自噬和糖酵解是涉及生理和病理細(xì)胞程序的高度保守的生物過(guò)程，但這些過(guò)程之間的相互作用并不明確。本研究發(fā)現(xiàn)了ULK 1直接與LDHA相互作用促進(jìn)乳酸產(chǎn)生，乳酸通過(guò)Vps 34乳酰化連接自噬和糖酵解，Vps 34乳酰化增強(qiáng)了Vps 34與Beclin 1、Atg 14 L和UVRAG的結(jié)合，然后增加了Vps 34脂質(zhì)激酶活性，從而促進(jìn)了自噬通量和內(nèi)溶酶體運(yùn)輸。本研究描述了自噬調(diào)控機(jī)制，整合了兩個(gè)高度保守的生命過(guò)程（糖酵解和自噬）。本文于2023年6月發(fā)表于《Science Advances》上，IF=13.6。
技術(shù)路線

研究?jī)?nèi)容

1.ULK1誘導(dǎo)LDHA Ser¹⁹⁶磷酸化

       ULK 1是參與自噬早期到晚期階段的最關(guān)鍵的蛋白激酶。為了全面鑒定ULK 1相互作用蛋白，進(jìn)行了串聯(lián)親和純化。免疫沉淀和酵母雙雜交測(cè)定證實(shí)ULKl與LDHA相互作用（圖1A-C）。由于ULK1介導(dǎo)糖酵解酶HK和PFK1的磷酸化，我們推測(cè)ULK1可能是一種LDHA激酶。為了檢驗(yàn)這一假設(shè)，進(jìn)行了體外激酶測(cè)定和質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)LDHA在S196被ULK1磷酸化。為了驗(yàn)證LDHA S196的磷酸化，產(chǎn)生特異性識(shí)別S196-磷酸化LDHA的多克隆抗體（圖1D）。用丙氨酸替換196位的絲氨酸（S196 A）完全消除了LDHA磷酸化（圖1E）。此外，通過(guò)Earle平衡鹽溶液（EBSS）誘導(dǎo)的饑餓或雷帕霉素（mTOR）抑制劑雷帕霉素的機(jī)制靶標(biāo)的ULKl活化增強(qiáng)LDHA S196磷酸化，并且通過(guò)ULKl抑制劑MRT68921的ULKl抑制降低LDHA S196磷酸化（圖1F）。同樣地，與對(duì)照細(xì)胞相比，ULK1敲除（KO）小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）中的LDHA S196磷酸化降低，并且在正常和EBSS培養(yǎng)基中ULK1重新表達(dá)后，LDHA S196磷酸化重新建立（圖1G）。LDHA敲低抑制p62降解，并且LDHAWT和LDHA^S196D的轉(zhuǎn)染完全逆轉(zhuǎn)了LDHA敲低的作用，而LDHA^S196A部分挽救了這些作用（圖1H）。體外激酶測(cè)定和Western印跡進(jìn)一步證實(shí)了LDHA^WT的Ser196被ULK1磷酸化，但LDHA突變體（LDHA^S96A）在體外不被ULK1磷酸化（圖1I）。因此，這些結(jié)果表明ULK1作為上游調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)LDHA S196磷酸化。

