結直腸癌（CRC）是癌癥相關死亡的第三大原因，大多數（>80%）CRC是由腫瘤抑制因子APC的功能喪失（LOF）突變驅動的，導致典型WNT途徑效應因子β-連環蛋白的組成性激活。本文通過在對APC失活的結腸類器官進行轉錄組分析，并將基因表達變化與幾種結腸癌小鼠模型（包括炎癥誘導的CRC模型）的轉錄組進行了交叉參考，發現了棕櫚油酰-β蛋白羧酸酯酶（Notum）在APC損失時被急性誘導并且在這些模型中保持升高，采用體外測定、體內內窺鏡引導的原位類器官植入測定和轉錄組學分析來表征Notum活性的作用。發現了靶向細胞外酶Notum的單一藥劑在治療臨床前小鼠模型和人類類器官中的高度侵襲性轉移性腺癌中的重要作用。本文于2023年8月17日發表于《gut》上，IF=24.5。

技術路線

主要研究內容

1.進展期結直腸腺癌中NOTUM的致癌活性

       在APC失活后的結腸類器官進行了轉錄組分析，并對幾種結腸癌小鼠模型的轉錄組進行了交叉參考基因表達變化（圖1A）。在這些模型中表達在APC損失時被急性誘導并且保持升高的大約150個基因中，棕櫚油酰基-α蛋白羧酸酯酶Notum脫穎而出，因為它先前涉及腺瘤形成的起始。在小鼠腫瘤中證實了Notum的高表達，其中其表達限于上皮/腫瘤細胞（圖1B）。還證實了Notum對體內結腸上皮中急性遺傳消融Apc或β-連環蛋白激活的強烈激活。此外，相對于正常組織，在人癌癥基因組Atlas 3中的結腸癌和直腸癌（分別為TCGA結腸腺癌（COAD）和直腸腺癌（READ））中NOTUM表達顯著升高（圖1C）。同時，也檢查了原代人COAD 的單細胞轉錄組譜，并證實NOTUM表達主要限于癌細胞，并且幾乎完全不存在于腫瘤微環境中（圖1D）。最初評估了NOTUM在具有侵襲性和轉移能力的COAD小鼠模型中的功能：在引入靶向Notum的gRNA時，類腫瘤培養物生長較慢，并且具有顯著降低的克隆類腫瘤接種效率（單細胞接種新類腫瘤的能力，代表腫瘤啟動能力）（圖1E-H）。為了測試NOTUM在體內是否具有相似的致癌活性，用APKS類腫瘤和NOTUM LOF進行了皮下和原位腫瘤形成測定。這些測定揭示了NOTUM LOF導致原發性腫瘤生長的顯著降低，并且在原位模型中，肝臟中的大轉移的完全阻斷（圖1 I、J）。這些結果揭示了NOTUM在CRC中的致癌活性。

圖1：進展期結直腸腺癌中NOTUM的致癌活性

2.NOTUM維持對APC失活的腫瘤抑制活性

       通過CRISPR/Cas9在大量野生型結腸類器官培養中的NOTUM LOF導致克隆類器官接種效率、類器官生長和β-連環蛋白靶基因表達的顯著增加（圖2A-C），并且NOTUM過表達具有相反的作用（圖2D、E），表明NOTUM負調節正常腸干細胞區室中的經典WNT途徑。在具有由CRISPR/ Cas9（ApcΔ）引入的失活Apc突變的腺瘤類腫瘤中進行了類似的實驗。值得注意的是，ApcΔ 類腫瘤中的NOTUM GOF導致克隆接種效率和增殖降低，并且NOTUM LOF具有相反的作用（圖2F-K）。因此，想要探討NOTUM丟失如何影響ApcΔ類腫瘤在體內的發生。內窺鏡引導的ApcΔ腫瘤樣細胞原位植入證實，NOTUM在不存在APC功能的情況下保留了有效的腫瘤抑制活性，ApcΔ腫瘤樣細胞僅在結腸上皮中形成小腺瘤。相比之下，NOTUM的丟失顯著增加原發性腫瘤大小并促進轉移（圖2L-N）。因此，NOTUM在APC失活驅動的腺瘤性病變中保留了有效的腫瘤抑制活性。

圖2：NOTUM在正常和APC突變小鼠結腸類腫瘤中具有強效的腫瘤抑制活性

3.NOTUM的新的腫瘤抑制和致癌功能需要細胞外酶活性

       由于在ApcΔ類腫瘤和更具侵襲性的AP/APK/APKS類腫瘤中的發現基于哺乳動物中NOTUM功能模型是出乎意料的，因此接下來測試了NOTUM在Apc Δ類腫瘤中的腫瘤抑制活性和AP/APK/APKS類腫瘤中的致癌活性是否需要酶活性。我們在小鼠Apc Δ類腫瘤中過表達野生型或催化死亡（S239 A）NOTUM，并且發現NOTUM S239A不能抑制增殖和克隆接種效率（圖3A-C ）。相反的，在亞純型APKS亞克隆中過表達野生型和S239A NOTUM，并且發現，雖然野生型NOTUM增加類腫瘤接種效率和增殖，但催化死亡的NOTUM沒有增加（圖3D-F）。因此，催化活性對于NOTUM在ApcΔ類腫瘤中的腫瘤抑制活性和APKS類腫瘤中的致癌活性都是必需的。在Notum亞型APKS類腫瘤中用mCherry標記一半的培養物，另一半用表達GFP和NOTUM或僅表達GFP的載體標記。與ApcΔ類腫瘤一樣，我們發現GFP+，NOTUM過表達細胞能夠驅動mCherry+細胞非-細胞自主增殖，以及GFP+APKS細胞的細胞-細胞自主增殖（圖3G，H）。因此得出結論，NOTUM的新致癌活性需要催化活性，并發生在細胞外。

