脂質代謝受到的影響最小（圖5B）。值得注意的是，STAT3和JAK/STAT信號通路表達上調（圖5B）。在NASH誘導的飲食組中觀察到更強烈的與組織重塑相關的變化，表現為膠原蛋白、纖維蛋白原和凝血因子的上調（圖5B和C）。在喂養NASH誘導飲食的小鼠中，SPP1^{KI Mye}對炎癥的影響最小（圖5B）。然而，Il1rn，Il10和Tnf表達上調，而Ccl2，Il1b和Il6不受影響。此外，SPP1^{KI Mye}有很多上調基因和通路參與脂質代謝（LXR / RXR , TG降解, FAO , PPARα / RXR α激活）和（圖5B和C）。值得注意的是，尿素循環在SPP1^{KI Mye} MFs中上調，表現為Arg1、Cps1和Otc的表達量顯著增加，Arg2的表達量略有增加（圖5B和C）。

       DE分析發現，對照組雌性組有1026個（403個上調，623個下調）基因發生改變，而NASH誘導組雌性組基因減少到553個（256個上調，297個下調）。與雄性不同的是，對照組和飼喂NASH飲食誘導組之間的DE基因具有良好的重疊（65個上調，118個下調）（圖5D）。在飼喂對照雌鼠中，組織重塑輕度下調，除TGFB信號外，大多數炎癥和脂質代謝通路均下調（圖5E）。STAT3信號與對照飲食的雄性SPP1^{KI Mye} MFs一樣輕度上調。在NASH誘導飲食的雌鼠中，與WT小鼠（急性期反應、IL6、TNFR1信號）相比，由于細胞因子（Il1a、Il1b、Tnf、Ccl2、Ccl3、Ccl5）下調，SPP1^{KI Mye}來源的MFs有幾個關鍵的促炎通路下調（圖5E和F）。雌性SPP1^{KI Mye}小鼠中負責脂質代謝的基因和通路（Abcg5、Apoa1、Apoa2）下調（圖5E和F）。雖然沒有Z - score可用，但在NASH誘導飲食的小鼠SPP1^{KI Mye} MFs中，尿素循環也受到影響（圖5E）。值得注意的是，2型糖尿病 信號在男性中不受影響，但在女性NASH患者的SPP1^{KI Mye} MFs中下調（圖5E）。因此，SPP1^{KI Mye}驅動性別特異性效應，其在小鼠喂食控制或NASH誘導飲食也不同的作用。

圖5- SPP1^{KI Mye}和喂養NASH誘導飲食驅動MFs的性別特異性轉錄組

11、SPP1^{KI Mye}驅動Oncostatin-M表達通過STAT3誘導Arg2

       接下來，與WT小鼠相比，SPP1^{KI Mye}小鼠MFs中上調的基因具有更寬的cutoff P <.05且FC>1.5（性別合并），并與已發表的小鼠分泌蛋白列表進行比較。存在16個基因（包括SPP1）編碼SPP1^{KI Mye}驅動的分泌蛋白的mRNA（圖5G）。

       然后，研究通過從IPA中提取分子相互作用，構建了從編碼分泌蛋白的16個基因到Arg2的預測調控網絡，以可視化亞細胞定位和節點連接。結果表明，6種分泌蛋白（包括OPN）可能通過53種相互作用調控Arg2的表達。制瘤素-M（OSM）、THBS1和OPN在網絡中的連接度最高（圖6A）。其中Osm具有最高的DE，并且可以通過STAT3，p38 MAPK和ERK潛在誘導Arg2（圖6A）。為檢測這種可能性，首先，研究從WT和SPP1^{KI Mye}小鼠中分離MFs，并培養72小時。SPP1^{KI Mye}小鼠的MF裂解液和培養基中OSM表達增加。然后，研究使用siRNA（附圖8B ,上）在原代肝細胞中敲除OSM受體（Osmr）。最后，研究用WT和SPP1^{KI Mye} MFs的條件培養基培養WT和Osmr null肝細胞24 h。來自SPP1^{KI Mye} MFs的條件培養基增加了WT肝細胞中ARG2的表達和STAT3的磷酸化；然而，這些效應在Osmr敲除的肝細胞中被減弱（圖6B和C）。在PA和SPP1^{KI Mye} MFs條件培養基的存在下，WT而不是Osmr null肝細胞具有較少的脂滴（圖6C）。為進一步證實這一點，研究注射了OSM中和抗體的SPP1^{KI Mye}小鼠，發現與注射同型對照的小鼠相比，NASH加重，表現為H & E，ARG2減少，NAS，TGs和CHO增加（圖6D和E）。因此，在肝細胞中，SPP1^{KI Mye}驅動OSM的表達，并通過STAT3信號增加Arg2的表達。

