腸道真菌通過抑制SAA1-GSDMD通路保護腸缺血再灌注損傷
欄目：最新研究動態
發布時間：2024-03-12
本發現首次闡明了腸真菌在IIR損傷中發揮著重要作用。預防性抗真菌治療應該考慮破壞真菌平衡......
背景
預防性抗真菌治療已廣泛應用于危重癥患者，但未能改善患者預后，已成為研究熱點。這可能與真菌穩態的破壞有關，但真菌的作用機制尚不清楚。腸缺血再灌注（IIR）損傷是危重癥患者的常見途徑，具有致命性，并受腸道菌群的調節。然而，腸道真菌在IIR損傷中的確切作用尚不清楚。
目的
這是一項臨床研究，旨在為闡明IIR損傷的潛在機制提供新的視角，并為未來IIR損傷的預防和治療提供潛在的策略。
方法
采用ITS測序檢測IIR損傷前后真菌的變化。分別用單真菌菌株、氟康唑和甘露聚糖預處理改變腸道真菌的組成。在IIR損傷小鼠模型中評估腸道形態和功能損傷。體外試驗培養腸上皮MODE-K細胞和巨噬細胞RAW264.7細胞。
結果
糞便真菌多樣性在IIR患者和小鼠中顯示出明顯的改變，并伴隨著腸上皮屏障功能障礙。真菌定植和甘露聚糖補充可通過抑制巨噬細胞SAA1的表達，減少腸上皮細胞焦亡，逆轉氟康唑加重的腸道形態和功能損傷。采用liposomal clodronate耗竭巨噬細胞數量，證明甘露聚糖的保護作用依賴于巨噬細胞的參與。
結論
本發現首次闡明了腸真菌在IIR損傷中發揮著重要作用。預防性抗真菌治療應該考慮破壞真菌平衡。本研究為闡明長真菌在維持腸體內平衡提供了新穎的線索。
本研究于2023年9月發表在《Journal of Advanced Research》上，IF：10.7。
技術路線
主要研究內容
1、IIR損傷患者和小鼠的腸道真菌分布表征
為證實患者的IIR損傷已發生，作者評估了患者在首次血液透析過程中SMA形態和血流量的變化。血液透析2 h后，SMA血流的線性參數和容積參數降低（圖1A）。另外，在血液透析前2 h和血液透析后24 h采用ELISA法檢測IIR損傷的腸屏障相關生物標志物。觀察到I-FABP和ZO-1水平顯著增加，但瓜氨酸值在兩個時間點之間降低（圖1B）。
考慮到腸道真菌在維持腸道屏障穩態中的潛在重要作用，作者在IIR損傷前（Before）和IIR損傷后（After）兩個時間點收集了IIR損傷患者的糞便樣本。然后，選取配對的糞便樣本，使用ITS測序探索真菌的多樣性、豐富度和組成。不同的alpha多樣性指數包括Chao，Shannon和Shannoneven顯示出相似的趨勢，表明微生物組樣品內的多樣性差異顯著（圖1C）。同樣，微生物組樣品之間的多樣性（β多樣性）顯示，兩個聚類相對分離，表明兩組之間的真菌結構存在差異（圖1D）。此外，兩組均進行了目和屬水平的檢測，發現Saccharomycetales和Candida顯著降低（圖1E）。作者通過LEfSe分析從門到屬水平探究物種特征（LDA > 4），同樣發現Saccharomyces的豐度顯著降低（圖1F）。進一步，作者評估了真菌豐度與IIR損傷的腸道屏障相關生物標志物之間的相關性。假絲酵母和Saccharomyces相對豐度與瓜氨酸水平呈正相關，與I-FABP和ZO-1水平呈負相關（圖1G-H）。
為獲得IIR損傷和腸真菌的直接相關性，作者在消除血液透析過程中其他因素影響的同時，建立了IIR小鼠模型，收集損傷前和損傷后的糞便并進行ITS測序。在屬水平上的Alpha多樣性分析顯示兩組之間沒有差異（圖1I），而與損傷前小鼠相比，IIR小鼠的Beta多樣性分析顯示出獨立的簇（圖1J）。LEfSe分析顯示，（LDA > 2）小鼠IIR損傷后Saccharomyces減少（圖1K）。隨機森林分析的結果進一步證實了IIR小鼠的真菌組成發生了顯著的變化，表現為Saccharomyces的顯著減少和隨后的網孢菌屬的增加（圖1L）。進一步，作者研究了真菌與腸道屏障相關生物標志物和組織細胞因子表達的相關性。在IIR損傷后，I-FABP、KC、IL18、IL6、TNF-α、GCSF和IL1 β的水平顯著增加，與Saccharomyces的豐度呈負相關（圖1M）。
