結直腸癌（CRC）是一種常見且致命的惡性腫瘤。研究發現，女性結直腸癌（CRC）患者的麥芽香肉桿菌（Carnobacterium maltaromaticum）特異性減少。于是作者團隊在兩種CRC小鼠模型中去驗證C. maltaromaticum是否以雌性特異性的方式減少腸道腫瘤的形成，發現雌激素通過增加結腸中SLC3A2與細菌DD-CPase結合的表達，增加了C. maltaromaticum的附著和定植。另外，通過代謝組學和轉錄組學分析顯示，用C. maltaromaticum灌胃的小鼠，腸道中維生素D相關代謝物的豐度增加，并以腸道微生物組和維生素D受體（VDR）依賴的方式激活了黏膜中的維生素D受體（VDR）信號。通過體外發酵系統證實了C. maltaromaticum糞桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）的代謝性交叉喂養，將C. maltaromaticum產生的7-脫氫膽固醇轉化為維生素D，激活宿主VDR信號。總體而言，C. maltaromaticum以雌激素依賴的方式定植于腸道，并與其他微生物一起增加腸道維生素D的產生，激活宿主VDR以抑制結直腸癌。本篇文章于2023年8月發表在《Cancer Cell》，IF：50.3。

作用機制圖解

技術路線

主要研究成果
1. C.maltaromaticum在結直腸癌糞便樣本中以女性特有的方式被消耗 
       基于532份糞便樣本（270例CRC患者和262例健康對照）的CRC shotgun宏基因組數據集的多隊列分析，作者發現C. maltaromaticum在女性CRC患者中是一種缺失的細菌，但在男性CRC患者中沒有觀察到這種缺失（圖S1A）。在癌癥基因組圖譜（TCGA）隊列中，腫瘤內C. maltaromaticum豐度在女性CRC患者中的預后表現也比男性CRC患者更突出（圖S1B）。因此，C. maltaromaticum的豐度在人類糞便樣本中可檢測到的5733種細菌中排名第803位（圖S1C），表明C. maltaromaticum作為人類腸道微生物群的常見微生物，可能對CRC發揮性別特異性的疾病修飾作用。

圖S1 C. maltaromaticum在結直腸癌患者的糞便樣本中以性別特異性的方式被耗盡

2. C. maltaromaticum在兩種小鼠CRC模型中以雌性特異性方式保護腸道腫瘤發生 
       為了研究C. maltaromaticum是否能以性別特異性的方式發揮抗CRC作用，作者將雌性和雄性Apc^min/+小鼠（種系突變腸道腫瘤發生模型）每天口服200 mL含有1 × 10⁸個菌落形成單位（CFU）的C. maltaromaticum（菌株ATTC B270，除非另有說明）的菌懸液。以相同體積的腦心輸注（BHI）或相同數量的大腸桿菌（菌株mg1655）作為對照，以與C. maltaromaticum相同的方案給予小鼠12周（圖1A和1D）。他們在結腸鏡下觀察到，與BHI或大腸桿菌處理相比，經C. maltaromaticum處理的雌性小鼠的腫瘤大小明顯減小，而雄性小鼠則沒有（圖1B和1E），僅在雌性C. maltaromaticum - Apc^min/+小鼠中觀察到結腸和小腸腫瘤數量和腫瘤負荷的顯著減少，而在雄性小鼠中則沒有（圖1C和1F）。然后作者在致癌物誘導的CRC模型中驗證了C. maltaromaticum抗CRC作用的性別特異性，在C57BL/6雌性和雄性小鼠中注射致癌物偶氮氧甲烷（AOM;10 mg/kg），每周1次，連續6周，然后口服C. maltaromaticum、E. coli或BHI。觀察到C. maltaromaticum具有一致的女性特異性腫瘤抑制作用（圖1G – 1L）。這些結果表明，C. maltaromaticum可能以雌性特異性的方式抑制腸道腫瘤的發生。