圖1：1.ULK1誘導(dǎo)LDHA Ser¹⁹⁶磷酸化

2.LDHA磷酸化增強(qiáng)其酶活性

       為了測(cè)試磷酸化對(duì)LDHA酶活性的生物學(xué)效應(yīng)，通過(guò)EBSS培養(yǎng)基或mTOR抑制劑雷帕霉素的ULK 1活化增加了細(xì)胞溶質(zhì)乳酸鹽水平，而ULK1抑制劑MRT 68921降低了細(xì)胞溶質(zhì)乳酸鹽水平（圖2A）。同樣地，通過(guò)短發(fā)夾RNA（shRNA）敲低ULKl表達(dá)也降低了正常培養(yǎng)基或EBSS培養(yǎng)基中的細(xì)胞溶質(zhì)乳酸水平，但沉默其他自噬基因（即Vps 34、Atg 5和Atg 7）的表達(dá)對(duì)細(xì)胞溶質(zhì)乳酸水平?jīng)]有影響（圖2B和C）。此外，ULK 1敲低H1299細(xì)胞中ULK 1 WT表達(dá)的恢復(fù)重新建立了細(xì)胞溶質(zhì)乳酸鹽水平，而ULK1 ^ΔKI突變體（具有丟失的激酶結(jié)構(gòu)域）的表達(dá)未恢復(fù)（圖2D）。氨基酸饑餓和mTOR抑制劑Torinl處理降低了細(xì)胞溶質(zhì)NADH/NAD+比率，然后氨基酸補(bǔ)充和去除Torinl恢復(fù)了NADH/NAD+比率（圖2 E）。此外，LDHA沉默降低了細(xì)胞溶質(zhì)乳酸水平，并且LDHA^WT和LDHA^S196D表達(dá)的恢復(fù)恢復(fù)了細(xì)胞溶質(zhì)乳酸水平，而LDHA^S196A表達(dá)未能挽救LDHA酶活性（圖F和G）。這些表型通過(guò)體外測(cè)量酶活性和體內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)來(lái)證實(shí)（圖2 H）。此外，通過(guò)草氨酸鹽或shRNA抑制LDHA酶活性和通過(guò)MRT 68921抑制ULK1活性降低了在EBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中的胞質(zhì)乳酸鹽水平（圖2 I）。這些結(jié)果表明ULK1介導(dǎo)LDHA磷酸化并增強(qiáng)其酶活性。

圖2：LDHA磷酸化增強(qiáng)其酶活性

3.Vps34通過(guò)乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60在K356和K781處被乳酰化

       為了驗(yàn)證乳酰化在自噬調(diào)節(jié)中的作用，測(cè)量了哺乳動(dòng)物自噬核心蛋白的乳糖化的免疫共沉淀和蛋白質(zhì)印跡與抗泛-乳糖化抗體。發(fā)現(xiàn)許多在不同自噬階段的乳酰化自噬核心蛋白（Vps 34、ULK 1、UVRAG等）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)（圖3A和B）。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在LDHA敲低細(xì)胞中Vps 34乳酰化水平降低（圖3C）和LDHA抑制劑草氨酸鹽處理的細(xì)胞，但乳酸鹽、A-7669662（AMPK激活劑）或魚藤酮處理的細(xì)胞中增加（圖3D）。為了鑒定Vps 34乳酰化位點(diǎn)，在免疫沉淀后從用IOmM乳酸鹽處理24小時(shí)的人胚腎（HEK）293 T細(xì)胞中純化Vps 34-Flag，并通過(guò)質(zhì)譜分析，并鑒定了兩個(gè)賴氨酸殘基（K356和K781）。為了驗(yàn)證這兩個(gè)乳酰化位點(diǎn)，通過(guò)定點(diǎn)誘變將兩個(gè)賴氨酸殘基改變?yōu)榫彼釟埢⑦@些突變體轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中。Vps34^K356R和Vps34^K781R的乳酰化水平顯著降低，并且雙突變體Vps34^2KR的乳酰化水平被消除（圖3E）。為了鑒定Vps 34乳酰化書寫者，構(gòu)建乙酰轉(zhuǎn)移酶shRNA文庫(kù)，并通過(guò)免疫共沉淀和用抗泛乳酰化抗體的蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定Vps 34乳酰化水平。敲低KAT5/TIP60表達(dá)減弱了Vps34的乳酰化，但沒(méi)有其他乙酰轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮這種作用（圖3F）。為了鑒定與Vps 34相互作用的蛋白質(zhì)，用二硫代雙溶液（DSP）處理過(guò)表達(dá)Vps 34-Flag的細(xì)胞以誘導(dǎo)交聯(lián)。Vps 34-Flag相互作用蛋白通過(guò)免疫共沉淀被拉下，然后通過(guò)質(zhì)譜法鑒定。除了PI3KC3亞基Beclinl、UVRAG、Atgl 4、Pacer和Rubicon之外，Vps 34還與TIP60和p300相互作用（圖3G）。內(nèi)源性和外源性免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Vps34與TIP60相互作用，并且EBSS饑餓促進(jìn)了Vps34和TIP60的相互作用（圖3H）。通過(guò)TIP60抑制劑MG149或TIP60激酶GSK3抑制劑SB216763抑制TIP60活性降低了Vps34乳酰化，并且通過(guò)氨基酸或血清剝奪增強(qiáng)TIP60活性增加了Vps34乳酰化水平（圖3I）。同樣地，用野生型TIP60處理在TIP60敲低的HEK293T細(xì)胞中重新建立了Vps34乳酰化的下調(diào)，但是功能喪失突變體TIP60^S86A未能挽救已經(jīng)被TIP60敲低的HEK293T細(xì)胞中已經(jīng)降低的Vps34乳酰化（圖3J）。體外乳酰化測(cè)定顯示TIP60通過(guò)泛-Kla抗體和通過(guò)質(zhì)譜法使Vps 34 K356和K781乳酰化（圖3K）。這些結(jié)果表明，TIP 60介導(dǎo)Vps 34乳酰化。

