眾所周知,飲食限制(DR)能促進自噬,從而發揮其長壽效應。雖然SAMS-1(S-腺苷蛋氨酸合成酶-1)已被證明是DR反應的關鍵介質,但人們對S-腺苷蛋氨酸(SAM)和 SAM 依賴性甲基轉移酶在自噬和 DR 誘導的長壽中的作用知之甚少。在這項研究中,我們發現 DR 和 SAMS-1 通過限制 SAM 的供應,抑制了組蛋白 H3K4 甲基轉移酶 SET-2 的活性。因此,降低的 H3K4me3 水平促進了兩種轉錄因子 HLH-30/TFEB 和 PHA-4/FOXA 的表達和活性,這兩種轉錄因子都能調節自噬相關基因的轉錄。然后我們發現,HLH-30/TFEB 和 PHA-4/FOXA 在它們共同的靶基因上協同作用,介導了自噬相關基因的轉錄反應,從而延長了動物的壽命。因此,我們的研究表明,SAMS-1-SET-2軸是一個營養傳感模塊,可從表觀遺傳學角度協調HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA轉錄因子的激活,從而控制大自噬/自噬和對DR的長壽反應。
本文于2023年1月發表在《Autophagy》IF: 13.3期刊上。
技術路線
實驗結果
1、自噬激活是sams-1突變體長壽的必要條件
為了解sams-1是否控制自噬以調節衰老速度,首先使用表達GFP標記的LGG-1,Atg8/LC3的同源物,來監測自噬。作者發現,在sams-1(ok2946)突變體的不同組織中,GFP::LGG-1自噬小體的數量都有所增加,包括下胚層接縫細胞、肌肉細胞、咽球和腸細胞(圖1A)。還發現與對照組相比,sams-1 RNAi顯著增加了自噬通量(圖1B)。接下來探究自噬相關基因是否是sams-1突變體長壽的必要條件。結果發現,一些自噬相關基因,如bec-1、vps-34或lgg-1/lgg-2/Atg8的敲除抑制了sams-1(ok2946)突變體的壽命(圖1c)??傊?,這些結果表明,sams-1失活可刺激自噬,從而促進長壽。
圖1自噬激活是sams-1突變體長壽的必要條件
2、HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA介導sams-1突變體的自噬和壽命
通過文獻發現HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA與自噬相關。本文發現當sams-1基因敲除時,HLH-30和PHA-4的蛋白和mRNA表達均上調(圖2a-c),表明sams-1 可能調控hlh-30和pha-4的轉錄。此外,通過測量HLH-30的核與細胞質比率,發現在sams-1基因敲除突變體中,HLH-30的核易位增強(圖2d)。與此相一致的是,在sams-1(ok2946)突變體中,一些自噬相關基因,包括lgg-1、lgg-2、sqst-1/p62、atg-4.1、atg-11、epg-3、epg-5、allo-1和vps-34的表達水平都有所增加(圖2c)。
此外,作者發現,SAM補充顯著廢除了HLH-30的核易位(圖2D)。為研究在sams-1突變體中觀察到的自噬活性和壽命的增加是否需要HLH-30或PHA-4的活性,首先評估hlh-30或pha-4 RNAi對自噬活性的影響。發現hlh-30或pha-4的敲除顯著抑制sams-1(ok2946)突變體自噬通量的增加,其次也抑制了eat-2(-)DR動物自噬通量的增加(圖2e、f)。敲除hlh-30或pha-4完全抑制了sams-1(ok2946)突變體壽命的延長(圖2g,h),表明HLH-30或PHA-4的活性對sams-1(ok2946)突變體壽命的延長至關重要。綜上所述,sams-1可能調節HLH-30和PHA-4的表達和活性,從而介導自噬和壽命。
圖2 HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA介導sams-1突變體的自噬和壽命
3、SET-2是一種H3K4甲基轉移酶,通過HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA調節自噬
由于補充SAM可完全消除sams-1突變體中的HLH-30核易位表型,作者推測SAMS-1的下游有一個或多個甲基轉移酶在調節HLH-30的活性。因此,以HLH-30核易位為讀數,進行了小規模的蛋白質甲基轉移酶RNAi篩選。set-2的無效突變也顯著增加了HLH-30的核易位(圖3a)。值得注意的是,在sams-1(ok2946)無效突變體中,HLH-30核質比高于set-2(bn129)無效突變體(圖3a),這表明在sams-1突變體中HLH-30核易位的誘導作用強于set-2突變體。因此,其他基因也可能在sams-1的下游發揮作用,與set-2平行調節HLH-30的核易位。