圖1 C. maltaromaticum在兩種小鼠CRC模型中以性別特異性的方式保護腸道腫瘤發生

3. C. maltaromaticum以雌激素依賴的方式阻止腸道腫瘤的發生 
       為了確定C. maltaromaticum的雌性特異性抗CRC作用是否依賴于雌激素，作者通過對雌性Apc^min/+小鼠進行卵巢切除術（OVX）建立了雌激素剝奪型CRC模型。小鼠接受OVX或假手術后，每天口服C. maltaromaticum、E. coli或BHI（圖2A和2B）。OVX小鼠陰道涂片檢查顯示白細胞數量增加（圖2C）和血清雌二醇水平降低（圖2D），證實雌激素剝奪成功。在組織采集前，內鏡檢查顯示假手術的OVX小鼠腫瘤大小減小，但經C. maltaromaticum處理的OVX小鼠腫瘤大小沒有減小（圖2E）。與此一致的是，只有在假手術的Apc^min/+小鼠中，用C. maltaromaticum處理后，腫瘤數量和腫瘤負荷才顯著減少（圖2F）。在另一組實驗中，作者對雌性Apc^min/+小鼠進行OVX，但通過補充17β-雌二醇來恢復雌激素水平。
       通過睪丸切除術（ORX）加17β雌二醇給藥鞏固雄性Apc^min/+小鼠的雌性化，（圖2G-2I）。同樣，在接受C. maltaromaticum的雌性化而非假手術的雄性小鼠中，作者在內鏡下觀察到腫瘤大小減小（圖2J）。C. maltaromaticum也僅在雌性化后的雄性Apc^min/+小鼠中觀察到腫瘤數量和腫瘤大小的減少（圖2K）。

4. 雌激素增加結腸SLC3A2的表達，從而增強C. maltaromaticum的附著和腸道定植 
       接下來，作者研究了C. maltaromaticum的性別特異性效應是否由于其在雌性中的優先定植。通過qPCR（圖3A）和熒光原位雜交（FISH）（圖3B）檢測，雌性小鼠或雌性化的雄性小鼠腸道組織中攜帶的C. maltaromaticum比缺乏雌激素的雌性小鼠或雄性小鼠多。進一步給雌性和雄性小鼠（窩仔）灌胃C. maltaromaticum兩周，之后每天收集糞便樣本。即使在最后一次灌胃后的第5天，在雌性小鼠的糞便樣本中也可以檢測到C. maltaromaticum，而在雄性小鼠中，只觀察到C. maltaromaticum在2天內短暫過境。雌性小鼠的結腸組織也比雄性小鼠含有更多的C. maltaromaticum（圖3C）。
       眾所周知，雌激素信號可以調節腸道微生物群。為了研究雌激素對C. maltaromaticum定植的影響，作者采用17β-雌二醇（10 mM）預處理正常的結腸上皮細胞NCM460 24小時，然后進行細菌附著試驗、透射電子顯微鏡（TEM）和活/死細菌染色。觀察到17β-雌二醇顯著增加了C. maltaromaticum對NCM460的附著（圖3D）。為了鑒定介導C. maltaromaticum附著于腸上皮細胞的宿主受體，作者進一步進行了基于生物素的far-Western和pull-down實驗，從NCM460中鑒定出6個蛋白帶，這些蛋白帶被生物素化的C. maltaromaticum表面蛋白持續拉下（圖3E）。結果顯示，女性結腸SLC3A2的表達水平高于男性（圖3F）。SLC3A2的敲低也抑制了C. maltaromaticum對NCM460的附著（圖3G），這些觀察結果表明，作為跨膜糖蛋白的SLC3A2可能是C. maltaromaticum的受體。 

