索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑，在包括胃癌（GC）在內(nèi)的多種癌癥中作為鐵死亡誘導(dǎo)劑具有重要的抗腫瘤作用。然而，索拉非尼作為鐵死亡誘導(dǎo)劑的作用最近受到了質(zhì)疑。有關(guān)鐵死亡與ATF2關(guān)系的信息非常有限，而ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用也尚未研究。因而，本研究探討了GC中ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用及其分子機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)索拉非尼激活A(yù)TF2的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)HSPH1的表達(dá)，減少SLC7A11蛋白的降解，從而導(dǎo)致對脂質(zhì)過氧化的保護(hù)。在小鼠中，敲除ATF2能有效提高索拉非尼的敏感性。本文于2023年2月發(fā)表在《Redox Biology》IF: 11.4期刊上。
技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、ATF2在胃癌中表達(dá)上調(diào)，預(yù)示預(yù)后不良
       TCGA數(shù)據(jù)顯示ATF2在胃癌組織中的高表達(dá)（圖1A），ATF2在GC細(xì)胞系中的表達(dá)也顯著高于非惡性細(xì)胞系（圖1B），在12對臨床樣本中，ATF2在胃癌組織中的表達(dá)也顯著高于癌旁（圖1C）。在107例GC組織和22例癌旁組織的GC芯片中檢測了ATF2的表達(dá)（圖1D），61.7%的GC組織高表達(dá)ATF2（圖1E），并且ATF2高表達(dá)的GC患者生存期更短（圖1F）。以上表明ATF2在胃癌中表達(dá)上調(diào)，預(yù)示預(yù)后不良。

圖1 ATF2在胃癌中表達(dá)上調(diào)，預(yù)示預(yù)后不良

2、ATF2敲除抑制GC細(xì)胞惡性表型
       如圖2所示，過表達(dá)ATF2促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，敲低ATF2則結(jié)果相反。表明ATF2促進(jìn)GC惡性表型。

圖2 ATF2敲除抑制GC細(xì)胞惡性表型

3、索拉非尼誘導(dǎo)GC細(xì)胞鐵死亡并激活A(yù)TF2表達(dá)
       由于先前的研究表明索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中存在不確定性，所以作者首先研究了索拉非尼是否會(huì)誘導(dǎo)GC細(xì)胞的鐵死亡。如圖3A所示，10 μM索拉非尼作用24 h后，AGS和MGC803細(xì)胞形態(tài)均縮小、變圓、排列疏松，而與鐵死亡抑制劑共同處理可以部分逆轉(zhuǎn)這些變化。與對照組相比，索拉非尼治療導(dǎo)致總細(xì)胞ROS和脂質(zhì)ROS增加（圖3B-3C）。此外，用索拉非尼孵育導(dǎo)致MDA急劇增加而GSH下降，而這種影響被fer-1有效抑制（圖3D和E）。以上結(jié)果表明索拉非尼誘導(dǎo)GC細(xì)胞鐵死亡。

圖3索拉非尼誘導(dǎo)AGS和MGC-803細(xì)胞鐵死亡

       鑒于鐵死亡與線粒體功能密切相關(guān)，接下來檢測線粒體膜電位（MMP）和形態(tài)學(xué)的變化。JC-1染色結(jié)果顯示，與對照組相比，索拉非尼治療顯著降低MMP（圖4A），透射電鏡顯示，索拉非尼處理的MGC803細(xì)胞線粒體嵴明顯減少或缺失，線粒體膜密度增加（圖4B）。這些結(jié)果也表明索拉非尼可以誘導(dǎo)GC細(xì)胞的鐵死亡。作為一種關(guān)鍵的應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡反應(yīng)中的表達(dá)變化仍然未知。如圖4C所示，索拉非尼處理增加ATF2的表達(dá)，尤其是磷酸化形式。值得注意的是，免疫熒光顯示，索拉非尼刺激后 ATF2 在細(xì)胞核中的表達(dá)量更高（圖4D）。因此，索拉非尼誘導(dǎo)的鐵變態(tài)反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn) ATF2 的核轉(zhuǎn)位并增強(qiáng) ATF2 在 GC 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。