圖3：Vps34通過(guò)乙酰轉(zhuǎn)移酶TIP60在K356和K781處被乳酰化

4.Vps34乳酰化正調(diào)控其與UVRAG和Beclin1的相互作用以及脂質(zhì)激酶活性

       為探討Vps 34乳酰化的生物學(xué)功能，采用免疫沉淀和Western blot分析Vps 34與Vps15、Beclin1、ATG14L和UVRAG的相互作用。通過(guò)shRNA介導(dǎo)的LDHA敲低降低Vps 34乳酰化損害了Vps34與Beclinl、ATG14L和UVRAG的結(jié)合，并且功能喪失突變體LDHA^S196A未能挽救Vps34與LDHA敲低細(xì)胞中這些亞基的結(jié)合，這與野生型LDHA處理的效果相反（圖4A）。Vps 34 ^K356R和Vps 34 ^K781R突變體分別使Vps 34-Beclin1-ATG14L復(fù)合物（I）和Vps34-Beclin1-UVRAG復(fù)合物（II）不穩(wěn)定，而Vps 34^2KR突變體在兩個(gè)乳酰化位點(diǎn)處具有取代，降低了Vps 34與Beclin1、ATG14L和UVRAG在正常培養(yǎng)基和EBSS培養(yǎng)基中的結(jié)合（圖4B和C）。此外，高乳酸鹽處理促進(jìn)了Vps34^WT與Beclin1、ATG14L和UVRAG的結(jié)合，而不是Vps34^2KR的結(jié)合（圖4D）。此外，與對(duì)照細(xì)胞相比，當(dāng)在正常或EBSS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中Vps 34乳酰化寫入器KAT5/TIP60被敲低時(shí)，Vps34與Beclin1、ATG14L和UVRAG的結(jié)合減少（圖4 E）。結(jié)果表明，Vps 34乳酰化促進(jìn)了Vps 34與Beclin 1、ATG 14 L和UVRAG的結(jié)合。在Vps 34沉默的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Vps 34 ^WT完全恢復(fù)了Vps 34敲低的作用，而轉(zhuǎn)染Vps34^2KR僅部分逆轉(zhuǎn)了這些作用（圖4F和G）。同樣地，在饑餓條件下，與對(duì)照細(xì)胞中相比，Vps34沉默減少了GFP-DFCPl斑點(diǎn)的數(shù)目，Vps 34沉默的細(xì)胞中恢復(fù)Vps 34 WT表達(dá)完全儲(chǔ)存了GFPDFCPl斑點(diǎn)的數(shù)目，并且Vps 342 KR表達(dá)僅部分逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖4H）。體內(nèi)和體外ELISA結(jié)果顯示Vps 34脫酰化部分損害Vps34脂質(zhì)激酶活性（圖4J和K）。總之，這些結(jié)果表明，乳糖化通過(guò)增強(qiáng)Vps34與Beclin1、ATG14L和UVRAG的結(jié)合來(lái)促進(jìn)Vps 34脂質(zhì)激酶活性。

