放射耐藥性是肝細胞癌（HCC）放療失敗的罪魁禍首。對HCC中放射耐藥的調控基因和潛在機制的見解有待深入研究。本研究通過RNA-seq和生物信息學分析篩選出細胞因子信號傳導抑制因子2（SOCS2）作為HCC放療的潛在預后預測因子，隨后確定其在體內或體外促進HCC的放射敏感性。同時，測定溶質載體家族7成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）的鐵死亡負調節蛋白、細胞內脂質過氧化和Fe²⁺濃度表明，高水平的鐵死亡有助于HCC的放射增敏。此外，SOCS2和SLC7A11在具有不同放射敏感性的HCC臨床組織和腫瘤異種移植腫瘤中表達相反。在機制上，SLC7A11的N端結構域被SOCS2的SH2結構域特異性識別。而SOCS162-BOX區域的L162和C166可以結合伸長蛋白B/C化合物以共同形成SOCS2/伸長蛋白B/C復合物以募集泛素分子。本文中，SOCS2作為將附著的泛素轉移到SLC7A11的橋梁，促進了K48連接的多泛素化降解SLC7A11，最終導致HCC的鐵死亡和放射增敏的發生。綜上所述，本研究首次證實高表達的SOCS2是通過促進SLC7A11的泛素化降解和促進鐵死亡來預測HCC放射敏感性的生物標志物之一，這表明靶向SOCS2可以提高HCC放療的效率并改善患者的預后。本文于2023年1月發表在《Cell death and differentiation》IF:12.4期刊上。
技術路線

主要實驗結果
1、SOCS2與肝細胞癌的放射敏感性呈負相關
       文章首先由親本HCC細胞系SK-Hep-1和HepG2構建得到兩種放射抗性HCC細胞系SK-Hep-1R和HepG2R，敏感性增強比（SER）分別為1.18和1.25（圖1A）。為確定參與HCC放射抗性的潛在基因，通過RNA-seq分析探索SK-Hep-1和SK-Hep-1R細胞之間的差異mRNA譜，鑒定總共255個mRNA。其中，189個mRNA上調，66個mRNA下調（圖1B）。此外，通過GEPIA和TCGA數據庫的分析發現，與正常肝組織相比，HCC組織中有5856個基因差異表達（圖1C），包括4282個上調基因和1572個下調基因。隨后作者根據GEPIA數據庫將上述差異表達基因（DEGs）與與HCC預后相關的存活基因結合起來，尋找調節HCC放射抗性和預后的DEGs。Venny分析顯示只有兩個基因，SOCS2和SMOX，在這些數據集中同時下調或上調（圖1D）。經檢測，與正常組織和SK-Hep-1細胞相比，HCC組織和放射抗性SK-Hep-1R細胞中的SOCS2基因顯著降低（圖1E），而根據GEPIA數據庫的Kaplan-Meier總生存期（OS）分析顯示，SOCS2的低表達是指HCC患者預后不良（圖1F）。此外，與正常組織和SK-Hep-1細胞相比，HCC組織和SK-Hep-1R細胞中SMOX基因增加（圖1E），升高的SMOX表明HCC患者預后不良。

