類風濕性關節炎(RA)的特征是滑膜增生和廣泛的血管生成，稱為血管膜形成，這被認為是RA的病理標志。RA患者的纖維原細胞樣的滑膜細胞 (RA-FLSs)分泌各種疾病加重因子。這些因素對RA的發病機制至關重要，因為它們在滑膜炎癥的持續、免疫細胞的化學吸引、新血管的促進、自身抗原的產生和對關節的長期性損傷中起著重要作用。因此，RA-FLSs分泌的各種分子可以作為有用的生物標志物，代表RA的疾病嚴重程度，并可能代表治療靶點。然而，來自RA-FLSs的分泌分子的全局系統概況仍有待澄清。因此，可以將蛋白質組學分析和平行反應監控（PRM）相結合來評估RA-FLS衍生的分泌組，并隨后發現與侵襲性血管翳相關的關鍵分泌蛋白。本文發布于《Annals of the Rheumatoid Arthritis》,IF=27.4。
技術路線

主要研究結果
1、RA-FLSs的分泌組分析
       為了評估RA-FLSs的促炎分泌組，作者培養了從RA患者滑膜組織中分離的FLSs，這些患者未經治療(對照組)或接受腫瘤壞死因子(TNF)α+白細胞介素(IL)-1β治療，模擬RA關節的炎癥狀態(圖1A)。在匯集培養上清后，作者將匯集的樣品分成24個部分，并使用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分析對單個部分進行蛋白質組學分析(圖1A)。使用LC-MS/MS數據集，作者通過使用MS- gf +和UniProt人類參考蛋白質組數據庫(圖1A)進行數據庫搜索，鑒定出843種具有三個以上獨特兄弟肽的RA-FLS分泌蛋白，錯誤發現率<1%。基因本體細胞成分的富集分析表明，843個蛋白中最顯著富集的蛋白位于細胞外區域(747個蛋白)和細胞外囊泡(EVs);597個蛋白)(圖1B)。此外，843種蛋白中有94.3%與人血漿中檢測到的細胞外蛋白或分泌蛋白重疊(圖1C)。總的來說，這些數據支持作者通過LC-MS/MS分析獲得的RA-FLS分泌組的有效性。接下來，作者使用DAVID軟件對基因本體生物過程(Gene Ontology Biological processes, GOBPs)進行富集分析，研究了與RA-FLSs釋放的843種蛋白質相關的細胞過程。RA-FLS分泌組主要與代謝(27.4%)、發育過程(19.2%)、信號轉導(17.4%)、細胞粘附/遷移(15.7%)、細胞增殖(8.7%)和免疫應答(7.0%)相關(圖1D)。值得注意的是，RA-FLS分泌組最強烈地代表了與腸膜形成相關的細胞過程;總體而言，48.5%(409個蛋白)的分泌組與pannus介導的RA病理相關，包括細胞遷移/侵襲(179個蛋白)、細胞外基質組織(177個蛋白)、細胞增殖/凋亡(178個蛋白)、血管生成(46個蛋白)和pannus相關的信號通路(21個蛋白)(圖1E)。此外，與信號轉導相關的RA-FLS分泌組顯著代表了轉化生長因子(TGF)β、骨形態發生蛋白(BMP)、Wnt、RhoA和血管內皮生長因子(VEGF)信號轉導，以及參與免疫反應的信號轉導(核因子κ B、Fc受體和TNF信號轉導)(圖1F)。因此，RA-FLSs分泌組可以提供一個全面的RA-FLSs分泌因子列表，這些因子參與了pannus的形成，而pannus是RA的病理標志。

