全乳酸組揭示實驗性自身免疫性葡萄膜炎中TH17分化的乳酸依賴機制
欄目：最新研究動態
發布時間：2024-03-08
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CD4+ T 細胞分化失調與自身免疫性疾病有關。從氧化磷酸化到糖酵解的代謝重編程以及乳酸的積累都與這一過程有關。然而，其潛在機制仍不清楚。本研究表明，乳酸衍生的乳酸化調控CD4+ T 細胞的分化。CD4+ T細胞中的乳酸化水平隨著實驗性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的進展而增加。抑制乳酸化可抑制TH17分化并減輕EAU炎癥。機制上，Ikzf1在Lys164處的高乳酸化通過直接調節TH17相關基因（包括Runx1、Tlr4、白細胞介素-2（IL-2）和IL-4）的表達，促進TH17的分化。Ikzf1在Lys164處的脫乳作用損害TH17的分化。這些發現例證糖酵解如何調節蛋白質乳酸化的位點特異性以促進TH17分化，并將Ikzf1乳酸化作為自身免疫性疾病的潛在治療靶點。該研究于2023年10月發表在《Science Advances》，IF：13.6。
技術路線
主要研究結果
1. EAU小鼠CD4+ T細胞中乳酸化水平升高
建立EAU小鼠模型，并通過裂隙燈攝影和病理檢查評估葡萄膜炎的進展。EAU 小鼠的脾臟重量明顯增加，但各組間體重無顯著差異（圖1A-B）。與年齡匹配的對照組相比，EAU 小鼠脾臟和 CD4+ T 細胞中的乳酸含量更高（圖1C）。使用免疫磁珠分離CD4+ T 細胞，CD4+ T細胞中的乳酸化水平隨著EAU的進展而增加（圖1D）。同時，免疫熒光染色顯示，EAU小鼠脾臟中CD4+ T細胞的乳酸化水平過高（圖1E）。隨著葡萄膜炎的發展，病理免疫細胞破壞血液-視網膜屏障，并引發視網膜的破壞性反應。第14天浸潤視網膜的CD4+ T細胞乳酸化過度，第21天Pan-Kla陽性的CD4+ T細胞比例下降（圖1F）。這些結果表明，乳酸化參與自身免疫性葡萄膜炎中CD4+ T細胞在病理刺激下的免疫反應。
圖1. EAU小鼠CD4+ T細胞中乳酸化水平升高
2. 抑制乳酸化作用可抑制EAU的進展
在本研究中，DCA 治療減少CD4+ T 細胞中乳酸的產生和乳酸化水平（圖 2A -B）。它還降低EAU 小鼠的臨床和病理評分（圖2C -E）。相比之下，用魚藤酮阻斷線粒體代謝會增加 CD4+ T 細胞的乳酸化，加劇EAU的惡化（圖2A-E）。第14天，EAU+DCA組（用DCA治療的EAU小鼠）脾細胞中TH17細胞的比例下降，而EAU+魚藤酮組（用魚藤酮治療的EAU小鼠）脾細胞中TH17細胞的比例上升。然而，EAU+DCA組和EAU+魚藤酮組之間的TH1和Treg細胞比例沒有發現明顯差異（圖2F-G）。這些結果表明，調節CD4+ T 細胞的乳酸化水平可影響TH17細胞的分化和EAU的進展。
圖2. 抑制乳酸化作用可抑制EAU的進展
3. 乳酸化作用調節體外TH17分化
通過磁性分選分離純化的na?ve CD4+ T 細胞，并單獨使用抗CD3和CD28 抗體（TH0條件）或在 IL-6、TGF-β、IL-23 和 IL-1β 存在下（TH17 條件）進行刺激。誘導5天后，使用 FCM 分析細胞質 IL-17 的產生。發現，TH17 條件下CD4+ T細胞的乳酸化水平高于 TH0 條件下的 CD4+ T 細胞（圖3A）。DCA 處理下調CD4+ T 細胞的乳酸化水平，抑制TH17 細胞的分化，而魚藤酮處理上調乳酸化水平，增強TH17 的分化（圖3B-C）。使用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測分泌型 IL-17，也得到類似的結果（圖3D）。這些結果表明，CD4+ T 細胞中的乳酸化對 TH17 的分化非常重要。