與sams-1基因缺失類似,set-2 基因缺失也增加HLH-30和PHA-4的mRNA和蛋白表達(圖3b-d)。此外,發現在set-2(ok952)突變體的下胚層縫細胞、肌肉細胞、咽球和腸細胞中,GFP::LGG-1點的數量增加,這表明set-2(ok952)突變體的自噬活性增強(圖3e)。在表達gfp::lgg-1::mcherry::lgg-1ΔG的set-2(bn129)突變體中,GFP:mCherry信號比降低,這也表明自噬通量增加(圖3f)。此外,作者發現自噬通量的增加需要HLH-30和PHA-4的活性(圖3g)。總之,這些結果表明SET-2通過HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA調節自噬。
圖3 SET-2是一種H3K4甲基轉移酶,通過HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA調節自噬
4、SET-2在DR通路中起作用,需要自噬相關基因來促進壽命
為進一步了解SET-2在DR誘導的長壽中的作用,作者進行了各種遺傳顯性分析,以探究set-2與sams-1和DR在壽命調控中的遺傳關系。首先創建了set-2過表達株系,提高了全局H3K4me3水平,改善了set-2(bn129)突變體的長壽表型,結果發現,set-2過表達能改善sams-1突變體的壽命表型(圖4a),這表明set-2在壽命調控中作用于sams-1的下游。過表達set-2會縮短eat-2(ad1116)突變體的壽命(圖4b)。總之set-2在調控DR誘導的長壽過程中作用于sams-1 的下游。
接著詢問自噬相關轉錄因子和基因是否也是延長set-2突變體壽命所必需的,正如在sams-1突變體(圖1c,圖2g,h)和eat-2突變體中所觀察到的那樣。敲除轉錄因子hlh-30或pha-4(圖4c、d)或自噬相關基因bec-1、vps-34或lgg-1/lgg-2完全抑制了set-2(ok952)突變體壽命的延長(圖4e、f)。綜上所述,SET-2甲基轉移酶活性降低會激活HLH-30和PHA-4,從而介導DR誘導的長壽。
圖4 SET-2在DR通路中起作用,需要自噬相關基因來促進壽命
5、AMX-1 H3K4去甲基化酶在調控HLH-30/TFEB中拮抗SET-2
接下來研究amx-1耗竭對SAMS-1/SET-2介導的HLH-30活化的影響。結果發現,amx-1 RNAi抑制了sams-1 RNAi誘導的HLH-30核易位(圖5a)。amx-1 RNAi還抑制了eat-2(ad1116)和set-2(bn129)動物的HLH-30核易位(圖5b)。amx-1的RNAi敲除也降低了eat-2和set-2突變體中hlh-30的mRNA和蛋白表達(圖5c)。此外,amx-1 RNAi抑制了sams-1 RNAi誘導的自噬通量激活,這表明amx-1調控自噬激活(圖5d)。通過遺傳顯性分析,發現敲除amx-1能顯著縮短sams-1(ok2946)、set-2(ok952)和eat-2(ad1116)突變體的壽命(圖5e-g)。綜上所述,amx-1能拮抗set-2對自噬和壽命的調控作用。
圖5 AMX-1 H3K4去甲基化酶在調控HLH-30/TFEB中拮抗SET-2
6、SET-2和AMX-1調節H3K4me3水平,控制HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA的表達
由于SET-2和AMX-1控制組蛋白H3K4三甲基化的動態變化,因此假設HLH-30和PHA-4的表達受hlh-30和pha-4啟動子區H3K4三甲基化狀態的轉錄調控。結果發現,在sams-1(ok2946)和eat-2(ad1116)突變體中,全局H3K4me3水平明顯下降(圖6a)。
然后,通過染色質免疫沉淀(ChIP)實驗研究set-2和sams-1突變體中hlh-30啟動子的H3K4me3水平。發現,在set-2(bn129)和sams-1(ok2946)突變體中,hlh-30啟動子的H3K4me3水平顯著降低(圖6b)。HLH-30與自身啟動子結合的增加表明啟動子活性增加。在sams-1(ok2946)和set-2(bn129)突變體中,HLH-30在其啟動子上的招募都有所增加(圖6c)。因此,在sams-1和set-2突變體中,低H3K4me3水平和HLH-30與hlh-30啟動子結合的增加可能與這些動物中hlh-30轉錄的誘導相對應。
