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       創傷性腦損傷（TBI）后過度和長期的神經炎癥會導致長期的組織損傷和不良的功能結果。然而，腦損傷后炎癥反應加劇的機制仍然知之甚少。作者之前研究表明，小鼠腦外傷后神經元的巨噬/自噬通量受到抑制，并導致神經元細胞死亡。本研究中，作者證明自噬在活化的小膠質細胞和浸潤性巨噬細胞中也受到抑制，這增強損傷誘導的神經炎癥反應。巨噬細胞/小膠質細胞特異性敲除關鍵自噬基因Becn1導致TBI后神經炎癥總體增加。特別是，作者觀察到先天免疫反應的過度激活，包括I型干擾素和炎性體途徑。損傷后小膠質細胞和巨噬細胞自噬缺陷與負責激活細胞先天免疫反應的危險/損傷相關分子模式（DAMP）的吞噬清除減少有關。作者的數據還證明精確自噬在靶向和降解先天免疫途徑成分（如NLRP3炎性體）中的作用。最后，抑制小膠質細胞/巨噬細胞自噬導致腦損傷后神經變性增加和長期認知結果惡化。相反，在野生型小鼠TBI后，用雷帕霉素治療增加自噬可以減少炎癥并改善結果。總之，作者表明，抑制小膠質細胞和浸潤性巨噬細胞的自噬有助于腦損傷后過度的神經炎癥，從長遠來看可能會阻止炎癥的消退和組織再生。本文于2023年7月發表于《Autophagy》期刊IF：13.3；Q1。
技術路線

主要實驗結果

1.腦損傷后活化小膠質細胞和浸潤單核細胞的自噬受到抑制

       作者之前證明，在小鼠中度控制性皮質沖擊（CCI）腦損傷后，不同細胞類型的損傷皮質內自噬通量的抑制發生在不同的時間點，激活的AIF1/IBA1陽性免疫細胞在損傷后3天出現自噬體積累高峰。
       參與TBI神經炎癥反應的免疫細胞包括活化的常駐小膠質細胞和浸潤的單核/巨噬細胞。為區分這些細胞，作者對小膠質細胞和浸潤性髓細胞中表達Cx3cr1啟動子綠色熒光蛋白（GFP）的Cx3cr1-GFP小鼠進行適度的CCI。作者使用免疫熒光（IF）對皮層切片進行共染色，同時檢測抗ADGRE1/F4/80抗體和自噬受體蛋白SQSTM1/p62，前者在浸潤的單核細胞/巨噬細胞中的表達水平高于小膠質細胞，后者在自噬清除受損的細胞中積累（圖1A-B）。與作者之前的數據一致，免疫細胞中SQSTM1的積累在損傷后3天達到峰值。在該時間點，所有定量的CX3CR1⁺細胞中有13%的SQSTM1陽性；然而，在所有定量的CX3CR1⁺ ADGRE1⁺細胞中，有65%的細胞SQSTM1陽性（圖1C-D）。因此，盡管損傷后SQSTM1積累在小膠質細胞（ADGRE1^low CX3CR1⁺）和浸潤性單核細胞（ADGRE1^high CX3CR1⁺）中均發生，但在浸潤性細胞群中更為明顯。
       利用Ccr2-RFP報告小鼠，在巨噬細胞和募集到炎癥部位的單核細胞中特異性表達來自Ccr2啟動子的RFP，證實浸潤性單核細胞的自噬抑制。損傷后3天，作者觀察到CCR2⁺細胞中自噬標志物LC3和SQSTM1共定位90%，證實浸潤細胞內自噬通量明顯受到抑制（圖1E-F）。
       作者使用流式細胞術作為補充技術來評估TBI后駐留小膠質細胞（PTPRC/ CD45^int ITGAM/CD11B⁺）和浸潤髓細胞（PTPRC^high ITGAM⁺，主要是LY6C⁺單核細胞和中性粒細胞）的自噬動力學（圖1G）。為評估自噬水平，作者使用針對LC3和SQSTM1的抗體，以及在溶酶體抑制的活細胞中熒光標記自噬體的Cyto-ID^?PH敏感自噬染料。所有標記均顯示共定位，證實相同的細胞積累自噬體和SQSTM1，與自噬通量的抑制一致（圖1H-I）。作者觀察到損傷后LC3⁺、SQSTM1⁺、自噬dye⁺小膠質細胞和浸潤性髓細胞數量增加，并在損傷后3天達到峰值（圖1J-L）。與作者的IF數據一致，與常駐小膠質細胞相比，所有標記物在浸潤單核細胞中積累的程度更高，表明這些細胞的自噬抑制程度更高。
       盡管大腦中激活的小膠質細胞，特別是浸潤性髓系細胞的總數在初始峰值后下降，但大量剩余細胞顯示出持續抑制自身吞噬的跡象，這可以從自噬染料在損傷后28天的積累中看出（圖1L）。損傷后自噬dye⁺循環血液單核細胞百分比保持不變。這表明單核細胞內的自噬損傷僅限于那些穿過受損的血液腦屏障并進入腦實質的單核細胞。

