FAT4（FAT非典型鈣粘蛋白4）是鈣粘蛋白相關蛋白家族的一員，已被證明通過抑制增殖和轉移而發揮腫瘤抑制作用。Wnt/β-catenin通路激活與PD - L1相關的腫瘤免疫逃逸高度相關。在這里，作者報告FAT4過表達通過β-catenin依賴的方式抑制PD-L1 N-糖基化和細胞膜定位來調節宮頸癌抗腫瘤免疫的機制。首次在宮頸癌組織和細胞系中檢測到FAT4的表達。通過細胞增殖、克隆形成和免疫熒光測定體外FAT4過表達對腫瘤的抑制作用，并在免疫缺陷和免疫完整小鼠異種移植物中證實這一發現。通過體內和體外功能和機制實驗，作者研究FAT4過表達如何通過β-catenin/STT3/PD-L1軸影響抗腫瘤免疫。FAT4在宮頸癌組織和細胞系中下調。作者確定FAT4與β-catenin結合并拮抗其核定位，通過降解配合物（AXIN1，APC，GSK3β，CK1）促進β-catenin的磷酸化和降解。FAT4過表達在轉錄水平上降低程序性死亡配體1（PD-L1）mRNA的表達，并在翻譯后修飾（PTMs）水平上通過STT3A導致PD-L1異常糖基化，導致其內質網（ER）積累和多泛素化依賴性降解。作者發現，在免疫反應性小鼠模型中，FAT4過表達以β-catenin依賴的方式促進PD-L1異常糖基化和降解，從而增加細胞毒性T淋巴細胞（CTL）活性。這些發現解決Wnt/β-catenin通路在宮頸癌中激活的基礎，并提供針對FAT4/β-catenin/STT3/PD-L1軸的聯合免疫治療方案。本文于2023年9月發表于《Journal of Experiment and Clinical Cancer Research》 IF:11.3期刊上。
技術路線

主要實驗結果
1、FAT4在宮頸癌組織和宮頸癌細胞中下調
       人類FAT4基因編碼4924-aa蛋白，具有細胞外34個Cadherin重復序列，4個EGF樣結構域和2個層粘連蛋白G樣結構域（圖1A）。使用cBioPortal在線工具對TCGA數據庫進行分析并且FAT4在人類腫瘤，尤其是鱗狀細胞癌中經常發生突變或缺失，這意味著FAT4失調是人類實體腫瘤中普遍存在的改變。對宮頸鱗狀細胞癌和宮頸內腺癌（CESC）數據集的進一步分析顯示，腫瘤樣本中的FAT4 mRNA水平顯著低于正常組織（圖1B）。隨后，在12組人宮頸癌組織和子宮頸癌周組織（PT）中檢測FAT4的表達，結果顯示，宮頸癌組織中的FAT4蛋白水平顯著低于癌周組織（圖1C）。為進一步證實這些結果，作者對50例宮頸癌患者和20例正常宮頸標本進行免疫組織化學分析。在正常鱗狀上皮組織和癌旁組織中，細胞質和細胞膜中均可見較強的FAT4免疫信號（圖1D），而在宮頸癌組織中，FAT4低表達（78%對22%，圖1F）。根據免疫組化評分（IRS）將FAT4的表達分為低表達組（IRS≤3）和高表達組（IRS≥4）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，FAT4低表達的宮頸癌患者預后較差（Logrank P=0.0036，圖1G）。本研究還研究FAT4表達與臨床病理特征之間的關系，認為低FAT4表達與侵襲性和轉移性特征有關，包括宮頸浸潤深度、淋巴血管浸潤和局部淋巴結轉移。