圖4：Vps34乳酰化正調(diào)控其與UVRAG和Beclin1的相互作用以及脂質(zhì)激酶活性

5.Vps34乳酰化促進(jìn)自噬體的形成和成熟

       為了分析Vps 34乳酰化對(duì)自噬通量的影響，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析p62降解。Vps 34^2KR部分地抑制p62降解，與Vps 34 ^WT在正常培養(yǎng)基中和EBSS饑餓條件下在細(xì)胞水平上的作用相反（圖5A）。用GFP-LC 3切割測(cè)定法驗(yàn)證乳酸和Vps 34乳酰化對(duì)自噬通量的生物學(xué)功能。Vps 34敲低的HEK293 T細(xì)胞中的GFP-LC 3切割在正常培養(yǎng)基和EBSS培養(yǎng)基中受到抑制，并且Vps 34 ^WT表達(dá)的恢復(fù)促進(jìn)了GFP-LC3切割，并且Vps 34^2KR的再表達(dá)僅部分逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖5 B）。此外，Vps 34敲低的HEK 293T細(xì)胞中的GFP-LC 3切割在正常培養(yǎng)基和EBSS培養(yǎng)基中受到抑制，并且Vps 34 ^WT表達(dá)的恢復(fù)促進(jìn)了GFP-LC 3切割，并且Vps 34^2KR的再表達(dá)僅部分逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)（圖5 B）。這些結(jié)果通過(guò)內(nèi)源性LC 3斑點(diǎn)測(cè)定進(jìn)一步證實(shí)（圖5C和D）。此外，透射電子顯微鏡測(cè)定顯示，與正常培養(yǎng)基和EBSS誘導(dǎo)的饑餓條件下培養(yǎng)的對(duì)照細(xì)胞相比，Vps 34敲低的H1299細(xì)胞中自噬囊泡的數(shù)量減少，Vps34 ^WT表達(dá)逆轉(zhuǎn)了自噬囊泡的數(shù)量減少，而Vps 34^2KR部分恢復(fù)了囊泡的數(shù)量（圖5E和F）。這些結(jié)果表明，Vps 34乳酰化是自噬體形成和成熟所必需的。

圖5：5.Vps34乳酰化促進(jìn)自噬體的形成和成熟

6.Vps 34乳酰化促進(jìn)內(nèi)體-溶酶體降解

       為了確定Vps34乳酰化是否調(diào)節(jié)這種表型，在Vps34敲低的U2OS中表達(dá)了Vps34WT和Vps342KR。免疫熒光顯微鏡顯示用Vps34^WT重建校正了擴(kuò)大的內(nèi)體積累的表型，并且Vps34^2KR部分挽救了內(nèi)體積累（圖6A）。通過(guò)Western印跡分析分析乳酸鹽介導(dǎo)的Vps34乳酸化是否調(diào)節(jié)EGFR降解、內(nèi)源性EGFR降解。在Vps34敲低細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Vps34^WT完全促進(jìn)EGFR降解，而Vps342KR轉(zhuǎn)染僅部分恢復(fù)EGFR降解（圖6B）。晚期核內(nèi)體標(biāo)志物Rab7和LysoTracker red的共定位顯示Vps34敲低阻斷了晚期核內(nèi)體和預(yù)先存在的溶酶體的融合，Vps34^WT的再表達(dá)挽救了這種表型而不是Vps34^2KR（圖6E和F）。由于不充分的內(nèi)溶酶體融合，我發(fā)現(xiàn)Lampl表達(dá)通過(guò)免疫熒光染色和Western印跡在Vps34敲低的U2OS中增加，但Vps34^WT恢復(fù)了這種表型，并且Vps34脫酰化突變體失去了這種功能（圖6G和H）。這些結(jié)果表明，Vps34乳糖化位點(diǎn)的突變體損害了其生物學(xué)功能，導(dǎo)致溶酶體降解不足。