圖1腦外傷后活化的小膠質細胞和巨噬細胞自噬受到抑制

2.自噬的抑制與促炎標志物的表達增加有關

       為確定自噬通量受到抑制的活化小膠質細胞和浸潤單核/巨噬細胞的炎癥狀態，作者在TBI后1、3和7天對Cx3Cr1-GFP小鼠皮質腦切片進行抗SQSTM1抗體和幾種炎癥標記物的IF共染色。與先前發表的數據一致，作者觀察到損傷皮質CX3CR1⁺細胞中促炎癥標志物NOS2/iNOS（一氧化氮合酶2，誘導型），NLRP3和CYBB/NOX2（細胞色素b-245，β多肽）的顯著積累，并在損傷后3天達到峰值（圖2A-D）。大多數促炎小膠質細胞和巨噬細胞也積累高水平的SQSTM1，表明這些細胞的自噬通量受到抑制。損傷后3天，69%的CX3CR1⁺ NOS2⁺細胞、90%的CX3CR1⁺ NLRP3⁺細胞和89%的CX3CR1⁺ CYBB⁺細胞SQSTM1陽性。這些發現表明在小膠質細胞和浸潤的單核細胞/巨噬細胞中炎癥極化與自噬通量的抑制有關。
       作者使用流式細胞術量化自噬通量高低水平的小膠質細胞和浸潤性髓細胞的炎癥。作者使用反映自噬體積累的Cyto-ID^?自噬染料，鑒定具有高/正常水平自噬通量（dye^-）的細胞，以及具有低水平自噬通量/抑制自噬通量（dye⁺）的細胞，然后在假手術和TBI小鼠中評估這些細胞群中促炎細胞因子的水平。從損傷后1天開始，與同一時間點的dye^-小膠質細胞相比，dye⁺小膠質細胞表達更高水平的促炎細胞因子、TNF/TNF-α和IL1B/IL-1β（圖2E-G）。與dye^-小膠質細胞相比，dye⁺小膠質細胞中IL1B的高表達持續到損傷后28天，而與dye^-小膠質細胞相比，dye⁺小膠質細胞中TNF的高表達在急性時間點仍具有統計學意義，但在損傷后28天失去統計學意義（與28天的dye^-小膠質細胞相比，p = 0.062）。在浸潤性髓系細胞中，作者也觀察到損傷后dye⁺細胞中TNF和IL1B水平升高（圖2H-J），然而，直到較晚的時間點（損傷后7天和28天），這一點才有統計學意義。這些發現證實，抑制小膠質細胞和浸潤性髓細胞的自噬與促炎細胞因子的產生水平升高有關。

圖2 自噬的抑制與TBI后促炎標志物的表達增加有關

3.抑制自噬會加劇體外炎癥反應

       作者進行體內研究結果表明，損傷后小膠質細胞和單核/巨噬細胞的自噬抑制與促炎表型有關。為確定自噬抑制是否可能導致神經炎癥加劇，作者使用小鼠小膠質細胞（IMG細胞）和小鼠巨噬細胞（RAW 246.7細胞）進行體外研究。作者用針對不同階段自噬的抑制劑處理細胞：巴菲霉素A₁（BafA）抑制溶酶體酸化和自噬體-溶酶體融合；3-MA抑制自噬體形成所必需的III類磷脂酰肌醇3-激酶活性；MRT68921抑制ULK1和自噬起始。通過NOS2和NLRP3蛋白水平升高和一氧化氮生成增加評估，使用自噬抑制劑處理的IMG和RAW細胞炎癥均增加（圖3A-F）。這在基線條件下是正確的，在用脂多糖（LPS）預處理激活的細胞中也是如此。LPS處理不影響自噬通量（圖3G）。事實上，所有三種自噬抑制劑都增加促炎標志物的水平，這表明調節巨噬細胞和微膠質細胞的自噬（而不僅僅是該途徑的一種特定成分）可以直接改變體外炎癥反應。作者在原代小鼠骨髓來源的巨噬細胞中觀察到類似的結果（圖3H）。