圖1 SOCS2的過表達與HCC的放射增敏有關

       為進一步證明這兩個基因在肝癌發生和發展中的作用，作者應用HCCDB數據庫進行進一步的分析。發現SOCS2在腫瘤組織中的mRNA表達顯著低于鄰近正常組織（圖1G），表明SOCS2的高表達抑制HCC的發生和進展。SMOX的HCC調節的一致性比SOCS2差，因此后續研究選用SOCS2作為肝癌放射抗性的潛在基因。此外，與正常肝臟樣本相比，HCC IV期SOCS2表達水平低于I，II和III期（圖1H），這與低SOCS2表達患者預后不良的現象一致。為確定SOCS2是否直接介導放療后HCC的預后，該研究通過免疫熒光對放射敏感性肝癌患者（HCC-S）和放射抗性肝癌患者（HCC-R）的腫瘤組織中SOCS2的表達水平進行檢測，發現放射抗性組織的SOCS2表達較低（圖1I）。總之，這些結果表明SOCS2可能作為一種抑癌基因來抑制肝癌的進展和放射抗性。
2、過表達SOCS2能提高HCC的體內外放射敏感性
       接下來，作者檢測SOCS2與肝癌細胞放射敏感性的關系。WB分析表明SOCS2在SK-Hep-1，SK-Hep-1R，HepG2和HepG2R細胞中有序下降（圖2A），與它們的放射敏感性一致（圖1A）。為闡明SOCS2的功能，用lvSOCS2或siSOCS2轉染HCC細胞以有效地增強或減少SOCS2的表達（圖2B，C）。過表達SOCS2降低SK-Hep-1和HepG2細胞的抗輻射能力，SER分別為1.11和1.16（圖2D）。相反，敲除SOCS2增加了HCC細胞的抗輻射能力，SER分別為0.86和0.89（圖2E）。
       為研究是否可以在體內觀察到同樣的現象，作者對小鼠進行異種移植腫瘤實驗，發現放射（irradiation，IR）會引起腫瘤體積的減少，且在SK-Hep-1中比在SK-Hep-1R細胞中更明顯（圖2F，H），而過表達SOCS2會導致IR后腫瘤體積進一步減少（圖2G，I）。
       由于已有研究表明輻射會誘導鐵死亡，所以作者進一步研究鐵死亡是否在腫瘤的放射敏感性中起作用。鐵死亡的特征是細胞毒性脂質過氧化物的積累。鐵死亡及其調節蛋白，如谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）、溶質載體家族7成員11（SLC7A11）和P53在肝癌中起關鍵作用。免疫組織化學（IHC）檢測未照射和IR后12h異種移植腫瘤中SOCS2和鐵死亡蛋白的表達，發現IR增加SOCS2和鐵死亡標記物（4-HNE）的表達，但抑制GPX4和SLC7A11的表達（圖2J）。此外，過表達SOCS2的異種移植腫瘤中GPX4和SLC7A11表達量降低，而4-HNE表達量升高（圖2J）。這些結果表明輻射誘導與過表達SOCS2都能出現鐵死亡。證明SOCS2可能通過誘導鐵死亡而促進HCC的放射增敏作用。

圖2 過表達SOCS2提高HCC的體內外放射敏感性

3、鐵死亡促進HCC組織和細胞的放射增敏作用
       為進一步驗證上述推測，作者通過免疫熒光分析GPX4和SLC7A11在HCC臨床組織中的表達，發現放射敏感組織GPX4和SLC7A11表達水平更低，表明具有更高水平的鐵死亡（圖3A）。接著WB檢測HCC細胞中GPX4和SLC7A11的表達水平，同樣發現GPX4和SLC7A11表達隨著細胞對IR的抗性而增強（圖3B）。接下來，liperfluo（脂質過氧化物熒光探針）免疫熒光結果顯示，氫過氧化物脂質水平隨著HCC放射敏感性增加，且IR后升高（圖3C，D）。這些結果提示放射抗性HCC細胞具有較低的鐵死亡水平。

圖3增強的鐵濃度導致HCC的放射增敏作用

       
       為進一步檢測鐵死亡是否進行HCC放射增敏，該研究使用RSL3（GPX4的抑制劑）促進鐵死亡的產生，WB檢測發現RSL3處理后SK-Hep-1和HepG2細胞的放射敏感性增加（圖3E），而用RSL3處理siSOCS2轉染的HCC細胞后，放射增敏作用隨GPX4表達下降而降低（圖3F，G，H，I）。總之，鐵死亡有助于HCC細胞的放射增敏作用，而RSL3誘導的鐵死亡可以逆轉SOCS2抑制后獲得的放射抗性。
4、SOCS2與鐵死亡正相關
       由于鐵死亡和SOCS2都有助于HCC的放射增敏，而圖2J暗示SOCS2促進鐵死亡，因此作者試圖深入探討SOCS2與鐵死亡之間的關系。通過檢測IR 0~24h內HCC細胞中SOCS2和GPX4的蛋白表達水平變化，發現與未照射的細胞相比，在IR后24小時內SOCS2增加，而GPX4減少，在4小時內變化最明顯（圖4A）。接下來測量未照射或IR后4小時細胞中的蛋白質表達，發現與GPX4和SLC7A11表達相反，SOCS2表達量隨著放射抗性的增加而下降（圖4B）。此外，無論在未照射和IR的細胞中，過表達SOCS2都會抑制GPX4和SLC7A11的表達（圖4C，D）。
       上述結果表明SOCS2在蛋白質水平上促進鐵死亡的發生，因此該研究進一步探討SOCS2與鐵死亡的特征表型：細胞內Fe²⁺含量和脂質過氧化物之間的關系。通過檢測過表達SOCS2的HCC細胞中脂氟的相對熒光強度，發現SOCS2的增加促進細胞質脂質過氧化物在HCC細胞中的積累，在IR后更為明顯（圖4E，F）。廣泛而言，SOCS2抑制GPX4和SLC7A11的表達，并誘導脂質過氧化物和Fe²⁺的積累，促進鐵死亡。