圖1 FAT4在宮頸癌中下調并與預后不良相關

2、FAT4過表達抑制宮頸癌細胞和免疫缺陷小鼠的增殖
       已有研究表明FAT4可抑制腫瘤細胞增殖，但其在宮頸癌中的作用尚不清楚。利用免疫熒光和免疫印跡技術檢測6種宮頸癌細胞系中FAT4的表達，在ME180、C33A和U14細胞中FAT4的表達較低，在SiHa、Caski和Hela細胞中表達較高（圖1H），但在上述細胞系中均未觀察到FAT4的細胞膜定位（圖1I）。由于FAT4全長蛋白分子量為543 kDa，作者采用缺陷cas9協同激活介質（dCas9-SAM）技術，利用短向導RNA （sgRNA）靶向FAT4啟動子區，反式作用ME180宮頸癌細胞系，內源性促進FAT4的表達。作為對照，轉染dCas9質粒和非靶向sgRNA序列（CTRL）。同樣的方法促進U14小鼠宮頸癌細胞系中FAT4的內源性過表達（圖2A和B）。由于FAT4是調節細胞粘附的鈣粘蛋白超家族的成員，免疫熒光證實細胞膜上FAT4的表達增加（圖2D），特別是在細胞與細胞接觸的部位，這與FAT原鈣粘蛋白家族對細胞間接觸的調節有關。在ME180和U14宮頸細胞系中，FAT4過表達可顯著抑制細胞增殖和集落形成效率，且具有時間依賴性（圖2C、E和F）。
       在體內研究中，作者選擇sgFAT4單克隆（#H1），并將ME180宮頸癌細胞接種到免疫缺陷（BALB/c裸）小鼠中。與雜亂陰性對照組（CTRL、Cas9質粒和非靶向引導序列）相比，轉染sgFAT4組的腫瘤體積明顯減小（圖2G和H）。此外，與CTRL組相比，sgFAT4組的生存時間更長（圖2I）。作者在小鼠宮頸癌細胞系U14上重復上述實驗，發現過表達FAT4可以抑制腫瘤生長（圖2J和K），延長小鼠生存期（圖2L）。這些數據表明，FAT4過表達抑制免疫缺陷小鼠的腫瘤增殖。

圖2 在體外和體內，FAT4過表達均能抑制宮頸癌的增殖

3、在免疫能力小鼠中，FAT4增加CTL活性并改變腫瘤浸潤淋巴細胞的特征
       直觀地，免疫缺陷BALB/c裸鼠中FAT4過表達可減小腫瘤大小，延長生存期（圖2G-L）。然而，當將sgFat4細胞注射到同基因小鼠（C57BL/6）中時，sgFat4組的腫瘤生長和存活差異比免疫缺陷小鼠更明顯。與CTRL組相比，注射后第3周左右，sgFat4組腫瘤體積明顯縮小（圖3A和B），sgFat4組存活時間比CTRL組延長（圖3C）。此外，在注射sgFat4 U14細胞的同基因小鼠中，腫瘤生長緩慢。令人驚訝的是，注射后第四周左右，腫瘤從注射部位消退，表明FAT4過表達激活抗腫瘤免疫（圖3D）。接下來，作者用免疫熒光證實，sgFat4組中ki67陽性細胞的比例明顯低于CTRL組（圖3E）。
       為研究FAT4過表達激活抗腫瘤免疫的機制，作者在免疫正常的C57BL/6小鼠中構建皮下移植腫瘤，并在腫瘤消退前收集腫瘤進行進一步分析（局部注射后2周，圖3F）。細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）分泌高水平的穿孔素、顆粒酶B （GZMB）和干擾素-γ（IFN-γ），它們是抗腫瘤免疫的主要效應物。作者使用免疫熒光技術評估GZMB的釋放，發現sgFat4組的GZMB⁺區域明顯多于CTRL組（圖3G - I）。由于GZMB在進入腫瘤細胞后靶向caspase-3和裂解caspase誘導凋亡，作者比較裂解caspase-3（CCA3）的水平，在CTRL小鼠的腫瘤組織中只有少數細胞發生凋亡，而在sgFat4小鼠中廣泛觀察到強烈的凋亡聚集信號（圖3J和K）。
       熒光活化細胞分選（FACS）顯示，在sgFat4組中CD8⁺的比例更高（圖4 A和B），CD8⁺CTL活性（CD8⁺ GZMB⁺和CD⁺ IFN-γ⁺）群體顯著更高（圖4 A和D）。同樣地，作者發現CD4⁺CTL釋放GZMB和IFN-γ水平相當高（圖4 C和E）。由于癌細胞通過免疫檢查點抑制CTL活性，作者繼續研究FAT4過表達是否改善PD - L1介導的免疫逃逸。免疫熒光顯示，在sgFat4組中，PD-L1的膜定位明顯降低（圖4F和G）。免疫組化（IHC）也支持上述發現，顯示sgFat4組中CCA3蛋白水平顯著升高，PD-L1蛋白水平顯著降低（圖4H和I）。實時定量PCR （RT-qPCR）證實，Cd274 mRNA水平在sgFat4組中較低（圖4J）。PD-L1表達降低與活化腫瘤浸潤CD8⁺ T細胞顯著增加相關。在本節中，作者證明FAT4過表達阻止免疫缺陷小鼠的腫瘤進展，增加CTL活性，甚至促進C57BL/6免疫活性小鼠的腫瘤退化，這表明完整的免疫系統增強FAT4過表達的抗腫瘤效果。