圖3. 乳酸化作用調節體外TH17分化
4. CD4+ T細胞中乳酸化蛋白的全貌
為研究正常和EAU小鼠CD4+ T細胞上的Kla底物，采用一種包括免疫親和富集和四維質譜儀的綜合方法。從每組10多只小鼠中分離出1×108個CD4+ T 細胞，然后進行裂解。肽用胰蛋白酶消化，用固定的抗 Kla 增強，然后進行液相色譜-串聯質譜分析（LC-MS/MS；圖4A）。乳算化蛋白分布在不同的亞細胞定位中。在細胞核中發現359個乳酸化蛋白（32.28%）；在細胞質中發現448個乳酸化蛋白（40.29%）；在線粒體中發現123個乳酸化蛋白（11.06%）（圖4B）。
圖4C顯示乳酸化賴氨酸殘基附近氨基酸的頻率變化。Motif-X分析發現 KxAxxxxxxxK是 Kla 位點代表性極高的熱點（圖4D）。使用 NetSurfP 進行的結構特性分析表明，大多數乳酸化位點位于線圈（67%）和螺旋（28%）中，其余5%位于鏈中（圖4E）。與未乳酸化的殘基相比，乳酸化殘基更偏向于鏈狀和螺旋狀，這表明CD4+ T細胞在結構上更偏向于Kla。圖 4F 中的散點圖顯示Kla 位點與肽強度的量化關系。
圖4. CD4+ T細胞中乳酸化蛋白的全貌
5. Ikzf1在 Lys164處的高乳酸化對TH17的分化非常重要
測量CD4+ T 細胞中 Kla 蛋白相對于總蛋白豐度的變化。前15種差異乳酸化蛋白（DLPs）如圖5A所示。GO分析顯示，乳酸化上調蛋白富集于多個生物過程，包括淋巴細胞分化和基因表達調控（圖5B）。圖5（C -D）顯示包括 Ikzf1 C端y離子和N端b離子在內的MS/MS圖譜。觀察到對照組和EAU小鼠的 CD4+ T細胞（圖5E）之間以及TH0和TH17細胞（圖5F）之間的Ikzf1表達沒有明顯差異。免疫沉淀（IP）檢測后的免疫印跡證實，EAU小鼠CD4+ T細胞中Ikzf1的乳酸化水平上調（圖5E）。用短發夾RNA敲除內源性Ikzf1，并在na?ve CD4+ T細胞中分別過表達Flag標記的野生型（WT）Ikzf1、K164R突變Ikzf1和K373R突變Ikzf1（圖5G）。這些細胞被用于誘導TH17。結果顯示，敲除Ikzf1 會影響TH17的分化（圖5H），表明Ikzf1在調控TH17分化中的重要作用。WT和K373R Ikzf1過表達可挽救TH17的分化，但在oe-K164R組仍觀察到較低的分化率（圖5H）。這些結果表明，Ikzf1在Lys164 處的乳酸化對TH17的分化非常重要。
圖5. Ikzf1在 Lys164處的高乳酸化對TH17的分化非常重要
6. Ikzf1 K164la在EAU小鼠 CD4+ T細胞中上調
為了進一步驗證不同條件下Ikzf1在Lys164處的乳酸化水平，開發針對Ikzf1修飾肽[NLLRHI-(lactyl)K-LHSGEK]的特異性抗體。點印跡檢測顯示，所構建的抗體特異性地靶向Ikzf1的乳酸化肽，而不與未乳酸化的Ikzf1肽結合（圖6A）。利用這種特異性抗體，證實在TH17誘導下，CD4+ T 細胞中Ikzf1在Lys164處的乳酸化水平升高（圖 6B）。以前曾發現，魚藤酮處理可提高CD4+ T細胞的Pan-Kla水平并促進TH17分化。在本研究中，發現這一過程伴隨著Ikzf1 K164乳酸化的上調，并且乳酸化水平在DCA處理后下降（圖6C）。同時，隨著EAU的進展，Ikzf1 K164乳酸化上調，并且在體內對魚藤酮和DCA處理有調節作用（圖6D-E）。這些結果進一步表明Ikzf1 K164乳酸化在TH17分化和自身免疫性葡萄膜炎中的關鍵作用。
圖6. Ikzf1 K164la在EAU小鼠CD4+ T細胞中上調
7. CUT& Tag分析揭示Ikzf1在TH17分化條件下的轉錄后果
