單細胞測序揭示新的CAF細胞亞群在食管癌惡性進展中的作用
食管鱗狀細胞癌（ESCC）是一種常見的惡性腫瘤，其發生過程由正常上皮細胞向上皮內瘤變，最后向浸潤性癌轉變。然而，癌前病變如何進展為癌仍然是一個謎。本研究報告了一個全面的細胞RNA測序和空間轉錄組研究79個多階段食管病變29例食管鱗癌患者。研究揭示了ANXA 1表達在上皮細胞中的逐漸和顯著的損失，是由于其轉錄因子KLF 4沿著病變進展。本研究于2023年5月發表于《Cancer Cell》上，IF=50.3 。
技術路線
主要研究內容
1.單細胞轉錄組學分析解讀多階段食管鱗癌腫瘤發生中的不同細胞類型
對79個手術取出的食管樣品進行scRNA-seq，包括45個NOR、9個LGIN、9個HGIN和來自29名ESCC患者的16個腫瘤（圖1A）。基于圖的聚類和典型細胞標記注釋揭示了七種主要的細胞類型，即，上皮細胞（n = 5，218）、成纖維細胞（n = 28，530）、內皮細胞（n = 14，388）、T細胞（n = 63，332）、B細胞（n = 38，220）、骨髓細胞（n = 21，627）和肥大細胞（n = 5，177），這些細胞類型的組成在不同的疾病階段不同（圖1B）。發現>25%的NOR和LGIN階段的上皮細胞高度表達MD程序，而該細胞亞型的比例在HGIN和ESCC階段降低至<6%，表明MD程序在保持食管上皮細胞的正常表型中起重要作用（圖1C）。超過95%的NOR和LGIN階段的成纖維細胞被鑒定為NF。CAF出現在HGIN階段，占ESCC中總成纖維細胞的63%（圖1D）。以表達IGFBP 3（Endo-IGFBP 3）為特征的內皮細胞亞型在ESCC中增加至50%，但僅分別占NOR、LGIN和HGIN階段的總內皮細胞的近25%（圖1 E）。如預期的，在ESCC腫瘤發生期間的不同階段，五種免疫細胞類型B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、肥大細胞和骨髓細胞的比例變化（圖1F）。結果發現，雖然B細胞比例由NOR的27%下降到ESCC的16%，但LGIN和HGIN的B細胞比例增加，分別為43.2%和47.0%;雖然ESCC中CD 8 + T細胞比例（51.3%）明顯高于NOR（26.7%），但NOR、LGIN（26.1%）和HGIN（24.3%）的比例相似。這些結果提示，食管鱗癌微環境中免疫細胞數量的變化可能是食管鱗癌發生的晚期事件。
圖1：單細胞轉錄組學分析解讀多階段食管鱗癌腫瘤發生中的不同細胞類型
2.食管鱗癌發生過程中ANXA1在上皮細胞中的表達逐漸受到抑制
進一步探索了不同疾病階段上皮細胞的組成和轉錄改變。分析的上皮細胞（n = 5，218）由來自NOR的1，002個細胞、來自LGIN的205個細胞、來自HGIN的1，097個細胞和來自ESCC的2，914個細胞組成（圖2A）。無監督聚類分析揭示了在ESCC發展期間以不同表達程序為特征的八種不同上皮細胞類型（圖1C、2A和S2 A;表S2）。具有四種表達程序的上皮細胞，即，QP、CY、MD和TD占正常上皮細胞的88.1%（883/1，002）;然而，在ESCC腫瘤中表達這些程序的細胞的百分比下降到43.1%（2，914個中的1，256個）（圖2A）。相比之下，在ESCC發展過程中，表達其他四種癌癥相關程序（包括HY、RS、DO和AP）的上皮細胞的比例從9.8%增加到56.9%（圖2A和2B）。計算了程序標記基因的平均表達的Z評分，并且結果還顯示與NOR相比，HGIN（p = 1.45×10-58）和ESCC（p = 1.94 ×10-105）中MD程序的顯著降低（圖2B）。