圖3 體內FAT4過表達促進抗腫瘤免疫

圖4 在免疫反應小鼠模型中，FAT4過表達激活CTL并抑制PD-L1表達

4、FAT4結合β -catenin并促進其在宮頸癌細胞中的降解
       為確定FAT4介導的腫瘤抑制的下游信號通路，作者對C33A和ME180人宮頸癌細胞系的sgFAT4和非靶向sgRNA序列（CTRL）進行RNA測序。根據KGEE富集分析，差異改變主要包括淋巴細胞活化、細胞外基質相關粘附途徑、N-聚糖生物合成和淋巴細胞受體途徑（圖5A）。有證據表明，FAT4同源物原鈣粘蛋白家族FAT1在內皮損傷修復和人腫瘤細胞中與β-catenin結合。但FAT4和β-catenin之間是否存在這種相互作用尚不清楚。作者首先證實在ME180（圖5B）中，FAT4過表達與細胞膜上的β-catenin結合。通過共免疫沉淀證實內源性FAT4在ME180和U14宮頸癌細胞中與β-catenin結合（圖5C）。
       降解復合物（AXIN，GSK3β，CK1α，APC）介導細胞質中β-catenin的磷酸化，促進其泛素化和隨后的蛋白酶體降解。通過免疫沉淀，作者發現FAT4過表達組與CTRL組相比，降解復合物與β-catenin的結合明顯增強（圖5D）。類似地，活性β-catenin的表達顯著降低，這對于β-catenin通過典型Wnt信號介導轉錄活性至關重要。相應地，總β-catenin、磷酸化依賴性GSK3β穩定以及Wnt靶基因MMP9、C-Myc和cyclin D1的表達均被顯著抑制（圖5E）。由于β-catenin的核定位明顯減少，作者使用TOPFlash/FOPFlash熒光素酶報告基因法評估β-catenin的轉錄活性，在sgFAT4組中，β-catenin介導的轉錄明顯減少（圖5F）。這些發現在C57BL/6免疫反應性小鼠移植腫瘤中也得到證實，其中免疫組織化學染色顯示細胞核中活性β-catenin陽性信號顯著減少，同時總β-catenin染色減少（圖5G和H）。這些數據表明FAT4作為Wnt/β-catenin信號的抑制因子，在細胞膜上“捕獲”β-catenin并促進其降解。

圖5 FAT4過表達抑制宮頸癌細胞中Wnt/β-catenin通路

5、FAT4過表達抑制PD?L1表達和細胞膜定位
       Wnt/β-catenin通路被異常激活，促進免疫抑制的腫瘤微環境，同時促進免疫檢查點PD-L1的表達和細胞膜定位，導致T細胞最終衰竭，失去關鍵功能。具體來說，β-catenin穿梭到細胞核，促進CD274和N糖基轉移酶STT3的轉錄，從而促進PD-L1糖基化和ER-高爾基轉運和成熟。
最近的研究表明，PD-L1在腫瘤細胞的膜上高度糖基化，并且PD-L1的N-糖基化，免疫印跡上的分子量約為45 kDa，這對于通過阻斷PD-L1的泛素/蛋白酶體介導的破壞來穩定PD-L1蛋白至關重要。作者發現FAT4過表達降低N-糖基化PD-L1（45 kDa，黑點），而增加非糖基化PD-L1（33 kDa，黑色箭頭，圖6A）。基于體內實驗結果，作者同樣發現FAT4過表達在蛋白和mRNA水平上顯著降低STT3A和PD-L1的表達（圖6A、C和D）。
       由于PD-L1的活性形式定位于細胞膜上，作者試圖證明FAT4如何影響PD-L1的亞細胞定位。免疫熒光證實CTRL PD-L1主要位于細胞膜上（圖6B，白色箭頭），相反，sgFAT4 PD-L1信號在細胞質檢測到（圖6B，紅色箭頭），膜上信號減少。流式細胞術顯示，FAT4過表達顯著降低PD-L1細胞膜表達（圖6E）。作者進一步研究FAT4過表達在體外以β-catenin依賴的方式降低PD-L1的表達。組成型活性β-catenin突變體(active β-catenin)的表達[28]增加PD-L1總蛋白表達和CD274 mRNA表達(圖6F和G)，促進PD-L1糖基化成熟(45 kDa，圖6F)。值得注意的是，活躍的β-catenin表達消除FAT4過表達對CD274 mRNA的抑制作用（圖6G）。這些發現表明，FAT4誘導的β-catenin失活導致腫瘤細胞中PD-L1的下調。在功能上，作者證明細胞膜上PD-L1表達的減少導致PD-1結合的顯著減少（圖6H和I）。總的來說，這些結果表明，FAT4過表達以β-catenin依賴的方式降低癌細胞中PD-L1的水平。

