賴氨酸巴豆酰化(Kcr)在結(jié)直腸癌(CRC)組織中上調(diào)，但其具體作用尚不確定。本研究旨在闡明組蛋白H3 Lys27的巴豆酰化(H3K27cr)在促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。在臨床上，H3K27cr在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與晚期臨床分期呈正相關(guān)。在功能上，敲低LINC00922抑制CRC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的遷移。此外，補(bǔ)充NaCr通過恢復(fù)H3K27cr水平，恢復(fù)了LINC00922穩(wěn)定敲低細(xì)胞的遷移和侵襲水平。在機(jī)制上，LINC00922通過H3K27cr介導(dǎo)的細(xì)胞粘附分子(CAMs)促進(jìn)侵襲和遷移。值得注意的是，LINC00922與SIRT3相互作用，阻斷其與ETS1啟動子區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致該啟動子區(qū)域的H3K27cr水平升高，隨后激活ETS1轉(zhuǎn)錄。我們的發(fā)現(xiàn)揭示了由LINC00922調(diào)控的H3K27cr在促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的一種新的調(diào)節(jié)功能。這一發(fā)現(xiàn)有助于更深入地理解組蛋白巴豆酰化在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移過程中的作用。本文于2023年10月發(fā)表于Molecular Cancer （IF=37.3）上。

技術(shù)路線

結(jié)果

1）H3K27cr水平與結(jié)直腸癌組織轉(zhuǎn)移有關(guān)

       我們利用免疫組織化學(xué)染色法對45例患者的結(jié)直腸腫瘤樣本和14例患者的鄰近組織中的H3K27cr水平進(jìn)行了研究。有趣的是，研究結(jié)果顯示遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位的H3K27cr水平顯著升高(圖1A-B)。與癌旁組織相比，腫瘤組織的H3K27cr水平明顯更高(圖1C)。此外，H3K27cr水平在III期和IV期組織中高于I期和II期組織(圖1D)。鑒于H3K27cr水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)，我們提出H3K27cr可能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的假設(shè)。NaCr通過直接產(chǎn)生crotonyl-CoA提高組蛋白巴豆酰化水平。為了驗證我們的假設(shè)，我們將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)在添加10 mM NaCr的培養(yǎng)基中，以提高細(xì)胞內(nèi)H3K27cr的水平(圖1E)。結(jié)果表明，NaCr促進(jìn)了CRC細(xì)胞的侵襲和遷移(圖1F-1G)。這些發(fā)現(xiàn)提示H3K27cr促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。

2）LINC00922與H3K27cr水平、結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)

       由于先前的研究表明lncRNA在調(diào)節(jié)組蛋白巴豆酰化中發(fā)揮重要作用，因此接下來研究H3K27cr和lncRNA之間的關(guān)系。首先，對TCGA隊列中在正常和CRC組織中表現(xiàn)出差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行了分析，揭示了CRC組織中多種lncRNA的失調(diào)。隨后，利用H3K27cr抗體對HCT116細(xì)胞進(jìn)行ChIP-seq檢測，提取啟動子被H3K27cr占據(jù)的基因。隨后，GSEA將這些基因與上述失調(diào)的lncRNA進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因在高表達(dá)LINC00922或其他8種lncRNA的結(jié)直腸癌組織中富集(圖2A)。相反，LINC00922與啟動子標(biāo)記為H3K9cr或H3K18cr的基因之間沒有顯著關(guān)系。值得注意的是，過表達(dá)LINC00922顯著提高了H3K27cr的水平(圖2B)。這些結(jié)果表明LINC00922與H3K27cr之間存在相關(guān)性。隨后，對TCGA隊列CRC患者中LINC00922的臨床意義進(jìn)行了調(diào)查。結(jié)果顯示，LINC00922的高表達(dá)與CRC患者較短的生存期相關(guān)(圖2C)。接下來，我們檢查了TCGA隊列中LINC00922與CRC組織臨床病理特征之間的相關(guān)性。Mann-Whitney U分析顯示，與正常組織相比，CRC組織中LINC00922的表達(dá)顯著升高(圖2D)。此外，LINC00922在有遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)高于無遠(yuǎn)處或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者(圖2E-2F)。GEO隊列的薈萃分析顯示，高表達(dá)的LINC00922增加了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(圖2G)。綜上所述，高表達(dá)的LINC00922增加了CRC轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，并與CRC患者預(yù)后不良相關(guān)。

3）LINC00922加速結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移

       為了進(jìn)一步探討LINC00922與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我們研究了LINC00922在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和遷移中的作用。結(jié)果顯示，LINC00922的缺失降低了CRC細(xì)胞的侵襲和遷移水平，而LINC00922的過表達(dá)則顯示出相反的效果(圖3A-3B)。我們還研究了LINC00922是否在體內(nèi)調(diào)節(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移。將穩(wěn)定的LINC00922敲低細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入小鼠體內(nèi)。結(jié)果顯示，敲除LINC00922可顯著減少肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(圖3C，3D)。免疫印跡分析表明，當(dāng)LINC00922在CRC細(xì)胞中被敲除時，EMT相關(guān)基因(如Vimentin和Snail1)的表達(dá)水平顯著下調(diào)。相反，過表達(dá)LINC00922具有相反的效果(圖3E-3G)，增加了這些基因的表達(dá)水平。這些結(jié)果表明，LINC00922促進(jìn)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。