圖3 抑制巨噬細胞和小膠質細胞的自噬會加劇體外炎癥反應

4.抑制小膠質細胞和浸潤單核細胞的自噬會加劇腦損傷后的炎癥反應

       從Lyz2（溶菌酶2）啟動子表達Cre重組酶的Lyz2/LysM-cre小鼠已被廣泛用于巨噬細胞和中性粒細胞的基因功能解剖。然而，使用Lyz2-cre小鼠靶向小膠質細胞中的基因尚不確定。作者使用ROSA26-lox-STOP-lox-tdTomato （ROSA-tdTomato）報告小鼠檢測Lyz2-cre在小膠質細胞中的作用，這些小鼠僅在cre介導重組后才表達熒光蛋白tdTomato。流式細胞術數據顯示，從假手術和TBI Lyz2-cre/ROSA-tdTomato小鼠大腦中分離的小膠質細胞（PTPRC^int ITGAM⁺）中約有一半表達tdTomato，表明Cre介導的重組。正如預期的那樣，在TBI小鼠中，超過80%的浸潤單核細胞（PTPRC^high ITGAM⁺）是tdTomato⁺（圖4A）。因此，Lyz2-cre在大約一半的小膠質細胞和大多數浸潤性單核細胞中活躍，使其成為研究小膠質細胞和巨噬細胞在腦損傷后神經炎癥中作用的有用驅動因素。
       所有歸一化基因計數的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）顯示，四個實驗小鼠組（對照假手術、becn1 cKO假手術、對照TBI、becn1 cKO TBI）在前兩個主坐標上聚類，分別占樣本總變異的75.2%（損傷效應）和4.5%（基因型效應）（圖4B）。歐幾里得距離和病房聚類分析證實組間差異，根據損傷和基因型將小鼠分為四組（圖4C）。根據聚類模式，作者觀察到對照假手術組和becn1 cKO假手術組之間有輕微的重疊；對照TBI組和becn1 cKO TBI組分離效果較好。這表明becn1 cKO小鼠小膠質細胞和巨噬細胞的自噬抑制導致神經炎癥相關的轉錄變化，并且這些變化在TBI后加劇。
       組間的兩兩比較證實基因型和損傷誘導的轉錄差異（圖4D）。對照假手術組與becn1 cKO假手術組、對照TBI組與becn1 cKO TBI組的兩兩比較顯示，假手術組和TBI組之間存在顯著的基因型依賴差異（圖4D）。對becn1 cKO TBI小鼠與對照TBI小鼠之間差異表達基因的通路分析顯示，“先天免疫反應”是最富集的通路（圖4E）。重要的是，“自噬調節”也被列為最重要的差異表達途徑之一。單個基因NanoString數據分析證實，與對照TBI組相比，becn1 cKO TBI中先天免疫相關基因表達上調，自噬調節基因下調（圖4F-G）。
       作者在RNA和蛋白質水平上確認NanoString數據。在TBI后3天，與對照組相比，Becn1 cKO TBI腦組織中LC3-II和SQSTM1蛋白的積累增加（圖4H-I）。作者的分析還證實，與對照TBI相比，becn1 cKO TBI中促炎癥基因如Cybb和Nfkb1上調，而抗炎癥基因如Tgfb和Il10并未持續改變（圖4J-K）。免疫熒光染色證實becn1 cKO小鼠損傷后自身吞噬被抑制，神經炎癥增加。在損傷后3天，作者觀察到損傷皮質AIF1陽性免疫細胞中SQSTM1和促炎標志物NOS2的積累增加（圖4L）。