圖4索拉非尼治療增加GC細(xì)胞中ATF2的表達(dá)并促進(jìn)其核易位

4、ATF2敲除抑制索拉非尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡
       如圖5所示，為了解ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用，作者干預(yù)ATF2的表達(dá)水平并評估它們對鐵死亡的影響。與載體組相比，ATF2過表達(dá)導(dǎo)致AGS細(xì)胞中索拉非尼的IC50值升高，而ATF2敲低導(dǎo)致MGC803細(xì)胞中索拉非尼的IC50值降低（圖5A）。索拉非尼治療和ATF2敲低均升高了細(xì)胞總ROS和脂質(zhì)ROS，ATF2敲低導(dǎo)致AGS細(xì)胞中ROS的進(jìn)一步升高，而ATF2過表達(dá)抑制了索拉非尼在MGC803細(xì)胞中誘導(dǎo)的升高（圖5B-C）。在索拉非尼處理的GC細(xì)胞中，ATF2過表達(dá)導(dǎo)致MDA降低，GSH升高，而ATF2敲低則顯示相反的結(jié)果（圖5D-E）。TEM結(jié)果顯示索拉非尼治療后，ATF2敲低的GC細(xì)胞線粒體減少，膜密度增加，嵴退化，這種作用部分被ATF2過表達(dá)逆轉(zhuǎn)（圖5F）。這些發(fā)現(xiàn)表明ATF2過表達(dá)抑制索拉非尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡。

圖5 ATF2敲除抑制索拉非尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡

5、ATF2在GC細(xì)胞中激活HSPH1的轉(zhuǎn)錄
       為進(jìn)一步闡明其潛在機(jī)制，進(jìn)行RNA-seq和ChIP-seq分析，以確定全基因組的DNA結(jié)合位點(diǎn)和ATF2的潛在轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。如圖6A所示，RNA-seq分析顯示，與對照組相比，MGC803細(xì)胞中ATF2基因敲除后，有1059個(gè)基因上調(diào)，370個(gè)基因下調(diào)。重要的是，RNA-seq數(shù)據(jù)的通路富集分析表明，ATF2基因敲除會(huì)顯著影響鐵死亡通路（圖6B）。接下來，ChIP-seq共鑒定出24119個(gè)峰，對應(yīng)3641個(gè)RefSeq基因，其中2.88%位于啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（圖6C）。在染色體上觀察到了不同的峰值，并掃描了峰值之間共享的motif（圖6D和E）。

圖6利用RNA-seq和ChIP-seq技術(shù)鑒定ATF2的全基因組DNA結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)

       然后，對RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉分析，篩選出222個(gè)ATF2直接調(diào)控的候選轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)（圖7A）。其中，HSPH1在ATF2敲低后顯著下調(diào)（圖7B）。此外，在TCGA數(shù)據(jù)集中，HSPH1在GC中的表達(dá)與ATF2呈顯著正相關(guān)（圖7C）。如圖7D所示，ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示HSPH1啟動(dòng)子區(qū)域存在顯著的ATF2結(jié)合峰。因此，作者推測HSPH1可能是ATF2的潛在靶基因。WB分析結(jié)果顯示，ATF2過表達(dá)后，HSPH1增加，而ATF2敲除后，HSPH1減少（圖7E）。此外，ChIP-qPCR進(jìn)一步證實(shí)ATF2可與HSPH1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合（圖7F）。這些數(shù)據(jù)表明ATF2可以通過與HSPH1啟動(dòng)子結(jié)合來激活HSPH1的表達(dá)。