4）LINC00922通過H3K27cr介導(dǎo)的CAMs促進(jìn)侵襲和遷移

       為了研究LINC00922是否通過H3K27cr調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移，將LINC00922穩(wěn)定敲低的細(xì)胞用10 mM NaCr處理48 h，恢復(fù)H3K27cr水平。結(jié)果顯示，補(bǔ)充NaCr恢復(fù)了E-cad、Vimentin和Snail1的水平，以及穩(wěn)定的LINC00922敲低細(xì)胞的侵襲和遷移(圖4A-4B)，表明LINC00922通過H3K27cr調(diào)節(jié)CRC細(xì)胞的侵襲和遷移。隨后，使用H3K27cr抗體對過表達(dá)LINC00922的HCT116細(xì)胞進(jìn)行ChIP-seq檢測。在LINC00922過表達(dá)細(xì)胞和對照細(xì)胞之間，共有21253個峰表現(xiàn)出差異占用(圖4C)，表明LINC00922影響了H3K27cr在染色體上的占用。KEGG分析上述21253個峰注釋的基因的生物學(xué)途徑，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移途徑豐富，包括局灶黏附和粘附體連接(圖4D)。由于先前的研究表明組蛋白巴豆酰化強(qiáng)有力地表明激活啟動子，我們隨后在啟動子區(qū)域提取了653個具有兩個峰的基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。為了鑒定LINC00922通過H3K27cr調(diào)控的特定細(xì)胞類型，我們使用GSEA分析了這653個基因在結(jié)直腸癌組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組中的富集情況。該分析涉及來自GSE196964數(shù)據(jù)集的5678個細(xì)胞，鑒定出12個主要的細(xì)胞亞型(圖4E)。在結(jié)腸組織中，653基因在樹突狀細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、祖細(xì)胞和上皮細(xì)胞中富集。在結(jié)直腸癌組織中，除了樹突狀細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增細(xì)胞外，653基因在所有細(xì)胞類型中都富集(圖4F)。對其他數(shù)據(jù)集進(jìn)行了相同的分析。對來自GSE221575數(shù)據(jù)集的5179個細(xì)胞進(jìn)行了分析，鑒定出11種主要的細(xì)胞亞型(補(bǔ)充結(jié)果未展示)。在結(jié)腸組織中，653基因在內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中富集。在結(jié)直腸癌和肝轉(zhuǎn)移(LM)結(jié)直腸癌組織中，觀察到主要富集在B細(xì)胞和上皮細(xì)胞中。因此，上皮細(xì)胞是下一個重點(diǎn)。

       為了研究LINC00922通過H3K27cr影響的調(diào)控途徑，我們注釋了與這653個基因相關(guān)的生物學(xué)途徑。我們的研究結(jié)果顯示79個通路，如局灶粘附、粘附連接、緊密連接和細(xì)胞粘附分子(CAMs)，包含超過5個基因。在包含CRC和LM組織的GSE225857數(shù)據(jù)集中，對20,753個細(xì)胞進(jìn)行了全面分析，鑒定出12種主要細(xì)胞亞型(圖4G)。將79種途徑分別與從CRC和LM組織中提取的上皮細(xì)胞進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CAMs通路在LM組織來源的上皮細(xì)胞中呈負(fù)富集(圖4H)。因此，這些發(fā)現(xiàn)表明，LINC00922通過H3K27cr介導(dǎo)的CAMs促進(jìn)侵襲和遷移。

5）LINC00922通過ETS1促進(jìn)侵襲和遷移

       前期研究表明，ETS1調(diào)控CAMs的表達(dá)。因此，我們下一步研究LINC00922是否通過ETS1調(diào)控入侵和遷移。首先，本研究證明外源性ETS1促進(jìn)了CRC細(xì)胞的侵襲、遷移和細(xì)胞運(yùn)動(圖5A-5B)。此外，過表達(dá)ETS1增加了Vimentin和Snail1的表達(dá)，降低了E-cad的表達(dá)(圖5C)。拯救實驗表明，抑制ETS1通過恢復(fù)Vimentin和Snail1水平，恢復(fù)CRC細(xì)胞的侵襲、遷移和細(xì)胞運(yùn)動水平(圖5D-5F)。這些結(jié)果表明，LINC00922通過ETS1調(diào)控了侵襲和遷移。

6）LINC00922通過調(diào)節(jié)H3K27cr水平調(diào)控ETS1的表達(dá)