圖6 FAT4過表達抑制PD-L1表達和細胞膜定位

6、FAT4過表達誘導PD - L1異常糖基化并阻止其ER-to-Golgi易位
       內質網（ER）管腔在細胞內運輸過程中膜糖蛋白的特殊糖基化與高爾基轉運密切相關。糖基化的PD-L1增加蛋白質的穩定性，蛋白質的半衰期比未糖基化的PD-L1至少長4倍。接下來，作者進行半衰期分析，正如預期的那樣，PD-L1的半衰期在FAT4過表達的細胞中縮短（圖7A）。PD-L1與高爾基標記物（TGN38）和內質網標記物（Calregulin，CALR）共染色顯示，CTRL而非sgFAT4 PD-L1 與高爾基標記物共定位，sgFAT4而非CTRL PD-L1與內質網標記物共定位（圖7B和C）。這表明FAT4阻斷PD-L1的ER-高爾基轉運，從而誘導PD-L1在內質網中的積累。寡糖轉移酶復合物（OST）催化亞基STT3是PD-L1糖基化和蛋白質穩定所必需的，而β-catenin與轉錄因子TCF7L2結合是誘導STT3A/B轉錄所必需的。糖基化穩定PD-L1并保護PD-L1免受GSK3Β介導的26S蛋白酶體依賴性泛素化降解。正如預期的那樣，在FAT4過表達細胞中，內源性PD-L1泛素化顯著增加（圖7D）。作者發現FAT4過表達降低STT3A-PD-L1相互作用，同時增加GSK3β-PD-L1相互作用，表明FAT4以β-catenin依賴的方式抑制PD-L1的起始糖基化（圖7E）。這些數據表明，FAT4導致內質網中非糖基化的PD-L1經歷GSK3 Β介導的蛋白酶體泛素化降解。

圖7 FAT4過表達誘導PD-L1異常糖基化并阻止其ER-to-Golgi易位

結論
       在本研究中，作者證明FAT4過表達以β-catenin依賴的方式抑制PD-L1轉錄和進一步的糖基化修飾。RNA-seq數據表明，FAT4調控N -聚糖的生物合成。具體來說，FAT4可以通過ER相關的N -糖基轉移酶STT3A引起PD-L1的異常N -鏈糖基化和ER保留，阻止PD-L1轉運到膜上。作者證實FAT4能夠促進GSK3β與PD-L1的相互作用和進一步的泛素化依賴性降解。功能上，通過T細胞介導的癌細胞殺傷實驗和PD-L1/PD-1結合實驗，作者證明FAT4在腫瘤細胞中的過表達通過下調PD-L1水平顯著激活CTL活性。因此，這項研究揭示腫瘤PD-L1調控的分子機制。最后，作者在宮頸癌中發現一個新的FAT4蛋白表達譜，并表明FAT4調節免疫編輯，這表明FAT4/β-catenin/STT3/PD-L1信號軸可能是宮頸癌的潛在靶點。

實驗方法
生物信息學分析；細胞培養；FAT4過表達細胞系的建立；CTL譜的FACS分析；免疫熒光；蛋白提取；WB；共免疫沉淀；T細胞介導的腫瘤細胞殺傷試驗；PD-1和PD-L1結合試驗；免疫組化；Kaplan - Meier生存分析；RNA分離和qRT - PCR；細胞增殖和集落形成；細胞增殖試驗；質粒轉染及熒光素酶活性測定。
參考文獻
Wang D, Wu S, He J, Sun L, Zhu H, Zhang Y, Liu S, Duan X, Wang Y, Xu T. FAT4 overexpression promotes antitumor immunity by regulating the β-catenin/STT3/PD-L1 axis in cervical cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Sep 1;42(1):222. doi: 10.1186/s13046-023-02758-2.

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