圖2 C.maltaromaticum以雌激素依賴的方式保護腸道腫瘤的發生

       然后作者對雌激素是否可以調節結腸SLC3A2的表達進行了探討。他們用17β-雌二醇（10 mM）預處理NCM460增強了SLC3A2的表達（圖3H）。活/死細菌共染色的免疫熒光證實了SLC3A2和C. maltaromaticum的共定位（圖3I）。C. maltaromaticum對經17β-雌二醇預處理的NCM460的附著也增加（圖3I和3J）。為了檢驗C. maltaromaticum的雌激素介導的附著表型是否僅依賴于SLC3A2，作者通過CRISPR敲除NCM460細胞中的SLC3A2（圖3K），在SLC3A2基因敲除后，17β-雌二醇預處理不能再增加C. maltaromaticum對NCM460的附著（圖3K）。研究結果表明，SLC3A2是介導性別特異性定植表型的主要NCM460表面蛋白。而其他蛋白質，包括含EF-hand結構域蛋白D2和半乳糖凝集素-3，可能以性別無關的方式參與C. maltaromaticum的附著。 

圖3 雌激素增加結腸SLC3A2的表達，從而增強C. maltaromaticum的附著和腸道定植

       于是作者采用免疫沉淀-質譜法鑒定DD-CPase為C. maltaromaticum表面的SLC3A2結合蛋白（圖3L）。此外，通過雙分子熒光互補（BiFC）（圖3M）和ELISA，重組SLC3A2、重組DD-CPase和一種針對DD-CPase的抗體（圖3N），證實了DD-CPase和SLC3A2之間的直接相互作用。總的來說，這些發現表明雌激素通過細菌表面蛋白DD-Cpase增強結腸SLC3A2的表達，促進了C. maltaromaticum的粘膜附著和定植。 
5. 在小鼠CRC模型中，C. maltaromaticum可保護腸道屏障功能并抑制促炎反應
       已知腸道屏障功能障礙和細菌易位可促進結腸腫瘤的發生。在這方面，作者利用AOM/ DSS誘導的CRC小鼠，研究了C. maltaromaticum抑制的腸道腫瘤發生過程中腸道通透性的時間變化，因為這種疾病模型顯示出廣泛的腸道屏障損傷。給C57BL/6小鼠腹腔注射10 mg/kg AOM，然后給予1% DSS，持續1周。然后用C. maltaromaticum處理小鼠。以BHI和大腸桿菌分別作為空白對照和細菌對照。結腸鏡檢查用于監測結腸腫瘤的形成，測定腸道通透性是在多個時間點進行的（從肉眼沒有腫瘤到腫瘤完全發展）。作者觀察到C. maltaromaticum在未觀察到宏觀腫瘤的最早時間點顯著降低了血清FITC-葡聚糖水平（圖4A），表明C. maltaromaticum改善腸道通透性的作用早于抑制腸道腫瘤發生。這一觀察結果與最近的一項研究報道的屏障功能障礙和細菌易位直接促進結直腸癌形成相一致C. maltaromaticum處理過福爾馬林固定的AOM/ DSS誘導的結腸組織中細菌總負荷也有所減少（圖4B），表明細菌滲透上皮細胞的減少與C. maltaromaticum的腫瘤抑制作用有關。此外，C. maltaromaticum灌胃顯著增加了Apc^min/+小鼠結腸緊密連接蛋白TJP1 （ZO-1）、OCLN （Occludin）和CDH1 （E-cadherin）的表達（圖4C）。用C. maltaromaticum灌胃Apc^min/+小鼠血清脂多糖（LPS）水平也顯著降低（圖4D）。透射電鏡和阿利新藍/周期性酸-希夫染色進一步表明，C. maltaromaticm降低了細胞-細胞連接處寬度，增加了含黏液層厚度（圖4E）。同樣，在aom誘導的CRC模型中，C. maltaromaticum的緊密連接基因表達增加（圖4F），黏液層增厚（圖4G）。 