圖4 SOCS2促進肝癌細胞鐵死亡

5、SOCS2通過泛素化降解SLC7A11
       為研究SOCS2如何介導鐵濃縮從而調節HCC放射敏感性，通過免疫熒光染色發現SOCS2的熒光密度與SLC7A11相反，表明SOCS2與SLC7A11呈負相關（圖5A）。接著通過Co-IP證明SLC7A11與SOCS2相互作用（圖5B，C）。為了解這種相互作用的功能后果，作者想知道SOCS2是否可以負調節SLC7A11的表達或誘導其降解。WB檢測發現在SOCS2過表達后，SLC7A11的穩態水平顯著降低，并且SLC7A11的半衰期大大縮短（圖5D，E）。說明SOCS2通過蛋白質方面而不是轉錄方面促進SLC7A11的降解。

圖5 SOCS2與 SLC7A11相互作用，并通過泛素-蛋白酶體途徑降低其水平

       接下來，為深入研究SLC7A11降解的機制，作者在HCC細胞中加入蛋白酶體抑制劑（MG-132）和溶酶體抑制劑（亮肽蛋白）。盡管高表達的SOCS2可以降低SLC7A11的蛋白質水平，但是這種下調通過MG-132的處理被逆轉，而亮肽蛋白不能逆轉（圖5F，G），表明SOCS2誘導的SLC7A11下降依賴于蛋白酶體途徑而非溶酶體途徑。
       由于SOCS2作為一種E3泛素連接酶，作者推測SLC7A11可能被SOCS2特異性識別并經歷泛素化降解。WB分析顯示SK-hep-1細胞中的泛素化SLC7A11水平顯著高于HepG2細胞（圖5H）。此外，在過表達SOCS2的HCC細胞中，SLC7A11表達量顯著降低，并且SLC7A11泛素化水平更高（圖5I）。
6、SOCS2的SH2結構域與SLC7A11的N-末端結構域相互作用促進放射增敏
       為闡明SOCS2和SLC7A11之間的相互作用區域，作者將SOCS2分為三個結構域：NTD，SH2-結構和CTD，構建C-末端具有3×Flag標簽的三個截短質粒（質粒A，B，C）和完整SOCS2序列的野生型（WT）質粒，并將這些質粒轉染到HCC細胞中（圖6A）。Co-IP分析顯示只有WT和B（SH2截短）的通道表現出SLC7A11條帶，表明SLC7A11與SOCS2的SH2結構域相互作用（圖6B）。隨后，為研究SOCS2-SH2結構域對泛素化水平的影響，作者通過從SOCS2全序列中刪除SH2結構域來產生SOCS2-ΔSH2質粒，發現SOCS2-ΔSH2突變體不能增加SLC7A11的泛素化水平，而SOCS2-WT質粒顯著增加SLC7A11的泛素化水平（圖6C）。因此，SOCS2通過SOCS2的SH2結構域誘導SLC7A11泛素化。
       此外，為鑒定與SOCS2相互作用的SLC7A11的結構域，作者還基于SLC7A11的結構域建立三個截斷質粒A，B，C（圖6D），發現SOCS2與SLC7A11的NTD相互作用（圖6E）。與SOCS2-ΔSH2質粒的構建一致，作者還構建無N-末端的SLC7A11-ΔNTD突變質粒，發現Flag-ΔNTD的泛素化水平檢測不到，而WT組中仍存在高水平的泛素化Flag-SLC7A11（圖6F）。表明SLC7A11-NTD與SOCS2相互作用并因此介導其自身的泛素化。此外，將SOCS2-ΔSH2或SOCS2-WT質粒轉染HCC細胞后觀察IR后存活數，發現SOCS2-ΔSH2組的存活數與其陰性對照相比沒有顯著差異，但顯著高于SOCS2-WT組（圖6G，H），這意味著SOCS2由于其SH2結構域在HCC細胞中發揮放射增敏作用。