選擇了ANXA 1進行驗證和深入分析，發現ANXA 1表達水平從NOR逐漸降低到LGIN、HGIN和ESCC（圖2C，趨勢檢驗，p = 4.45×10-80），這通過空間轉錄組學分析證實，顯示位于上皮中的ANXA 1 RNA水平與NOR（分別為p = 3.80×10-161和p<10-308）或LGIN（分別為p=2.14×10-114和p=4.84×10-187）相比顯著降低，趨勢檢驗P為6.57 ×10-17（圖2D和2 E）。還對不同疾病分期的組織進行了ANXA 1免疫組化染色，結果進一步證實，與NOR組織相比，ANXA 1在癌前和ESCC部位的蛋白水平顯著下調（p=7.41×10-3，p=9.69×10-4和p = 3.52×10-6;趨勢檢驗，p= 7.36×10-15;圖2F）。這些結果有力地表明，食管特異性蛋白ANXA 1的功能喪失可能是ESCC腫瘤發生的關鍵事件。
圖2：食管鱗癌發生過程中上皮細胞ANXA1表達的逐漸抑制
3.上皮細胞中ANXA1抑制促進NFs向CAFs的轉化
鑒定了表達SLPI（NF-SLPI）、CCN 2（NF-CCN 2）或APOE（NF-APOE）標志物基因的三種NF，以及兩種CAF類型，即：基于已知的CAF標志物基因，可以鑒定炎性CAF（iCAF）和成肌纖維細胞CAF（myCAF）（圖3A）。iCAF顯示活性趨化因子產生途徑，具有高表達水平的諸如IL 24和CXCL 18的基因，而myCAF具有高表達水平的與ECM重塑和降解相關的基因，諸如MMPl和MMPll（圖3B和3C）。然后，構建了成纖維細胞狀態轉變的軌跡，結果顯示CAF活化軌跡從NF-SLPI亞型開始，通過NF-CCN 2到iCAF和最終的myCAF，而NF-APOE通過次要軌跡被活化為NF子集（圖3D）。沿著該軌跡，一致地鑒定了在NF中活化的途徑在起始點富集，而膠原蛋白三聚體中的CAF相關基因（即，CAF相關基因）在起始點富集。COL 1A 1和CTHRC 1）、炎癥（即，CXCL 1、CXCL 8和IL 24）和ECM重塑（即，FAP、MMPl和MMPll）在成纖維細胞活化的晚期富集（圖3E）。提示在食管鱗癌的形成和發展過程中，早在HGIN甚至LGIN階段，微環境中的NF就被激活為CAFs。計算成纖維細胞標志物基因在NFS和CAF中的表達分數以量化其生物學功能，并與上皮細胞表達程序分數進行相關性分析。結果表明，在8種上皮細胞方案中，只有MD方案的評分與NF簽名評分顯著正相關(r=0.29，p=0.014)，而與ICAF(r=-0.24，p=0.041)和myCAF0.27(r=-0.27，p=0.022)簽名評分顯著負相關(圖3F）。空間轉錄組學結果進一步驗證了ANXA 1與NF活性呈負相關，與CAF活性呈負相關。具體地，揭示了隨著上皮中ANXA 1 RNA水平從LGIN/HGIN到ESCC降低，固有層和粘膜下層中的NF特征評分也顯著降低；然而，當ANXA 1表達在ESCC發展期間被抑制時，iCAF和myCAF特征評分顯著增加（圖3 H和3 I）。這些結果表明，食管上皮細胞分泌的ANXA 1可能通過上皮細胞-成纖維細胞的相互作用在調控微環境NF中發揮重要作用，上皮細胞ANXA 1功能的缺失可能導致NF向CAF轉化。
圖3：上皮細胞中的ANXA 1抑制促進NF轉化為CAFs
4.上皮ANXA1抑制促進myCAF在體外和體內的活化