圖4 在小鼠CRC模型中，C. maltaromaticum可保護腸道屏障功能并抑制促炎反應

       腸道屏障的破壞與炎癥有密切的關系。為了進一步揭示C. maltaromaticum改善炎癥反應的作用，作者建立了急性DSS結腸炎模型，6周齡雌性C57BL/6小鼠給予1% DSS處理1周，然后C. maltaromaticum處理3周。作者觀察到，與BHI和大腸桿菌處理的小鼠相比，在結腸鏡檢查下，C. maltaromaticum處理的小鼠結腸炎癥/損傷（粘膜水腫和紅斑）減少，結腸縮短減少，腹瀉（即大便含水量%）明顯改善（圖4H和4I）。此外，使用炎癥反應和自身免疫PCR陣列，觀察到C. maltaromaticm處理小鼠結腸組織中炎癥相關基因的顯著下調以及腸道屏障功能的改善（圖4J）。這些結果表明，C. maltaromaticum在CRC發展過程中可以維持腸道屏障功能，減少粘膜炎癥。
6. C. maltaromaticum通過與其他腸道微生物的代謝交叉喂養來促進腸道維生素D的產生

圖5 C. maltaromaticum通過與其他腸道微生物的代謝交叉喂養來促進腸道維生素D的產生

       
       采用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）對Apc^min/+小鼠糞便代謝產物進行了分析。在C. maltaromaticum處理的小鼠中，腸道代謝物的總體組成發生了顯著的變化（圖5A），與兩個對照組相比，發現19種代謝物富集（圖5A）。在維生素D代謝產物中，1,25-二羥基維生素D3 （1,25（OH）₂VD₃）是活性形式，在CRC抑制中起重要作用。25-羥基維生素D3 （25- OHVD₃）是1,25（OH）₂VD₃的直接前體。通過ELISA檢測，研究發現C. maltaromaticum顯著提高了結腸25- OHVD₃ /1,25（OH）₂VD₃濃度（圖5A）。作者成功驗證了aom誘導的CRC模型的糞便代謝物中維生素D代謝物的富集，包括1,25（OH）₂VD₃ （圖5B）。C. maltaromaticum顯著提高了結腸25- OHVD₃ /1,25（OH）₂VD₃水平（圖5B） 。這些結果表明，C. maltaromaticum增加了結腸組織中維生素d相關代謝物的豐度。 
       為了研究C. maltaromaticum是否直接產生明顯的抗crc作用，作者從Apc^min/+小鼠模型中提取糞便代謝物。與BHI- （BSM）或大腸桿菌灌胃小鼠（ESM）的糞便代謝物相比，C. maltaromaticum灌胃小鼠（CSM）的糞便代謝物顯著抑制結腸癌細胞系（HCT116和DLD1）的活力（圖5C）。對正常上皮細胞系NCM460無抑制作用。然后給AOM誘導的無菌結直腸癌小鼠注射了C. maltaromaticum。由此推測，C. maltaromaticum在無菌小鼠中沒有產生明顯的抗CRC作用（圖5D）。 
       作者對Apc^min/+小鼠糞便樣本進行微生物群分析，以確定C. maltaromaticum是否改變了腸道微生物群組成（圖5E）。已報道具有產butyric acid能力的Faecalibacterium prausnitzii和Lachnispiraceae bacterium在C. maltaromaticum灌胃小鼠體內顯著富集。與之相反的是，條件致病菌，包括Bacteroides vulgatus和Muribaculum testinale則表現出顯著的減少（圖5E）。值得注意的是，具有產butyric acid能力的細菌豐度與1,25（OH）₂VD₃濃度之間存在正相關，這表明C. maltaromaticum可能會調節腸道微生物群以合成維生素D。因此，作者利用體外發酵系統來驗證腸道微生物是否有能力將7-DHC轉化為下游維生素D代謝物。