圖6 SOCS2-SH2結構域與SLC7A11的N-末端結構域相互作用以降低輻射抗性

7、SOCS2促進SLC7A11的K48相關多聚泛素化并結合伸長蛋白B/C
       確定SOCS2-SH2能通過識別SLC7A11-NTD介導SLC7A11泛素化后，作者想知道SLC7A11中發生的多聚泛素化的類型。到目前為止，K48和K63連接的鏈已被報道為最豐富和功能表征良好的多泛素鏈。為確定其中哪些存在于多泛素化的SLC7A11中，構建SLC7A11的K48R和K63R泛素突變體，泛素化測定K48R突變體泛素化積累減少，而K63R突變體泛素化積累不變（圖7A），這意味著SLC7A11多泛素化主要以K48連接的泛素鏈而不是K63連接的形式產生。值得注意的是，K48R突變降低SLC7A11多聚泛素化的水平，但沒有完全降低，暗示其他連鎖類型也可能有助于這種多聚泛素化。

圖7 SOCS2通過延伸蛋白B/C泛素復合物介導K48連接的多聚泛素化鏈到SLC7A11上

       如前所述，SOCS1和SOCS6通常通過SOCS-BOX區域與伸長蛋白B/C結合以組裝成E3泛素連接酶復合物介導泛素化，所以作者探究HCC細胞中SOCS2介導的SLC7A11泛素化是否也需要伸長蛋白B/C的參與。WB檢測顯示在HCC細胞中敲低伸長蛋白B/C不影響SOCS2表達，但是SLC7A11表達量升高（圖7B），表明延伸蛋白B/C復合物是SOCS2介導的SLC7A11的泛素化降解所必需的。
       接下來研究SOCS2與伸長蛋白B/C復合物相互作用的氨基酸位點。通過比較不同物種SOCS1、SOCS2、SOCS6和SAB15蛋白SOCS2-BOX區的氨基酸序列，發現只有Leu和Cys在不同的序列中保守（圖7C）。因此，作者假設Leu和Cys可能是SOCS2與伸長蛋白B/C相互作用的靶位點。為驗證這一猜想，該研究構建SOCS2突變質粒（SOCS2^LC→PP），其中SOCS2的Leu 162（L162）和Cys 166（C166）突變為Pro，SOCS2^WT質粒作為對照（圖7D）。Co-IP顯示SOCS2^WT可以與SLC7A11，伸長蛋白B和伸長蛋白C分別互作，而SOCS2^LC→PP僅與SLC7A11互作，不與伸長蛋白B和伸長蛋白C互作（圖7E）。此外，SOCS2^LC→PP也導致SLC7A11泛素化降低（圖7F），意味著伸長蛋白B/C在L162和C166位點與SOCS2互作以形成SOCS2/伸長蛋白B/C復合物，從而共同促進SLC7A11的泛素化降解。
       總而言之，本研究詳細研究SOCS2介導的HCC放射增敏促進鐵死亡的過程。IR增加SOCS2表達，導致SLC7A11的減少，隨后SOCS2-SH2與SLC7A11-NTD特異性識別，通過SOCS2的L162和C166位點與伸長蛋白B/C結合，并與E2泛素結合酶連接，誘導多聚泛素化（圖8A，B）。最終，具有泛素鏈的SLC7A11被26S蛋白酶體識別并分解成蛋白質片段（圖8C）用于降解，這最終有助于HCC鐵死亡和放射增敏的發生。

圖8 增量SOCS2促進SLC7A11的泛素化降解，誘導HCC的鐵死亡和放射增敏作用

實驗方法
RNA-seq和測序分析，小鼠異種植腫瘤模型，免疫熒光（IF）檢測，免疫組織化學（IHC）檢測，WB，細胞內Fe²⁺的含量測定，細胞內脂質過氧化的測量，qRT-PCR，小干擾RNA（siRNA）轉染，質粒轉染，Co-IP，泛素化測定
參考文獻
Chen Q, Zheng W, Guan J, Liu H, Dan Y, Zhu L, Song Y, Zhou Y, Zhao X, Zhang Y, Bai Y, Pan Y, Zhang J, Shao C. SOCS2-enhanced ubiquitination of SLC7A11 promotes ferroptosis and radiosensitization in hepatocellular carcinoma. Cell Death Differ. 2023 Jan;30（1）:137-151. doi: 10.1038/s41418-022-01051-7.

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