分別從5例ESCC患者的NOR、LGIN、HGIN和ESCC組織中獲得食管類器官和成纖維細胞。成纖維細胞的免疫熒光染色和類器官及其相應組織的組織病理學表征以及選擇標志物的免疫化學染色的圖像示于圖4A。食管組織的免疫熒光分析還顯示，上皮細胞和ECM中的ANXA 1水平被抑制，同時HGIN和ESCC組織中周圍基質中的FAP（CAF活化標志物）水平顯著增加（圖4 B），進一步證實了兩種細胞類型之間的相關性和潛在的相互作用。然后建立了ANXA 1缺失或過表達的ESCC和正常食管上皮細胞系（OE；圖4C），并將它們與NF共培養。結果顯示，與對照細胞共培養的那些相比，NF在與ANXA 1耗盡的ESCC細胞共培養時具有顯著更高的迀移能力，但在與ANXA 1-OE ESCC細胞共培養時具有顯著更低的迀移能力（圖4D）。與相應的對照相比，myCAF活化標志物在與ANXA 1敲除（KO）細胞共培養的NF中顯示一致的上調，但在與ANXA 1-OE細胞共培養的NF中顯示一致的下調。然而，在這些體外實驗環境中，未檢測到iCAF相關標志物變化（圖4 E）。此外，將重組人ANXA 1蛋白（rANXA 1）添加到NF和ESCC的共培養物中以劑量依賴性方式基本上抑制myCAF活化，并且該效果與與具有強制ANXA 1過表達的ESCC細胞共培養的效果相同（圖4F）。接下來檢測ECSS細胞中ANXA1表達的變化是否會影響與或不與從食管組織樣本中分離的NF共移植的小鼠腫瘤異種移植物的生長速率。如圖4G所示，與僅來源于ESCC細胞的異種移植物相比，來源于KYSE30細胞加NF的異種移植物具有顯著增加的生長速率，表明CAF可以促進ESCC進展。
圖4：上皮ANXA1抑制促進myCAF在體內外的活化
5.ANXA1缺失通過減弱其與FPR2的相互作用促進myCAF活化
通過使用相互免疫共沉淀分析來檢查結合是否是通過FPR，如果是，則哪個FPR家族成員是ANXA1靶標，結果顯示ANXA1特異性結合FPR2，而不是其他兩個FPR成員（圖5A和B）。這種配體-受體相互作用進一步得到免疫熒光測定的支持，所述免疫熒光測定顯示rANXAl和FPR 2在NF和CAF細胞膜中的共定位（圖5C）。還觀察了ANXA 1-FPR2結合破壞后NF向myCAF轉化的功能改變，并且發現當FPR 2敲低NF與ANXA 1-OE ESCC細胞共培養時，myCAF活化標志物的表達水平顯著增加（圖5D），表明ANXA 1通過NF中與FPR 2的配體-受體相互作用對NF向myCAF轉化的控制作用。進一步檢查了抑制NF向myCAF轉化的ANXA 1FRP 2信號傳導的下游效應子，并且發現ANXA 1-FPR 2相互作用強烈抑制AKT、ERK和SMAD 3的磷酸化，這伴隨著myCAF標志物FAP、Vim、MMP 1和a-SMA的水平顯著降低（圖5E）。當用rANXAl或ERK（SCH 772984）、AKT（MK-2206）和SMAD 3（SIS 3）的抑制劑處理NF時，也觀察到這些類似的變化（圖5 F）。盡管ANXAl和TGF-b作用的下游分子模塊可能相似，但TGF-b對NF轉化為myCAF的作用不依賴于FPR 2（圖5E）。這些結果表明正常或癌性上皮細胞與NF或CAF之間的實質性相互作用。最后，檢查了ANXA 1在由致癌物4-NQO誘導的小鼠ESCC模型中抑制ESCC發展和進展的潛在功能。我們向小鼠施用Ac2 -26（一種結合FPR受體的ANXA 1模擬肽）持續5周，并發現與用媒介物處理的對照小鼠相比，Ac 2 -26處理組中癌前病變和腫瘤的負擔顯著降低（圖5G）。這些體內結果進一步支持ANXA 1在抑制ESCC中的重要作用。
圖5：ANXA1缺失通過減弱其與FPR2的相互作用促進myCAF活化
6.ANXA1功能的喪失是由其轉錄因子KLF4的抑制引起的