圖1 IIR模型中腸真菌的特征
2、單菌種的定殖減輕了IIR損傷
上述結果表明，在IIR過程中，酵母菌和假絲酵母（屬的分類學水平）顯著減少，這與IIR損傷有關。因此，作者旨在通過真菌定植實驗驗證這些真菌與IIR損傷的相關性。值得注意的是，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae）和熱帶念珠菌（C. tropicalis）分別屬于S. cerevisiae屬（Saccharomyces）和假絲酵母屬（Candida），是人和小鼠腸道的優勢定殖菌。此外，S. cerevisiae和C. tropicalis在維持腸道穩態中發揮著不可替代的作用。在作者的研究中，S. cerevisiae和C. tropicalis在小鼠腸道中普遍存在，在建立IIR損傷模型之前，通過口服灌胃的方式定植于小鼠腸道（圖2A）。2周后，C. tropicalis和S. cerevisiae增加且不影響其他真菌的豐度，證明定殖成功（圖2B）。此外，在處死小鼠前進行異硫氰酸熒光素葡聚糖跨上皮滲透性測定。作者發現定植組血清中異硫氰酸熒光素葡聚糖濃度顯著降低（圖2C）。作者通過血清I-FABP檢查、腸道組織H & E染色和組織學評分進一步證實，腸道屏障破壞減輕，這與功能變化一致（圖2D，E）。Western blotting檢測緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達（圖2F）。GSDMD蛋白的N端（P30）片段是焦亡效應分子，作者證明了在IIR損傷的腸道中P30 GSDMD裂解增加（圖2F）。此外，多種細胞因子呈現一致的下降趨勢，尤其是與細胞焦亡相關的細胞因子（IL1β）（圖2G）。以上結果證實，增加S. cerevisiae和C. tropicalis負荷可減輕IIR損傷。
為進一步證明腸道真菌可以直接影響宿主，而不是調節體內的其他菌株，采用上述處理的無菌的（GF）小鼠建立IIR模型。通過真菌平板培養和柵欄定量豐度測試鑒定了S. cerevisiae和C. tropicalis混合物處理的無菌的小鼠的糞便真菌豐度（圖2H）。結果證實GF小鼠腸道內真菌缺失，且定植成功。重要的是，根據上述方法檢測了IEB功能和形態，作者發現GF小鼠中的真菌定植也減輕了IIR損傷（圖2I-K）。這證明S. cerevisiae和C. tropicalis通過直接作用于宿主而不受腸道中其他細菌或其他微生物的干擾，從而減輕IIR損傷。因此，作者得出，增加S. cerevisiae和C. tropicalis可以緩解IIR損傷。
圖2 單菌種的定殖減輕了IIR損傷
3、預防性抗真菌治療加重小鼠IIR損傷
探討S. cerevisiae和C. tropicalis的減少是否會加重IIR損傷。小鼠飲用抗真菌藥物氟康唑0.5 mg/mL預處理2周，隨后進行IIR損傷程序（圖3A）。進行真菌豐度定量分析以評估真菌清除率（圖3B）和超高效液相色譜法檢測體內血清氟康唑濃度（圖3C）。此外，通過血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試驗來確定氟康唑的毒性作用，表明氟康唑在醫學上沒有毒性，不會加重損傷（圖3D）。使用先前描述的方法測量腸道功能和形態，并通過真菌清除獨立惡化IEB的損傷（圖3E-G）。此外，腸道組織中GSDMD的裂解和細胞因子的表達均有不同程度的升高（圖3H，I）。這些結果表明S. cerevisiae和C. tropicalis的清除加劇了GSDMD的裂解，促進了細胞因子的釋放。
為驗證真菌清除直接影響宿主，而不是氟康唑本身，作者采用上述方法對GF小鼠進行氟康唑治療。通過檢測腸道功能和形態學，作者發現氟康唑本身并沒有加重IIR損傷。氟康唑處理后，血清異硫氰酸熒光素葡聚糖和I-FABP水平無明顯變化（圖3J，K）。這些結果證實，由于S. cerevisiae和C. tropicalis的缺失，氟康唑預處理GF小鼠并沒有通過真菌清除加重IIR損傷。