DR增加pha-4的表達,但這種誘導的基本機制完全未知。作者假設,與hlh-30相似,pha-4的表達也受H3K4me3水平變化的控制。在這里,作者發現與WT N2相比,sams-1(ok2946)和set-2(bn129)突變體中pha-4啟動子的H3K4me3 水平也有所下降(圖6d),這表明饑餓過程中hlh-30和pha-4的誘導都是組蛋白標記變化的結果。同樣,在amx-1突變體中,hlh-30和pha-4啟動子的H3K4me3水平也有所增加(圖6e,f)。綜上所述,DR可能通過SAMS-1和SET-2調節H3K4me3的動態,從而控制hlh-30和pha-4的表達,進而控制自噬和壽命。
圖6 SET-2和AMX-1調節H3K4me3水平,控制HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA的表達
7、HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA協同調節自噬和壽命
作者猜測HLH-30和PHA-4也可能共同占據自噬相關基因的啟動子,并對其轉錄進行核心調節。為驗證這一假設,分析了modENCODE項目(ftp://data.modencode.org/)中的HLH-30和PHA-4 ChIP測序數據集。對結合位點分布的分析表明,HLH-30和PHA-4結合位點富集在轉錄起始位點(TSS)上游約50 bp的范圍內(圖7a)。51%的HLH-30結合位點與PHA-4結合位點重疊,而38%的PHA-4結合位點與HLH-30結合位點重疊(圖7b)。有886個基因的啟動子區域同時包含HLH-30和PHA-4結合位點(圖7b)。值得注意的是,這些數據集來自喂養的蠕蟲,表明在非刺激條件下,這兩種轉錄因子與共同靶基因的結合存在基礎水平。
然后,比較HLH-30和PHA-4的峰值中心之間的距離。距離分布顯示,它們的峰值中心之間的距離大多為~100 bp,表明這兩個轉錄因子在基因組上的存在位置很近(圖7c)。這些數據表明,這兩個轉錄因子可能共同占據了相同的啟動子區域,或者至少結合到了附近的位點,從而合作調控它們共同靶標的轉錄。
然后,進行GO富集分析,以確定這886個共同靶基因的功能注釋。發現"自噬"和"衰老"在其中占了很大比例(圖7d)。與ChIP-seq分析一致,在非刺激條件下,HLH-30和PHA-4都與lgg-1啟動子結合(圖7e,f)。在sams-1(ok2946)和set-2(bn129)突變體中,這兩種轉錄因子在lgg-1啟動子上的結合都有所增加,這可能導致了lgg-1的轉錄誘導。
有趣的是,作者發現HLH-30在lgg-1和sodh-1啟動子區域的結合不受RNAi 敲除pha-4的影響,而PHA-4在lgg-1和sodh-1啟動子區域的結合也不受RNAi 敲除hlh-30的影響(圖7g,h)。因此,綜合來看,HLH-30和PHA-4可能獨立地結合到它們共同靶標啟動子區域的相鄰位點,而不是共同占據相同的位點,從而協同控制它們的轉錄。
圖7 HLH-30/TFEB和PHA-4/FOXA協同調節自噬和壽命
總而言之,本文揭示,通過SAMS-1/SET-2軸、H3K4甲基化和HLH-30/PHA-4模塊協同調節自噬相關基因的表達,提出飲食限制介導的長壽模型。在自由飲食條件下,SAMS-1合成SAM,SAM是SET-2進行組蛋白H3K4甲基化的底物。hlh-30和pha-4的基礎轉錄水平提供了基礎的自噬相關基因的轉錄。在DR條件下,sams-1水平降低,因此SET-2催化的H3K4甲基化所需的SAM減少。AMX-1的活性超過了SET-2的活性。因此,H3K4me3在hlh-30和pha-4啟動子上的低甲基化增強了它們的轉錄,這反過來又導致自噬相關基因的轉錄增加,從而激活自噬并延長壽命。
圖8通過SAM依賴性甲基化實現自噬和長壽的模型。
實驗方法
C. elegans strains的培養,轉基因細胞系的構建,壽命分析實驗,核定位實驗,GFP::LGG-1熒光標記自噬,WB,RT-qPCR,ChIP
參考文獻
Lim CY, Lin HT, Kumsta C, Lu TC, Wang FY, Kang YH, Hansen M, Ching TT, Hsu AL. SAMS-1 coordinates HLH-30/TFEB and PHA-4/FOXA activities through histone methylation to mediate dietary restriction-induced autophagy and longevity. Autophagy. 2023 Jan;19(1):224-240. doi: 10.1080/15548627.2022.2068267. Epub 2022 May 3. PMID: 35503435; PMCID: PMC9809948.