圖1. RA-FLS分泌組的特征

2、SFs中pannus相關的RA-FLS分泌組的靶向分析
       為了進一步表征RA-FLSs的分泌組譜，作者使用PRM方法進行了靶向蛋白定量，并試圖確定臨床相關性。簡單地說，作者從843個蛋白中選擇了493個參與pannus相關的細胞過程(圖2A)。其中，作者根據前面描述的標準，選擇了151個含有2或3個定量肽的蛋白質，并獲得了高質量的MS/MS譜，然后作者構建了包含151個蛋白質的436個定量肽的MS/MS譜的譜庫(見圖1A, pannus相關分泌組)。為了測試151個蛋白的生物學相關性，作者對SFs(關節中的代表性生物液)中的151個pannus相關分泌蛋白進行了PRM分析，SFs來自RA (n=117)和骨關節炎(n=45，非RA對照)患者，通過關節穿刺獲得。在使用IgY14耗盡柱去除14個豐富的蛋白后，使用PRM分析對單個SF樣品中的151個蛋白進行定量(圖2B)。在至少一個SF樣品中鑒定出對應121個蛋白的277個定量肽的豐度。接下來，作者研究了121種pannus相關分泌蛋白中哪一種與RA的病理嚴重程度相關，包括滑膜增生和血管生成，在SF取樣時通過肌肉骨骼US同時評估;由于US能以無創的方式密切反映關節病變的嚴重程度，因此被廣泛用于RA的研究。因此，作者采用US比較了OA(病理對照)、輕度RA和重度RA三組患者中PRM肽的豐度。根據以下嚴重程度標準(圖2C)，作者發現與OA和輕度RA組相比，DEPs在重度RA組中表達增加:(1) 9個DEPs(膜聯蛋白A1 (ANXA1)， rho GDP解解抑制劑α (ARHGDIA)，環化酶相關肌動蛋白細胞骨架調節蛋白1 (CAP1)，膠原V型α 2鏈(COL5A2)，纖維連接蛋白1 (FN1)，葡萄糖-磷酸異構體酶(GPI)， moesin (MSN)， MYH9和S100鈣結合蛋白A6 (S100A6))，灰色US (GSUS)等級為0和1,GSUS等級為2和3(輕度和重度滑膜肥厚);(2)10個DEPs (ANXA1, CAP1, COL5A2, FN1, GPI, MSN, MYH9, MYH9，帕金森病相關脫糖酶7 (PARK7)， S100A6和超氧化物歧化酶2 (SOD2))在功率多普勒US (PDUS)分級為0與PDUS分級為1-3之間的差異。此外，當活動性滑膜炎被定義為GSUS分級為2或3或PDUS分級為1-3時，與非活動性滑膜炎患者相比，活動性滑膜炎RA樣本中鑒定出9個DEPs (ANXA1、ARHGDIA、CAP1、COL5A2、FN1、GPI、MSN、MYH9和S100A6)(圖2C)。8種典型dep的差異表達反映滑膜肥大、血管擴張和活動性滑膜炎，如圖2D所示。作者還試圖確定121種蛋白與RA炎癥活性的相關性。隨后，通過SF WBC計數≥5000×103 cells/mL與SF WBC <5000×103 cells/mL的比較，作者鑒定了10個DEPs (APOA1、arhdia、CAP1、cofilin 1 (CFL1)、GPI、谷胱甘肽s -轉移酶P1 (GSTP1)、MSN、MYH9、硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶(PRDX3)和S100A9)，并通過血液CRP水平≥0.5 mg/dL與<0.5 mg/dL的比較鑒定了5個DEPs (GPI、GSTP1、MSN、MYH9和S100A9)(圖2E、F)。作者最終選擇了16例dep，這些dep與上述四項RA嚴重程度(基于US)和炎癥活性(基于SF WBC計數和血液CRP水平)中的至少一項密切相關。在16種DEPs中，APOA1、FN1、GPI和S100A9作為自身抗原、炎癥介質、增殖誘導劑或細胞凋亡抑制劑與RA發病有關。此外，已知某些DEPs是由RA-FLSs產生的(GPI和S100A9)，其他DEPs參與RA-FLSs的增殖(MSN)和侵襲(ANXA1和CFL1)，并參與炎癥細胞因子的產生(CAP1)，這表明作者的PRM分析結果與之前的研究結果一致。總的來說，PRM分析鑒定出16個關鍵dep，表明RA的“侵襲性pannus”和“炎癥活性”，隨后被稱為“滑膜細胞分泌組特征”(SSS)。