使用四個公共數據庫進行了計算機模擬分析，得到了ANXA 1的11個候選TF。然后，分析了scRNA-seq數據中這些TF的表達水平與ANXA 1之間的相關性，結果表明四種潛在的TF，KLF 4、KLF 5、CEBPB和FOXA 1，與ANXA 1 RNA水平顯著正相關（r > 0.3，p < 0.05；圖6A）。通過scRNA-seq和免疫化學染色，我們發現與NOR相比，從LGIN、HGIN到ESCC，KLF4 RNA和蛋白質水平均顯著 降低（圖6 B和6C）。ANXA 1 RNA和KLF 4 RNA水平之間存在顯著正相關（r = 0.39，p = 5.4×10-5；圖6D）。HET-1A和KYSE 450細胞中的基因敲低測定顯示，在四種TF中，僅靶向KFL 4的小干擾RNA（siRNA）顯著抑制ANXA 1表達（圖6 E）。電泳遷移率變動測定證實KLF 4特異性結合ANXA 1啟動子序列，其可被抗KLF4的抗體消除（圖6 F）。染色質免疫沉淀與定量聚合酶鏈反應測定偶聯顯示ANXA 1被KLF4抗體顯著富集，并且結果在HET-1A、KYSE 450和KYSE 30細胞中是一致的（圖6 G）。總之，這些生化結果證明KLF 4是一種真正的TF，它能正向調節食管上皮細胞中ANXA 1的表達。最終證明了KLF 4調節ANXA 1轉錄，這連接到NFs向CAFs的轉化。為此，進行了體外實驗，以探討KLF 4表達狀態對CAF遷移和激活的影響。結果顯示，沉默KLF 4顯著增強CAF活化和迀移，而恢復ANXA 1（通過向共培養基中添加rANXA 1）可以顯著抑制由KLF 4抑制引起的CAF活化和迀移（圖6 H和6I）。這些結果支持KLF4調控ANXA1的轉錄，ANXA1調控NF向myCAF的轉化。我們還在正常食管樣品中進行了KLF4和ANXA1蛋白的免疫熒光染色，結果顯示這兩種分子共定位且正相關（圖6J）。
圖6：ANXA1缺失是由其轉錄因子KLF4的抑制引起的
結論
總之，本研究通過利用來自同一個ESCC個體的NOR、LGIN、HGIN和癌標本，并使用整合的scRNA-seq、空間轉錄組學分析、功能測定和動物實驗，已經發現了ESCC從其癌前病變通過上皮細胞和成纖維細胞之間的異常串擾的進展的重要機制。本研究結果可能對了解癌癥的發展和ESCC的預防和臨床治療具有深遠的意義。
實驗方法
收集臨床樣本，單細胞轉錄組測序，軌跡分析，基因集變異分析，空間轉錄組測序， ANXA 1表達改變的細胞系的建立，基因表達的RNA干擾， Co-培養實驗，成纖維細胞遷移測定，小鼠異種移植實驗，小鼠原代ESCC模型和Ac 2 -26治療，定量實時PCR分析，蛋白質印跡測定，免疫組織化學和多重免疫熒光分析，免疫熒光分析，免疫沉淀測定，酶聯免疫吸附測定，電泳遷移率轉移試驗，報告質粒構建和報告試驗，染色質免疫沉淀偶聯定量PCR分析。
參考文獻
Chen, Y., Zhu, S., Liu, T., Zhang, S., Lu, J., Fan, W., Lin, L., Xiang, T., Yang, J., Zhao, X., Xi, Y., Ma, Y., Cheng, G., Lin, D., & Wu, C. (2023). Epithelial cells activate fibroblasts to promote esophageal cancer development. Cancer cell, 41(5), 903–918.e8. https://doi.org/10.1016/j.ccell.2023.03.001