Apc^min/+小鼠模型的糞便樣本在改良的BHI培養基中在好氧和厭氧條件下培養。48 h后，培養的細菌在黑暗中飼喂7-DHC 24 h。然后收集所得培養基進行25-OHVD₃ /1,25（OH）₂VD₃測定。發現C. maltaromaticum灌胃小鼠（CS）的糞便細菌在厭氧條件下（“厭氧CS + 7-DHC”）有效地將刺入的7-DHC轉化為25-OHVD₃ /1,25（OH）₂VD₃。所得到的培養基也強烈抑制結直腸癌細胞的活力（圖5F）。同樣，在有氧條件下，CS沒有增加25- OHVD₃ /1,25（OH）₂VD₃水平，也沒有抑制CRC細胞活力（圖5F）。 
       代謝交叉喂養是指一種微生物產生的代謝物被另一種微生物作為營養物質利用的現象。在這方面，添加（Cm.CM）促進了F. prausnitizii的生長（圖5G），提高了細菌培養基中25- OHVD₃ /1,25（OH）₂VD₃的水平（圖5G）。由此產生的培養基強烈抑制CRC細胞活力（圖5G）。當F. prausnitzii直接喂食7-DHC時，觀察到一致的結果（圖5H）。在無菌小鼠中，C. maltaromaticum、F. prausnitzii或7-DHC單獨不能抑制AOM誘導的結腸腫瘤形成，而C. maltaromaticum或7-DHC與F. prausnitzii聯合使用可恢復抗CRC作用（圖5I） ，表明L. bacterium也參與了與C. maltaromaticum的代謝交叉喂養以抑制CRC，但其作用與F. prausnitzii相比似乎較小。 
7. C. maltaromaticum在兩種小鼠CRC模型中誘導結腸VDR活性
       1,25（OH）₂VD₃通過VDR介導其對結腸細胞的抗增殖作用，VDR是一種核配體依賴性轉錄因子通過RNA測序（RNA-Seq）鑒定的差異表達基因的基因集富集分析（GSEA）顯示，C. maltaromaticum處理的Apc^min/+小鼠結腸組織中VDR信號顯著富集（圖6A）。這一發現在TCGA隊列中得到了驗證，在TCGA隊列中，腫瘤內C. maltaromaticum豐度較高的CRC患者表現出更高的VDR mRNA水平（已知維生素D3以正反饋方式誘導VDR表達26）（圖6B）。因此，RNASeq顯示，20個VDR靶基因在C. maltaromaticum處理的Apc^min/+小鼠中表達上調（圖6C） 。同樣，在C. maltaromaticum處理的Apc^min/+小鼠結腸組織中，VDR上調得到證實（圖6D）。在C. maltaromaticum處理的Apc^min/+小鼠結腸組織中，眾所周知的VDR靶基因CAMP水平升高（圖6D）和VDR核易位（圖6E）進一步證實了VDR的激活。在AOM誘導的CRC模型中證實了C. maltaromaticum對VDR的激活，VDR和CAMP表達增加（圖6F）， VDR核易位增加（圖6G）。這些結果表明，C. maltaromaticum可激活人和小鼠腸道VDR信號。
       隨后，作者檢查了C. maltaromaticum誘導結腸VDR活性是否需要其他腸道微生物。CSM處理的HCT116細胞的RNA-Seq顯示VDR信號和一組VDR靶基因上調（圖6H）。此外，編碼降解1,25（OH）₂VD₃酶的CYP24A1顯著降低，而編碼1,25（OH）2D3生物合成酶之一的CYP2R1升高。CSM在CRC細胞中通過誘導CAMP和VDR核易位進一步證實了VDR活化的增強（圖6I）。此外，在兩種小鼠CRC模型中，暴露于“厭氧CS + 7-DHC”培養基的細胞中，觀察到VDR和CAMP的誘導（圖6J）， VDR核易位的增強（圖6K） ，經（Cm.CM）喂養的F. prausnitzii培養基誘導VDR和CAMP顯著增加（圖6L）。當F. prausnitzii直接飼喂7-DHC時，觀察到一致的結果（圖6M）。