圖2. pannus相關RA-FLS分泌組蛋白的差異表達

3、鑒定MYH9作為RA-FLSs侵襲性和炎癥活性的新候選指標
       在SSS中，GPI、MYH9和MSN三個蛋白滿足選擇SSS的所有標準(圖3A)。雖然GPI和MSN與RA的發病機制有關，但MYH9在RA中的作用很少被研究。因此，作者決定進一步研究這個新的靶點。作者首先使用ELISA比較了RA和OA sf中的MYH9水平，發現RA sf中的MYH9水平明顯高于OA sf(圖3B)。此外，RA-FLSs產生的主要趨化因子和細胞因子CCL2、IL-6、IL-8、TGFβ和IL-1β的水平，以及RA-FLSs的中樞激活因子TNFα的水平，與RA SFs中MYH9的水平相關(圖3C)。這些發現與作者的PRM分析結果一致，顯示MYH9水平的升高取決于滑膜炎和全身炎癥的嚴重程度(圖2D,F)。類風濕關節炎是一種異質性疾病，涉及多種免疫細胞和細胞過程，其主要病理，盡管存在泛膜形成的共性，但可能因疾病分期和表型而異。作者質疑MYH9表達是否特別反映在優先表現為“侵襲性血管翳”病理的亞組中。因此，作者首先獲得了先前報道的使用152例RA患者滑膜組織生成的大量RNA-seq數據集，并使用正交非負矩陣分解聚類(圖3D)確定了RA的三個主要亞型(Sub1, Sub2和Sub3)。為了進一步表征每種亞型的特征，作者試圖通過使用ConsensusPathDB進行基因集富集分析來定義每種亞型中主要上調基因所代表的主要細胞通路。Sub1主要與細胞增殖相關的細胞通路相關(如圖3E中的細胞周期和G2/M檢查點)，Sub2與細胞代謝相關的通路相關(如圖3E中的丙酮酸、氨基酸和脂質代謝)，Sub3與細胞遷移和侵襲相關的通路相關(如圖3E中的膠原形成、細胞外基質-受體相互作用和TGFβ/BMP/Hippo信號傳導)，表明Sub3是侵襲性腸腺所特有的。值得注意的是，MYH9在Sub3中表達水平最高(圖3F)，這與作者的PRM分析結果一致，表明MYH9與促遷移和促侵襲病理的關系比與其他細胞過程(細胞增殖和代謝)的關系更大。作者進一步分析了從大量RNAseq數據中鑒定的三種亞型滑膜組織中富集的細胞類型。然后，作者通過使用CIBERSORTx對相應的大量RNA-seq數據進行細胞型反褶積，估計了三個亞組的每個滑膜組織中五種細胞類型的比例。作者發現，相對于其他四種免疫細胞類型的比例，Sub3含有高比例的成纖維細胞，與RA-FLSs相對應(圖3G)。這些數據，再加上Sub3中MYH9表達的增加(圖3F)，表明MYH9與RA滑膜中成纖維細胞顯性病理密切相關，這與圖2D的US分析結果一致。

圖3. MYH9作為SSS的重要成員，代表RA-FLSs的侵襲性

4、MYH9在RA患者FLSs和滑膜中的表達
       基于PRM和細胞型反褶積分析，作者驗證了MYH9是否真的在RA-FLSs中表達，是否參與了FLS的遷移和侵襲。正如預期的那樣，基于qPCR分析，MYH9 mRNA在RA-FLSs中表達，并且在促炎細胞因子(包括IL-1β和TGFβ)的刺激下表達增加(圖4A)。經ELISA檢測，IL-1β和TNFα刺激的RA-FLSs分泌MYH9蛋白相似，但TGFβ不分泌MYH9蛋白(圖4B)。作者之前證明，RA-FLSs嚴重暴露于內質網(ER)刺激，如缺氧和促炎刺激。值得注意的是，用內質網應激源tunicamycin治療RA-FLSs，可顯著增加MYH9分泌，而不影響MYH9 mRNA水平(圖4A,B);另一種內質網應激源thapsigargin未能誘導MYH9分泌(圖4B)。有趣的是，TGFβ和IL-6處理并沒有激發RA-FLSs(細胞外)MYH9的分泌(圖4B)，但通過western blot分析，它確實大幅上調了RA-FLSs(細胞內)MYH9的表達(圖4C)。這些數據表明，促炎細胞因子IL-1β和tnf - α以及tunicamin可以誘導RA-FLSs分泌MYH9，并且似乎與其在細胞中的表達水平并不一定相關。RA滑膜細胞不僅由FLSs組成，還包括巨噬細胞樣滑膜細胞(MLSs)。從血液中募集的mls和單核細胞是風濕性關節炎關節慢性炎癥長期存在所必需的。作者發現，LPS處理后，人血源性單核細胞MYH9 mRNA表達和MYH9蛋白分泌均顯著增加(圖4D,E)。TNFα也適度增加單核細胞MYH9 mRNA的表達，但不能像LPS那樣顯著提高MYH9的分泌(圖4D,E)。值得注意的是，培養單核細胞的MYH9分泌量明顯高于RA-FLSs(見圖4B和圖E)。此外，通過western blot分析，LPS、TNFα和IL-1β刺激外周單核細胞顯著增加(細胞內)MYH9表達(圖4F)。這些數據表明，TLR4結扎和促炎細胞因子TNFα和IL-1β可以增加人單核細胞MYH9的分泌和/或表達。免疫組織化學顯示，MYH9在RA滑膜中的表達高于OA滑膜，尤其是在粘膜層和下層白細胞中(圖4G)。免疫熒光染色同樣顯示myh9表達細胞與抗cd55 +和antid68 +細胞明顯共定位，證實了FLSs和MLSs是RA滑膜中主要表達myh9的細胞(圖4H)。總的來說，MYH9在RA滑膜的FLSs和MLSs中表達，并且可以在促炎細胞因子、toll樣受體激動劑(LPS)或內質網應激的刺激下從這些細胞分泌(或排泄)。