圖6- SPP1^{KI Mye}驅動OSM的表達，OSM通過STAT3誘導Arg2

12、SPP1^{KI Mye}以性別特異性方式影響肝外FA代謝

       在肝外組織中也觀察到SPP1^{KI Mye}的性別特異性效應。6個月后，男性SPP1^{KI Mye}和WT小鼠在NASH飲食中有相似的體重增加和食物攝入量，內臟脂肪組織 (VAT)增加1.5倍，脂肪細胞大小更大（圖7A - D）。在VAT中，qPCR分析顯示Pnpla2下調但與WT小鼠相比，Lipe在雄性SPP1^{KI Mye}小鼠中不下調（圖7E）。體內脂解實驗表明，注射脂解誘導劑isoprenaline后，SPP1^{KI Mye}小鼠在血清非酯化FAs中的增加較少（圖7F）。即使在喂食NASH誘導的飲食之前也觀察到了差異，但在雄性和雌性SPP1^{KI LvMF}小鼠中丟失了（圖7F）。

       與雄性相比， NASH誘導飲食的雌性SPP1^{KI Mye}小鼠在6個月內體重增加較少（4.3 g）（圖7A），VAT /體重比和脂肪細胞大小較WT小鼠降低（圖7C和D）。SPP1^{KI Mye}雄性小鼠的食物攝入量相似，而SPP1^{KI Mye}雌性小鼠在NASH誘導的飲食中從2個月到4個月減少了食物攝入量，與體重增加減少相關（圖7B）。患有NASH的雌性SPP1^{KI Mye}小鼠具有改善的胰島素敏感性，在葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗中，隨著時間的推移，葡萄糖降低（圖7G）。在雌性SPP1^{KI Mye} VAT小鼠中，與WT小鼠相比，Pnpla2和Lipe的表達沒有變化，而Leptin的表達增加，但AdipoQ的表達沒有變化（圖7E）。因此，雄性和雌性SPP1^{KI Mye}小鼠也受到額外的性別特異性肝外機制的保護。

圖7- SPP1^{KI Mye}以性別特異性的方式影響肝外FA代謝

結論

       研究結果表明，MF來源的OPN對NASH具有保護作用。這種作用是通過上調MFs中的OSM，從而通過肝細胞中的STAT3信號增加ARG2來介導的。此外，ARG2介導的FAO增加減少了脂肪變性。因此，增強MFs和肝細胞之間的OPN - OSM - ARG2對話可能對NAFLD患者有益。

實驗方法

Spp1^fl/fl小鼠，Spp1.Stop^fl/fl小鼠，免疫組織化學，免疫熒光，轉錄組數據分析，單細胞數據分析，通路分析，相關性分析，WB，qPCR

參考文獻

Han H, Ge X, Komakula SSB, Desert R, Das S, Song Z, Chen W, Athavale D, Gaskell H, Lantvit D, Guzman G, Nieto N. Macrophage-derived Osteopontin（SPP1） Protects From Nonalcoholic Steatohepatitis. Gastroenterology. 2023 Jul;165（1）:201-217. doi: 10.1053/j.gastro.2023.03.228. Epub 2023 Apr 5. PMID: 37028770.