       接下來，我們研究了LINC00922是否改變了ETS1的表達(dá)。我們對28例CRC患者的組織進(jìn)行了qRT-PCR分析。結(jié)果顯示，LINC00922的表達(dá)與ETS1之間存在直接相關(guān)性(圖6A)。敲低LINC00922的表達(dá)表明，瞬時和穩(wěn)定敲低LINC00922均可降低ETS1 mRNA水平(圖6B-6C)。相反，CRC細(xì)胞中LINC00922的過表達(dá)增加了ETS1的mRNA水平(圖6D)。ETS1的蛋白水平也表現(xiàn)出類似的趨勢(圖6E-6G)。熒光圖像還顯示，穩(wěn)定的LINC00922敲低顯著降低了ETS1的蛋白水平(圖6H)。接下來，我們研究LINC00922是否通過H3K27cr調(diào)控ETS1的表達(dá)。首先，10 mM NaCr處理的HCT116細(xì)胞增加了H3K27cr和ETS1的水平，表明H3K27cr可能激活了ETS1的轉(zhuǎn)錄(圖6I)。隨后，在穩(wěn)定的LINC00922敲低細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入10 mM NaCr，培養(yǎng)48 h后恢復(fù)H3K27cr水平。我們發(fā)現(xiàn)，NaCr恢復(fù)了LINC00922穩(wěn)定敲低細(xì)胞的ETS1表達(dá)，表明LINC00922通過調(diào)節(jié)H3K27cr調(diào)節(jié)ETS1表達(dá)(圖6J-6K)。ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示，過表達(dá)的LINC00922增加了H3K27cr在ETS1啟動子區(qū)域的占據(jù)(圖6L)。ChIP-qPCR也證實了這一結(jié)果，即沉默LINC00922顯著降低了H3K27cr在ETS1啟動子區(qū)域的占據(jù)，而外源LINC00922則起到相反的作用(圖6M)。綜上所述，LINC00922改變了H3K27cr在ETS1啟動子區(qū)域的富集水平。導(dǎo)致ETS1表達(dá)的改變。

7) LINC00922通過與SIRT3相互作用改變H3K27cr的占用

       我們研究了LINC00922如何改變ETS1啟動子上H3K27cr的富集水平。HCT116細(xì)胞的ChIP-seq顯示SIRT3分布在TSS區(qū)附近(圖7A)。然而，SIRT3如何向TSS區(qū)富集的過程尚不清楚。我們假設(shè)LINC00922參與了SIRT3向TSS區(qū)域的富集。為了驗證這一點(diǎn)，我們首先研究了HCT116細(xì)胞中SIRT3和H3K27cr之間的相關(guān)性。免疫熒光圖像顯示，SIRT3和H3K27cr在HCT116細(xì)胞的細(xì)胞核中共定位(圖7B)。不出所料，外源性SIRT3降低了H3K27cr水平(圖7C)。接下來，我們研究了LINC00922是否通過調(diào)節(jié)SIRT3改變了H3K27cr的表達(dá)。RNA免疫沉淀(RIP)實驗顯示，在HCT116細(xì)胞中，LINC00922與SIRT3相互作用，且在過表達(dá)SIRT3的HCT116細(xì)胞中富集程度更高(圖7D)。熒光原位雜交(RNA-FISH)實驗顯示，LINC00922與SIRT3在HCT116細(xì)胞中共定位(圖7E)。RIP實驗還顯示，LINC00922與H3K27cr相互作用(圖7F)。隨后，我們利用ChIP-qPCR研究了LINC00922是否影響了ETS1啟動子區(qū)域SIRT3的富集。結(jié)果顯示，在LINC00922敲低的細(xì)胞中，ETS1啟動子區(qū)域SIRT3的富集程度更高，而外源LINC00922則表現(xiàn)出相反的效果(圖7G)。隨后，我們進(jìn)行了拯救實驗。值得注意的是，SIRT3過表達(dá)恢復(fù)了ETS1的表達(dá)(圖7H)。我們的研究結(jié)果表明，LINC00922與SIRT3相互作用并將其逐出ETS1啟動子區(qū)域，從而增加了ETS1啟動子區(qū)域的H3K27cr水平，激活了ETS1表達(dá)。

結(jié)論

       我們的研究提出了LINC00922介導(dǎo)的SIRT3募集和H3K27cr修飾在人類癌癥轉(zhuǎn)移中的工作模型。更好地了解組蛋白巴豆酰化在生物過程中的關(guān)鍵作用可能會導(dǎo)致新的癌癥治療策略。

實驗方法

單細(xì)胞RNA測序，transwell，傷口愈合實驗，WB，qRTPCR，免疫熒光，ChIP-qPCR，RNA免疫沉淀實驗，F(xiàn)ISH，IHC。

參考文獻(xiàn)

Liao M, Sun X, Zheng W, Wu M, Wang Y, Yao J, Ma Y, Gao S, Pei D. LINC00922 decoys SIRT3 to facilitate the metastasis of colorectal cancer through up-regulation the H3K27 crotonylation of ETS1 promoter. Mol Cancer. 2023 Oct 4;22(1):163. doi: 10.1186/s12943-023-01859-y.