圖6：Vps34乳酰化促進(jìn)內(nèi)體-溶酶體降解。

7.Vps34的乳酰化在骨骼肌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用

       為了評(píng)估Vps34乳酰化的生理功能，構(gòu)建了強(qiáng)迫游泳小鼠模型，發(fā)現(xiàn)游泳3h不影響總AMPKα、總ULK1、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4的表達(dá)水平游泳誘導(dǎo)AMPKα（Thr172）、總mTOR、ULK1（Ser555）、LDHA（Ser196）的上調(diào)和mTOR（Ser2448）和ULK1（Ser757）的下調(diào)（圖7A和B）。此外，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)小鼠肌肉組織中的乳酸產(chǎn)生，并且該增加被草胺鹽處理部分地減少（圖7B）。骨骼肌生物化學(xué)的評(píng)估顯示，游泳誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，如通過(guò)p62降解的測(cè)量和LC3斑點(diǎn)測(cè)定所確定的，并且值得注意的是，這些表型的獲得被草胺鹽處理部分抑制（圖7C-F）。游泳促進(jìn)Vps34乳糖化并增加PtdIns（3）P水平，并且這些表型被草胺鹽處理部分抑制（圖7C，D和G）。這些結(jié)果表明，通過(guò)ULK1-LDHA途徑的乳酸鹽介導(dǎo)的Vps34乳酸化是骨骼肌穩(wěn)態(tài)所需的。為了獲得Vps34乳酰化參與體內(nèi)自噬和骨骼肌穩(wěn)態(tài)的進(jìn)一步證據(jù)，通過(guò)肌內(nèi)注射用對(duì)照病毒rAAV-Vps34 ^WT或rAAV-Vps34^2KR（1 × 10¹¹ CFU）處理小鼠。病毒注射4周后，每組半數(shù)小鼠進(jìn)行3小時(shí)的急性游泳運(yùn)動(dòng)。結(jié)果顯示，在肌肉中施用Vps 34 ^WT比對(duì)照增強(qiáng)了靜息狀態(tài)和游泳狀態(tài)下的自噬水平，但施用Vps 34^2KR通過(guò)p62降解和LC3轉(zhuǎn)換比Vps 34^WT部分地?fù)p害肌肉自噬水平（圖7H）。透射電子顯微鏡分析顯示，Vps34^WT過(guò)表達(dá)促進(jìn)小鼠肌細(xì)胞在靜息狀態(tài)和游泳狀態(tài)下自噬空泡的形成，但Vps34^2KR降低其作用（圖7I和J）。這些結(jié)果表明Vps34乳酰化是骨骼肌細(xì)胞自噬和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的。

圖7：Vps34的乳酰化在骨骼肌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用

8.Vps34乳糖化與癌癥進(jìn)展相關(guān)

       為了獲得Vps34乳酰化的病理學(xué)功能，分析了人肺癌和胃癌中乳酸和Vps34乳酰化水平之間的關(guān)系。與鄰近組織相比，人肺癌和胃癌中乳酸水平升高（圖8A和E）。此外，與鄰近組織相比，人肺癌和胃癌組織中Vps34乳酰化程度增加，并且這種乳酰化增加伴隨著LDHA表達(dá)的上調(diào)和自噬通量的增加（圖8B，C，F(xiàn)和G）。此外，與鄰近組織相比，人肺癌和胃癌組織中的Vps34激酶活性增強(qiáng)，如用體外PtdIns（3）P水平測(cè)定所測(cè)定的（圖8D和H）。結(jié)果表明，乳酸通過(guò)Vps34乳酰化調(diào)節(jié)腫瘤組織中的自噬活性，并與癌癥進(jìn)展相關(guān)。

圖8：Vps34乳糖化與癌癥進(jìn)展相關(guān)

結(jié)論
       總之，這些結(jié)果表明，絲氨酸/蘇氨酸激酶ULK1通過(guò)磷酸化LDHA在S196，以增強(qiáng)LDHA活性和促進(jìn)乳酸的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)糖酵解途徑。乳酸介導(dǎo)的Vps34乳酰化促進(jìn)其脂質(zhì)激酶活性以促進(jìn)細(xì)胞自噬和內(nèi)溶酶體降解。Vps34乳糖化通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬在運(yùn)動(dòng)和腫瘤進(jìn)展期間的骨骼肌穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。本研究描述了自噬調(diào)控機(jī)制，整合了兩個(gè)高度保守的生命過(guò)程（糖酵解和自噬）。

實(shí)驗(yàn)方法
收集臨床樣本，游泳訓(xùn)練動(dòng)物模型，免疫印跡分析，免疫熒光實(shí)驗(yàn)，質(zhì)譜分析，透射電鏡，自噬分析，LDHA酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)，體外乳酰化測(cè)定，Vps34激酶測(cè)定，PtdIns（3）P ELISA測(cè)定，酶標(biāo)儀檢測(cè)活細(xì)胞中的乳酸鹽和NADH/NAD+，流式細(xì)胞儀測(cè)定活細(xì)胞中的乳酸和NADH/NAD+，PAS染色，PCR
參考文獻(xiàn)
Jia, M., Yue, X., Sun, W., Zhou, Q., Chang, C., Gong, W., Feng, J., Li, X., Zhan, R., Mo, K., Zhang, L., Qian, Y., Sun, Y., Wang, A., Zou, Y., Chen, W., Li, Y., Huang, L., Yang, Y., Zhao, Y., … Cheng, X. (2023). ULK1-mediated metabolic reprogramming regulates Vps34 lipid kinase activity by its lactylation. Science advances, 9(22), eadg4993. https://doi.org/10.1126/sciadv.adg4993