圖7 ATF2結(jié)合HSPH1啟動(dòng)子激活其轉(zhuǎn)錄

6、HSPH1與SLC7A11在GC中相互作用并增加其穩(wěn)定性
       鑒于多項(xiàng)研究報(bào)道了熱休克蛋白在鐵死亡反應(yīng)中的突出作用，作者試圖確定 HSPH1是否會(huì)影響SLC7A11在GC中的表達(dá)。首先查詢GeneMANIA數(shù)據(jù)庫，預(yù)測并顯示HSPH1與SLC7A11之間潛在的相互作用（圖8A）。為驗(yàn)證這一預(yù)測，進(jìn)行co-IP實(shí)驗(yàn)，確定HSPH1與SLC7A11存在物理相互作用（圖8B）。采用siRNA敲除HSPH1的表達(dá)（圖8C），并將HSPH1 siRNA轉(zhuǎn)染到ATF2穩(wěn)定過表達(dá)的AGS細(xì)胞中。有趣的是，觀察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表達(dá)水平，但沒有降低mRNA水平（圖8D）。因此，進(jìn)行CHX追逐試驗(yàn)，以確定在是否敲除HSPH1的情況下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明，與對照組相比，抑制HSPH1會(huì)加速AGS細(xì)胞中SLC7A11蛋白的降解（圖8E）。這些結(jié)果表明，HSPH1可以與SLC7A11相互作用，并至少部分地通過增加SLC7A11蛋白的穩(wěn)定性來增加其表達(dá)。敲除HSPH1可部分消除ATF2過表達(dá)對細(xì)胞ROS和脂質(zhì)ROS的影響（圖8F和G）。同樣，聯(lián)合轉(zhuǎn)染HSPH1 siRNA能顯著逆轉(zhuǎn)ATF2過表達(dá)對鐵變態(tài)細(xì)胞死亡中細(xì)胞MDA和GSH水平的影響（圖8H和I）。這些結(jié)果為ATF2通過HSPH1調(diào)控索拉非尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡提供了證據(jù)。

圖8 HSPH1與SLC7A11相互作用，提高其在GC中的穩(wěn)定性

7、體內(nèi)ATF2敲低增加GC對索拉非尼的敏感性
       最后，為評估ATF2單獨(dú)和聯(lián)合索拉非尼對體內(nèi)GC的影響，建立裸鼠異種移植模型（圖9A）。穩(wěn)定ATF2敲除細(xì)胞形成的腫瘤始終比對照GC細(xì)胞形成的腫瘤更小更輕，這表明ATF2敲除能有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長（圖9B）。此外，經(jīng)索拉非尼治療后，皮下腫瘤的體積和重量均顯著減少（圖9C和D）。也就是說，ATF2敲除聯(lián)合索拉非尼治療對腫瘤生長的抑制作用最強(qiáng)。為更好地觀察潛在的死亡，皮下腫瘤切片被4-HNE染色，IHC染色顯示，sh-ATF2 +索拉非尼組的4-HNE 表達(dá)量最高（圖9E）。因此，ATF2基因敲除可增強(qiáng)索拉非尼在體內(nèi)對GC的抗腫瘤作用。

圖9體內(nèi)ATF2敲低增加GC對索拉非尼的敏感性

       總之，在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)索拉非尼激活A(yù)TF2的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)HSPH1的表達(dá)，減少SLC7A11蛋白的降解，從而導(dǎo)致對脂質(zhì)過氧化的保護(hù)（圖10）。因此，以ATF2/HSPH1軸為靶點(diǎn)來增強(qiáng)索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡代表了一種有吸引力的GC治療策略。

圖10 圖像摘要

實(shí)驗(yàn)方法
胃癌臨床樣本采集，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，WB，RT?PCR，IHC，細(xì)胞生長曲線，IC50檢測，Transwell遷移和侵襲，Calcein-AM/PI染色，ROS和脂質(zhì)過氧化檢測，MDA和GSH檢測，線粒體膜電位檢測，透射電鏡TEM，RNA-seq，ChIP-seq，共免疫沉淀（Co-IP），蛋白穩(wěn)定性CHX實(shí)驗(yàn)，小鼠模型，
參考文獻(xiàn)
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59:102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564. Epub 2022 Dec 2. PMID: 36473315; PMCID: PMC9723522.