圖3 預防性抗真菌治療加重小鼠IIR損傷
4、腸道真菌對GSDMD-/ -小鼠失去保護作用
作者前期發現腸道真菌主要通過抑制GSDMD裂解發揮抗膿毒癥作用，由于腸道真菌清除加劇了GSDMD裂解，而在IIR損傷模型中，S. cerevisiae和C. tropicalis定植能夠緩解GSDMD裂解，因此作者試圖研究腸道真菌是否主要通過抑制GSDMD裂解發揮對小鼠IIR損傷的保護作用。因此，作者使用GSDMD-/ -小鼠，通過氟康唑預處理清除腸道真菌來驗證作者的假設，如前所述（圖4A），Western blotting證實GSDMD在GSDMD-/ -小鼠中消失（圖4B）。為了驗證GSDMD-/ -小鼠糞便中的真菌多樣性是否與WT組一致，進行了真菌豐度的定量分析，與WT對照組相比，GSDMD-/ -小鼠的腸道中沒有觀察到真菌負荷的差異（圖4C）。此外，為了證實GSDMD-/ -小鼠的真菌清除是否可以改變IEB的形態和功能，作者測定了血清中異硫氰酸熒光素葡聚糖和I-FABP的濃度、腸黏膜損傷評分和上皮緊密連接蛋白的表達，結果證實GSDMD-/ -小鼠的真菌負荷減少并沒有惡化屏障損傷（圖4D-G）。此外，腸道組織上清液中的細胞因子水平也沒有差異（圖4H）。此外，與WT對照組相比，GSDMD-/ -小鼠的IIR損傷顯著降低。因此，作者得出結論，在GSDMD-/ -小鼠中減少S. cerevisiae和C. tropicalis的真菌負荷并不能加重IIR損傷，而這些真菌通過抑制GSDMD裂解來減輕IIR損傷。
圖4 腸道真菌清除不會加劇GSDMD-/-小鼠的GSDMD裂解
5、甘露醇復制釀酒葡萄球菌喝熱帶葡萄球菌對IIR損傷的保護作用
鑒于S. cerevisiae和C. tropicalis對IIR損傷的緩解作用，作者研究了這些真菌是否具有共同的活性物質。值得注意的是，S. cerevisiae和C. tropicalis是兩種具有相同結構成分的酵母，即甘露聚糖，它是酵母細胞壁和周質空間的主要組成部分。此外，大量研究表明甘露聚糖單獨提供免疫保護。作者前期發現甘露聚糖可以抑制GSDMD的裂解。為確認甘露聚糖是否是S. cerevisiae和C. tropicalis保護IIR損傷的關鍵成分，C57/B6小鼠在IIR損傷模型前用甘露聚糖（0.1 mg / mL）預處理2周，通過他們的飲水（圖5A）。有趣的是，通過比較腸道形態和功能，IEB結構和功能得以保留，與單真菌菌株定植的作用一致（圖5B-F），以及GSDMD裂解和細胞因子表達的水平一致（圖5D，F）。這一結果證實了S. cerevisiae和C. tropicalis在IIR損傷中的作用可能與甘露聚糖有關。同時，GF小鼠也用甘露醇處理，進行IIR損傷評價。結果顯示GF小鼠對IIR損傷具有相同的保護作用（圖5G-I）。
圖5 甘露醇復制IIR損傷中腸道真菌的保護作用
6、甘露聚糖在IIR損傷中的保護作用依賴于巨噬細胞的參與
為了進一步研究甘露聚糖與宿主之間的相互作用，作者將Cyanine3（Cy3）熒光標記物共價連接到甘露聚糖上（圖6A），發現小鼠口服灌胃后，甘露聚糖僅與F4 / 80標記的巨噬細胞共定位（圖6B）。這一結果表明，甘露聚糖在進入腸道后被巨噬細胞識別并發生相應作用。在體外，將Cy3-甘露聚糖加入到RAW264.7細胞中，顯示甘露聚糖在孵育6 h后進入RAW264.7細胞（圖6B）。流式細胞術結果顯示甘露聚糖可以減少腸道中巨噬細胞（F4 / 80 + CD45.2 +）的數量。為進一步證明甘露聚糖的保護作用與巨噬細胞有關，在建立IIR模型前3天腹腔注射liposomal clodronate，以清除腸道中的巨噬細胞（圖6C）。結果表明，liposomal clodronate減少了腸道中巨噬細胞的數量。比較腸道形態和功能發現，巨噬細胞清除后，甘露聚糖的保護作用減弱，無統計學差異（圖6D-G）。同時，IIR損傷引起的GSDMD裂解和細胞因子表達水平也有所減輕，無統計學差異（圖6G-H）。這些結果表明甘露聚糖通過巨噬細胞發揮保護作用。