圖4. MYH9在RA- FLSs和RA滑膜中的表達

5、MYH9在RA-FLSs遷移和侵襲中的重要作用
       MYH9編碼非肌球蛋白IIA重鏈。由MYH9和MLC組成的非肌球蛋白IIA是細胞粘附和遷移不可缺少的因子。由于FLSs的遷移和侵襲增強是RA的關鍵病理之一，作者研究了MYH9在這些細胞過程中的作用。作者發現，在TNFα和TGFβ處理的RA-FLSs中，MLC磷酸化(非肌肉肌球蛋白可以轉化為活性形式)顯著增加，這表明促炎細胞因子刺激增強了RA-FLSs的myh9依賴性活性(圖5A)。眾所周知，激活的非肌球蛋白IIA通過其頭部結構域與f -肌動蛋白結合。在細胞擴散實驗(圖5B)中，作者發現，在將懸浮的RA-FLSs附著在涂有纖維連接蛋白的玻璃上20min后，MYH9彌散分布在細胞質中，而F-actin主要分布在細胞邊緣，其中肌動蛋白細胞骨架經歷了廣泛的重塑，這是通過F-actin和MYH9的雙重免疫染色確定的。隨著時間的推移，在RA-FLSs在纖維連接蛋白涂層玻璃上孵育60min和120min后，MYH9主要在細胞邊緣被檢測到，并與f -肌動蛋白共定位。此外，在RA-FLSs穩定附著一夜后，大多數MYH9在細胞質中彌散重新分布，但在TGFβ刺激下，一些MYH9分子在細胞邊緣被發現，并與肌動蛋白細胞骨架中的F-actin共定位(圖5C)。總之，這些結果支持了先前的報道，即MYH9活性可以由TGFβ誘導，并與腫瘤細胞中的f -肌動蛋白結合。為了確定MYH9對RA-FLSs遷移和侵襲的影響，作者使用siRNA敲低MYH9(圖6A)。敲除MYH9后，RA-FLS遷移(圖6B)、實時傷口遷移(圖6C)、侵襲(圖6D)均顯著降低。此外，含有板足的RA-FLSs的數量通過MYH9敲低相應減少(圖6E)，板足是眾所周知的亞細胞結構，代表遷移細胞的肌動蛋白重組。與此同時，MYH9缺陷顯著損害了paxillin磷酸化(圖6F)，這是局灶黏附的重要步驟，也是細胞遷移動力學不可或缺的。綜上所述，這些觀察結果以及早期的報告表明，TGFβ刺激可以增加MYH9的活性和表達，從而誘導paxillin的磷酸化以及MYH9與F-actin的結合，最終促進RA-FLSs的粘附、遷移和侵襲。為了進一步研究MYH9在體內RA-FLS侵襲性中的作用，作者建立了SCID小鼠異種移植模型，這是一種人源化滑膜炎模型，在SCID小鼠的左側植入含有RA-FLS的人軟骨，在同一小鼠的右側植入不含RA-FLS的人軟骨。植入MYH9缺陷RA-FLSs的軟骨在同側(左側)和對側(右側)的破壞和降解水平均顯著降低(圖6G)，表明MYH9敲低抑制了RA-FLSs的局部侵襲，并可能延緩RA-FLSs從受影響關節向未受影響軟骨的遠處遷移。體外和體內使用siRNA的研究結果強烈表明，MYH9是調節FLS遷移和侵襲的一個極好的靶點。因此，作者測試了blebbistatin(一種特異性MYH9抑制劑，可抑制非肌球蛋白II的活性)是否能在體內逆轉軟骨破壞，并在體外抑制RA-FLSs的親遷移和親侵襲表型。blebbistatin處理后，RA-FLSs的遷移、侵襲、板壁形成和實時創面遷移均被顯著抑制，體外不影響細胞活力(圖7A-D)，這與MYH9 siRNA敲低實驗結果一致。此外，在SCID小鼠體內人源性滑膜炎模型中，腹腔注射blebbistatin (10 mg/kg，每周兩次)可顯著降低RA-FLSs介導的同側和對側軟骨降解(圖7E)。這些結果表明，blebbistatin抑制了RA-FLSs在同側的局部侵襲，并阻止了它們向未植入RA-FLSs的對側遷移。為了在更復雜的關節炎模型中進一步證實這些發現，除了FLSs外，還有多種免疫細胞參與疾病進展，作者引入了兩種不同的慢性炎性關節炎小鼠模型，包括甲基化牛血清白蛋白(BSA)/ il -1β誘導的關節炎和膠原誘導的關節炎。結果顯示，腹腔注射blebbistatin(每天10 mg/kg)可顯著減少BSA/ il -1β誘導的關節炎小鼠的骨和軟骨破壞，盡管其對受影響關節的炎癥細胞浸潤的影響不大(圖7F);大多數小鼠耐受blebbistatin甚至重復治療，并且沒有明顯的不良反應或毒性，包括血小板減少癥(數據未顯示)。用blebbistatin (10 mg/kg，每周2次)治療的小鼠膠原誘導關節炎的嚴重程度也明顯低于單獨使用vehicle的小鼠。這些數據表明，blebbistatin治療可有效改善多種免疫/炎癥細胞對關節的破壞，并延緩主要由RA-FLSs介導的關節破壞和疾病傳播。綜上所述，這些數據證實了MYH9對于RA-FLSs的遷移和侵襲至關重要，并證明了blebbistatin抑制MYH9在體外和體內成功地抑制了RA-FLSs介導的局部侵襲和軟骨降解。