進行CUT& Tag分析，以探索CD4+ T細胞中可能受Ikzf1 K164la調控的基因，并研究Ikzf1 K164la在TH17發育中的潛在功能意義。簡而言之，用 oe-WT Ikzf1或oe-K164R Ikzf1過表達Ikzf1敲除的na?ve CD4+ T 細胞，用于TH17 誘導。誘導5天后，收獲細胞進行CUT& Tag分析。CUT& Tag結果顯示，在TH17分化條件下，CD4+ T細胞中的Ikzf1峰明顯富集，兩組中都發現超過15,000個Ikzf1結合峰，其中>60%位于啟動子序列（≤3 kb；圖7A-B）。GO 分析顯示，下調的峰值相關基因富集在多個免疫過程中，包括淋巴細胞分化（圖7C）。
具體而言，在TH17分化調控基因（包括IL-2、IL-4、Tlr4和Runx1）的候選基因組位點上發現的調用峰顯示，K164R組Ikzf1在這些基因啟動子上的富集水平降低（圖7D）。意外的是，反轉錄qPCR（RT-qPCR）結果顯示，在sh-Ikzf1 組中，阻止TH17分化的基因，包括IL-2和IL4的表達水平上調，而促進TH17分化的基因，包括Runx和Tlr4的表達水平下調（圖7E）。WT和K373R Ikzf1的過表達抑制IL-2和IL-4的表達，并挽救Runx1和Tlr4的表達，但K164R Ikzf1的過表達沒有顯示出這種效應（圖7E）。這些結果進一步證明Ikzf1在Lys164乳酸化調控下的雙重轉錄激活和抑制能力。雙熒光素酶報告實驗用于驗證Ikzf1的不同轉錄能力。一致的是，Ikzf1敲除會影響Runx1的轉錄并促進IL-2的轉錄，WT和K373R Ikzf1overexpression能逆轉這種情況，但K164R過表達則不能（圖7F-G）。在Ikzf1敲除的na?ve CD4+ T 細胞中應用重組抗IL-2抗體。結果顯示，抗IL-2處理挽救TH17分化，并上調IL-17的表達（圖7H-I）。總之，這些結果表明，Ikzf1在Lys164 處的乳酸化作用通過激活Runx1和Tlr4的轉錄以及抑制 IL-2和IL4的轉錄來調節TH17的分化（圖8）。
圖7. CUT& Tag分析揭示Ikzf1在TH17分化條件下的轉錄后果
圖8. 本研究的示意圖
總之，本研究探討了乳酸化在TH17細胞分化和EAU進展中的潛在作用。描述了CD4+ T細胞的乳酸化圖譜，并報告了Ikzf1在Lys164處的乳酸化調節TH17 的分化。此外，還驗證了 Ikzf1在TH17相關基因中的雙重轉錄激活和抑制作用，這些基因都受到乳酸化作用的調控。因此，本研究擴大了乳酸化蛋白質組的范圍，并證明了以前未被發現的乳酸化作用。
實驗方法
EAU的誘導和治療，體外誘導TH1和TH17細胞，腺病毒感染和質粒轉染，免疫熒光染色，HE染色，乳酸水平的定量，Real-time qPCR，WB，免疫沉淀，染色質免疫共沉淀，熒光素酶活性實驗，酶聯免疫吸附實驗，流式細胞術，Pan-Kla-based PTM富集，LC-MS/MS分析和數據庫檢索，CUT& Tag
參考文獻
Fan W, Wang X, Zeng S, Li N, Wang G, Li R, He S, Li W, Huang J, Li X, Liu J, Hou S. Global lactylome reveals lactylation-dependent mechanisms underlying TH17 differentiation in experimental autoimmune uveitis. Sci Adv. 2023 Oct 20;9(42): eadh4655. doi: 10.1126/sciadv.adh4655. Epub 2023 Oct 18. PMID: 37851814.