圖6 IIR損傷中甘聚糖的保護作用依賴于巨噬細胞的參與
7、單菌株和甘露聚糖均可通過降低巨噬細胞SAA1的表達來緩解GSDMD裂解
為進一步探索S. cerevisiae和C. tropicalis通過巨噬細胞減輕IIR損傷的關鍵途徑，作者在建立IIR損傷模型之前，對單菌株或甘露聚糖處理的小鼠腸道組織進行了RNA-Seq。作者在RNA-Seq結果中發現血清淀粉樣蛋白a1（SAA1）水平顯著降低，并使用qPCR獨立驗證mRNA表達（圖7A，B）。SAA1是一種急性時相蛋白，已被證明與急性炎癥密切相關，并加重多種炎癥性疾病的發生和發展。為了檢測SAA1蛋白在腸道中的表達分布，作者進行了免疫組織化學實驗，結果顯示SAA1主要在腸道內皮細胞中表達，而在預處理的小鼠中SAA1的表達明顯較少（圖7C）。此外，免疫熒光染色檢測到F4 / 80標記的腸巨噬細胞中SAA1蛋白表達下降（圖7D）。為了證實甘露聚糖在體外是否可以降低SAA1，用甘露聚糖（1mg/mL）處理RAW264.7細胞6 h，然后移至含1 μg/mL脂多糖類（LPS）的培養基中孵育2 h，用于增加SAA1的基礎表達。作者發現SAA1在的mRNA和蛋白水平表達均降低（圖7E，F）。這一結果與作者發現的巨噬細胞參與甘露聚糖的保護作用一致，證明甘露聚糖通過減少巨噬細胞SAA1分泌發揮保護作用。
作者先前的工作已經證明了甘露聚糖可減少IIR損傷中GSDMD介導的細胞焦亡。越來越多的證據表明，SAA1與GSDMD介導的細胞焦亡密切相關。此外，作者通過免疫組化實驗發現GSDMD主要在IIR損傷時的IECs中表達（圖3）。因此，作者使用SAA1蛋白（600 ng/mL）處理的小鼠腸上皮細胞（MODE-K）在氧糖剝奪/復氧（OGD/R）模型中，進一步證明SAA1在體外直接加劇GSDMD裂解（圖7G）。此外，由于SAA1蛋白刺激（圖7G，H），緊密連接蛋白也表現出明顯的損傷。利用qPCR檢測SAA1處理MODE-K細胞后GSDMD、NLRP3、IL1 β、IL18、Caspase-1和Caspase-11的mRNA表達（圖7H）。這些結果提示GSDMD裂解的加劇可能是GSDMD和NLRP3表達上調所致。綜上所述，腸道真菌通過降低巨噬細胞中SAA1的表達，從而緩解IECs中GSDMD的裂解，減輕IIR損傷損傷。
圖7 單菌株和甘露聚糖均可通過降低巨噬細胞SAA1的表達來緩解GSDMD裂解
結論
本研究結果提示，IIR損傷后腸道真菌發生紊亂。S. cerevisiae和C. tropicalis具有通過甘露聚糖抑制巨噬細胞中SAA1的表達和減少IECs中GSDMD切割來減輕IIR損傷的潛力。本研究揭示了血液透析中IIR損傷的新機制，并提示維持腸道真菌穩態可能是預防IIR損傷的新療法。
實驗方法
臨床樣本收集，腸系膜上動脈（SMA）超聲檢查，ITS1 sequencing，C57BL/6J小鼠，IIR小鼠模型構建，真菌DNA提取，ELISA試劑盒檢測腸道功能的特殊生物標志物，超高效液相色譜，H&E染色，血清細胞因子檢測，Western blot assay，免疫組化染色分析SAA1和GSDMD的水平，免疫熒光，RNA-seq，PCR分析
參考文獻
Chen Y, Han B, Guan X, Du G, Sheng B, Tang X, Zhang Q, Xie H, Jiang X, Tan Q, Chen S, Wang J, Chen W, Xiao W. Enteric fungi protect against intestinal ischemia-reperfusion injury via inhibiting the SAA1-GSDMD pathway. J Adv Res. 2023 Sep 15:S2090-1232（23）00258-8. doi: 10.1016/j.jare.2023.09.008. Epub ahead of print. PMID: 37717911.