圖4 小膠質細胞和單核細胞特異性自噬抑制加劇腦外傷后的炎癥反應

6.抑制精確自噬會加劇腦損傷后的先天免疫反應

       作者的NanoString通路分析表明，與對照小鼠相比，先天免疫反應是becn1 cKO中過度TBI神經炎癥的介質。這包括炎癥體和I型IFN通路的惡化。作者使用qRT-PCR證實這兩種途徑的參與，結果顯示，與對照TBI小鼠相比，becn1 cKO TBI中I型IFN通路基因Sting1、Cgas和Ifnb1以及炎性體通路基因Nlrp3、Casp1和Il1b的mRNA水平升高（圖5A-B）。這些發現在蛋白水平上得到證實，在損傷后3天，作者觀察到與對照組小鼠相比，becn1 cKO中促炎CYBB、CGAS、STING1和NLRP3蛋白水平升高（圖5C-D）。流式細胞術分析進一步證實炎癥小體的激活加劇，損傷后becn1 cKO的小膠質細胞和浸潤單核細胞中的IL1B水平均高于對照小鼠（圖5E-H）。
       通過精確自噬，先天免疫途徑的成分可以直接靶向自噬降解。與一般的自噬受體（如SQSTM1）不同，精確自噬依賴于三結構域蛋白（TRIM）家族的成員來靶向先天免疫的特異性細胞質調節因子。MEFV/TRIM20已被證明可靶向炎性體成分，包括NLRP3、NLRP1和proCASP1 （caspase 1），用于自噬降解。MEFV還作為ULK1、BECN1和ATG16L1復合物組裝的平臺。這表明MEFV作為一種自噬受體，可遞送炎性小體成分進行自噬降解。除NLRP3外，作者還觀察到與對照TBI小鼠相比，becn1 cKO TBI皮層中MEFV蛋白的積累增加（圖5I-J）。Mefv mRNA水平保持不變（圖5K）。這與在SQSTM1中觀察到的情況相似（圖4H-J），表明在蛋白質降解水平上進行調控。免疫沉淀分析表明，與假手術皮層相比，損傷皮層中含有ULK1、MEFV和NLRP3的蛋白復合物的積累增加（圖5L），這支持精密自噬抑制是加劇神經炎癥的一種機制。

圖5 抑制小膠質細胞/單核細胞的精確自噬有助于加劇TBI后的先天免疫反應

6、抑制小膠質細胞和浸潤性單核細胞的自噬導致吞噬缺陷和DAMPs的積累
       受損細胞釋放DAMPs，DAMPs作為內源性危險信號，誘導死亡細胞和細胞碎片（胞葬作用）吞噬，并在非感染性炎癥期間激活先天免疫反應。通過免疫印跡（WB），作者觀察到與對照組相比，becn1 cKO小鼠在TBI后的SPTAN1/α-FODRIN和PRDX6的裂解水平更高，這表明可能存在去除DAMP的缺陷（圖6A，B）。這可能不是由貨物識別缺陷引起的，因為作者的NanoString數據表明，與對照TBI小鼠相比，becn1 cKO TBI中清除劑受體的表達增加而不是減少（圖6C）。
       除典型自噬外，BECN1也是LC3相關吞噬（LAP）的非典型自噬途徑所必需的，LAP利用自噬途徑的成分來介導DAMPs的胞葬作用和吞噬作用。利用流式細胞術，作者檢測becn1 cKO和對照小鼠腦內小膠質細胞和浸潤單核細胞吞噬熒光乳膠珠的能力。作者觀察到，與對照組小鼠相比，損傷后becn1 cKO小膠質細胞的吞噬活性顯著降低（圖6D-F）。
       除自噬機制的組成部分外，LAP還需要NADPH氧化酶-2（CYBB/NOX2）復合物在LC3相關吞噬體上的募集和活性。為確定LAP是否可能參與損傷后的DAMP清除，作者對表達GFP-LC3自噬報告基因的假手術和第3天TBI轉基因小鼠進行IF染色切片。作者觀察到損傷后激活的小膠質細胞/巨噬細胞中GFP-LC3和CYBB的積累，證實LAP的潛在參與（圖6G-H）。在高倍鏡下，一些GFP-LC3細胞內小點CYBB陽性，這表明它們是LAP吞噬體而不是自噬體（圖6I）。這些數據表明，與整體自噬類似，LAP在損傷后激活的小膠質細胞和巨噬細胞中可能被抑制，導致DAMP去除障礙和神經炎癥增加。