圖6 C. maltaromaticum在兩種小鼠CRC模型中誘導結腸VDR活性

8. C. maltaromaticum抑制CRC的作用需要VDR信號
       作者使用TEI-9647進行VDR抑制，以確定C. maltaromaticum在CRC抑制中的VDR依賴性。TEI-9647 （40 nM）預處理細胞12 h，足以消除1,25（OH） ₂VD₃誘導的VDR mRNA表達（圖S7A）。使用相同的方案，TEI-9647消除了C. maltaromaticum - Apc^min/+小鼠胃灌胃的“厭氧CS + 7-DHC”培養基對CRC細胞增殖的抑制作用以及對VDR和CAMP mRNA的誘導作用（圖7A）。用AOM誘導的CRC模型的糞便發酵系統培養基觀察到一致的結果（圖7B）。此外，我們用TEI-9647 （10 mg/kg，每周兩次）處理Apc^min/+小鼠，然后灌胃BHI、大腸桿菌和C. maltaromaticum。組織收獲前進行小鼠結腸鏡檢查。觀察到，在TEI -9647處理的小鼠中，C. maltaromaticum的抗crc作用消失（圖7C）。C. maltaromaticum也未能誘導結腸Vd表達（圖7D）。為了鞏固C. maltaromaticum抗CRC作用的VDR依賴性，作者使用CRISPR完全敲除CRC細胞中的VDR（圖S7B），發現“厭氧CS + 7-DHC”（圖7E）和“厭氧CS + CM”的抗CRC作用。C. maltaromaticum灌胃Apc^min/+小鼠和AOM誘導的結直腸癌小鼠的CM”（圖7F）培養基在VDR-KO-HCT116和VDR-KO-DLD1細胞中消失。這些數據表明，C. maltaromaticum的抗CRC作用依賴于VDR。

圖7 C. maltaromaticum抑制CRC的作用需要VDR信號

結論：
       這篇項研究揭示了C. maltaromaticum在女性腸道定植和抗CRC作用，這種性別偏向的腸道定植是通過雌激素應答性的結腸SLC3A2介導的。C. maltaromaticum的抗CRC作用依賴于宿主VDR信號的激活，其中C. maltaromaticum給藥后增加的F. prausnitzii直接將C. maltaromaticum衍生的7-DHC轉化為下游維生素D代謝物。綜上所述，C. maltaromaticum可能作為一種基于益生菌的預防女性結直腸癌的藥物，并強調了微生物群性別特異性差異在開發益生菌療法中的重要性。

實驗方法
DNA提取和純化，細胞-細菌條件共培養，shotgun宏基因組分析，代謝組學分析，RNA測序（RNA- seq），逆轉錄定量PCR （RT-qPCR），WB測序，免疫熒光（IF）染色，癌癥基因組圖譜（TCGA）隊列中RNA-Seq數據集的基因表達譜分析，蛋白提取，蛋白裂解物的提取，生物素pull-down實驗，雙分子熒光互補（BiFC）測定，ChIP-qPCR，細菌熒光
參考文獻
Li Q, Chan H, Liu WX, Liu CA, Zhou Y, Huang D, Wang X, Li X, Xie C, Liu WY, Wang XS, Ng SK, Gou H, Zhao LY, Fong W, Jiang L, Lin Y, Zhao G, Bai F, Liu X, Chen H, Zhang L, Wong SH, Chan MTV, Wu WKK, Yu J. Carnobacterium maltaromaticum boosts intestinal vitamin D production to suppress colorectal cancer in female mice. Cancer Cell. 2023 Aug 14; 41（8）:1450-1465.e8. doi: 10.1016/j.ccell.2023.06.011. Epub 2023 Jul 20. PMID: 37478851.