圖5. TGFβ對MYH9的激活及其與RA-FLSs中F-actin的共定位

圖6. MYH9對RA-FLSs遷移和侵襲的影響

圖7. 非肌球蛋白II特異性抑制劑blebbistatin減少RA-FLSs的遷移和侵襲

結論
       總之，作者的研究為RA-FLSs衍生的分泌組提供了一個全面的資源，可以應用于各種研究，以幫助發現由RA-FLSs分泌的蛋白質介導的病理過程的新調節因子。此外，對RA-FLSs衍生的分泌組進行PRM分析，發現包含SSS的16種分泌蛋白代表了侵襲性輸卵管的病理。類似的PRM分析應該應用于識別RA發病機制中其他過程的關鍵分泌蛋白，包括RA-FLSs的代謝改變、異常增殖和去分化，因為它成功地分類了侵襲性泛膜相關的SSS。最后，作者提出MYH9是一個有希望延緩RA-FLSs異常遷移和侵襲的靶點，也提出了SSS的潛在治療候選物，可以設計詳細的功能實驗。

實驗方法
樣本收集（滑膜液）、評估滑膜炎嚴重程度、細胞活力測定、免疫組化、ELISA、q-PCR、WB、分泌組的蛋白質組學分析、基于RNA-seq數據的RA亞型鑒定、RA-FLS分泌組的PRM分析、滑膜組織免疫熒光染色、Cell-spreading化驗、細胞侵襲遷移實驗、SCID小鼠人源化滑膜炎體內模型
參考文獻
Lee S, Choi E, Chae S, Koh JH, Choi Y, Kim JG, Yoo SA, Hwang D, Kim WU. Identification of MYH9 as a key regulator for synoviocyte migration and invasion through secretome profiling. Ann Rheum Dis. 2023 Aug;82(8):1035-1048. doi: 10.1136/ard-2022-223625. Epub 2023 May 15. PMID: 37188496; PMCID: PMC10359537.