圖6 抑制小膠質細胞/單核細胞的精確自噬導致TBI后吞噬缺陷和DAMPs積累

7、抑制小膠質細胞和浸潤性單核細胞的自噬惡化損傷后的功能恢復
       作者評估抑制小膠質細胞和單核細胞的自噬是否會影響損傷小鼠的運動和記憶功能。在腦損傷后21 ~ 25天采用Morris水迷宮（MWM）測試空間學習記憶能力。在探索試驗期間，becn1 cKO TBI小鼠在逃避象限的時間明顯少于對照TBI組，表明空間學習缺陷加劇（圖7A）。作者還觀察到在探索試驗期間使用的搜索策略的顯著差異。becn1 cKO 假手術組小鼠和對照假手術組小鼠均使用空間或順序搜索策略。雖然兩個TBI組越來越多地依賴于循環策略來定位平臺，但與對照TBI（50%）小鼠相比，becn1 cKO TBI（68.5%）更為明顯（圖7B-C）。
       為評估非空間陳述性記憶，作者在損傷后15-17天進行新物體識別測試。在測試階段，與相應的假手術組相比，TBI小鼠在新物體上花費的時間更少，證實預期的損傷效果。然而，與對照TBI小鼠相比，becn1 cKO TBI小鼠在新物體上花費的時間明顯減少（圖7D），這表明抑制小膠質細胞和單核/巨噬細胞的自噬加劇損傷后的陳述性記憶障礙。
       為測試小膠質細胞和浸潤單核細胞自噬抑制對TBI后整體組織損傷和神經變性的影響，作者比較becn1 cKO TBI小鼠和對照組TBI小鼠在損傷后28天的海馬損傷體積和神經元細胞計數。然而，與對照TBI小鼠相比，becn1 cKO TBI小鼠同側海馬鋸齒回（DG）中的神經元細胞計數顯著減少，表明神經元損失增加（圖7E-F）。總之，這些數據表明，通過小膠質細胞和浸潤單核細胞的自噬抑制介導的炎癥增加加劇TBI誘導的神經變性。qRT-PCR數據還顯示，在損傷后第28天，becn1 cKO TBI小鼠的整體先天免疫基因表達仍高于對照組TBI小鼠，但個體差異未達到顯著性（圖7G）。

圖7 小膠質細胞/單核細胞的自噬抑制惡化，而自噬刺激可改善腦損傷后的長期認知結果

8、增加自噬可減少神經炎癥并改善腦損傷后的功能結果
       數據表明，自噬的抑制導致腦損傷后神經炎癥延長和功能恢復不良。為確定增加自噬是否可以用于治療減少神經炎癥和改善功能結果，作者用MTOR抑制劑和已知的自噬誘導劑雷帕霉素治療野生型小鼠。在接受雷帕霉素治療后，TBI小鼠在MWM和Y型迷宮任務中的表現，與藥物治療的TBI小鼠相比，顯示出記憶力的改善（圖7H）。損傷后3天的qRT-PCR分析顯示，先天免疫和炎癥相關基因的表達總體下降，但個體基因數據沒有達到顯著性（圖7I）。另一方面，雷帕霉素治療導致NLRP3、CGAS和STING1蛋白水平顯著降低（圖7J-K）。這與增加的自噬通過蛋白質降解來控制先天免疫介質水平的能力是一致的。總之，這些數據為TBI后自噬增加的抗炎作用提供進一步的證據。
結論
       總之，本研究表明抑制小膠質細胞和浸潤性巨噬細胞的自噬有助于腦損傷后過度的神經炎癥，從長遠來看可能會阻止炎癥的消退和組織再生。因此，再激活或增加自噬是一種有希望的干預途徑，可以解決多種細胞類型的多種腦損傷病理，強調需要更好地了解其機制和功能。

實驗方法
控制性皮質沖擊（CCI）；細胞系；BMDM隔離和培養；體外藥物治療；雷帕霉素治療；Western blot；總一氧化氮檢測試劑盒；免疫組織化學；流式細胞術；qRT-PCR；NanoString 分析；免疫沉淀；神經行為測試；組織學。
參考文獻
Hegdekar N, Sarkar C, Bustos S, Ritzel RM, Hanscom M, Ravishankar P, Philkana D, Wu J, Loane DJ, Lipinski MM. Inhibition of autophagy in microglia and macrophages exacerbates innate immune responses and worsens brain injury outcomes. Autophagy. 2023 Jul;19(7):2026-2044. doi: 10.1080/15548627.2023.2167689. Epub 2023 Jan 18. PMID: 36652438; PMCID: PMC10283445.

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