圖3：NOTUM的腫瘤抑制和致癌功能需要催化活性

4.Apc和Trp53失活協同賦予NOTUM致癌活性

       已經確定NOTUM酶活性在野生型和Apc?類腫瘤中具有腫瘤抑制性，并且在AP/APK/APKS類腫瘤中具有致癌性，因此推斷基因開關必須是NOTUM功能逆轉的基礎，并且P53失活可能是原因。Notum表達在Apc失活時強烈上調，并且在致癌Trp53、Kras和Smad 4突變積累時保持升高（圖4A）。相比之下，單獨失活Trp53對Notum表達幾乎沒有影響。通過測定Notum LOF和GOF在Apc?、Trp53?和AP類腫瘤中的作用，并且顯著地發現，在Apc?和Trp53?類腫瘤中，NOTUM活性保持腫瘤抑制性，但是這些突變一起協同作用以賦予NOTUM致癌活性（圖4B-F）。通過收集來自COAD和來自TCGA的READ的患者數據，并基于具有APC突變但野生型TP53的患者或攜帶APC和TP53突變的患者中的NOTUM表達對患者無疾病生存期進行分層。與實驗發現一致，高NOTUM表達預測僅在TP53突變型腫瘤中無疾病存活的顯著降低，而在TP53野生型腫瘤中無疾病存活的顯著降低（圖4G）。為了描繪NOTUM的腫瘤抑制性到致癌轉換的分子機制，進行了具有或不具有NOTUM LOF的ApcΔ和AP培養物的轉錄組譜分析（圖4 H）。在ApcΔ和AP突變體培養物之間受NOTUM LOF影響的通路包括mTORC1和E2F信號傳導（在ApcΔ中由NOTUM LOF誘導，而不是AP）、干擾素α/γ信號傳導（在AP中由NOTUM LOF誘導，在AP中抑制）和TGF β（在AP中由NOTUM LOF誘導，而不是在Apc Δ中由NOTUM LOF誘導）（圖4 I）。總之，這些結果表明了Apc和Trp53失活協同賦予NOTUM致癌活性。

圖4：APC和P53丟失協同作用將NOTUM從腫瘤抑制因子轉化為癌蛋白

5.NOTUM的腫瘤抑制功能與致癌功能可以通過GPC活性差異來解釋

       為了探究磷脂酰肌醇蛋白聚糖Gpc 1/4基因失活是否會影響表型NOTUM活性。GPC4僅在AP類腫瘤中顯示腫瘤抑制活性，在Apc Δ類腫瘤中沒有作用（圖5A-B）。表達低但可檢測的Gpc 6在任一基因型中幾乎沒有影響或沒有影響（圖5A-B）。為了將NOTUM功能、GPC蛋白和信號傳導通路活性聯系起來，敲低了小鼠ApcΔ和AP類腫瘤中的Notum，并檢查通路活性和細胞相關的GPC蛋白水平。Apc Δ 類腫瘤中的Notum敲低導致mTORC1信號傳導增加，與GPC1蛋白的積累偶聯，對TGF β途徑活性沒有明顯變化（圖5C）。相比之下，AP類腫瘤中Notum敲低導致TGF β途徑活性增加和GPC4蛋白積累，而對mTORC1活性沒有明顯影響（圖5D）。這些實驗測定了全細胞裂解物中的GPC蛋白水平，并支持一種模型，其中Notum LOF阻止GPC從細胞表面切割導致其積累。為了進一步探索這種可能性，檢測了Notum抑制后Apc Δ和AP類腫瘤的培養基上清液中游離N-β末端GPC1和GPC4的水平。相對于上清液中的GPC1，ApcΔ類腫瘤中的NOTUM LOF增加了細胞相關GPC1（圖5E）。相反，AP類腫瘤中的Notum LOF導致細胞相關GPC4增加，同時上清液中GPC4減少（圖5E）。有趣的是，NOTUM蛋白本身與細胞裂解物而不是上清液相關聯，這一發現與NOTUM建立的胞外酶促作用相結合，表明NOTUM與胞外細胞表面物理相關聯（圖5E）。為了進一步測試GPC操作的效果是否與NOTUM分別從Apc Δ和AP類腫瘤表面切割GPC1和4一致，分析了GPC失活對受NOTUM活性差異影響的途徑的影響。事實上，小鼠Apc?類腫瘤中的GPC 1失活抑制mTORC1活性，小鼠AP類腫瘤中的GPC 4失活抑制TGF β活性，與NOTUM操作的效果一致（圖5F-G）。最后，為了確認GPC1或GPC4和受影響的信號轉導途徑上游的受體之間的直接相互作用。GPC1在Apc Δ類腫瘤中的免疫沉淀共免疫沉淀IGF1Rβ，一種與結腸癌和化療耐藥性有關的mTORC 1活化上游的IGF受體（圖5 H）。在AP類腫瘤中，GPC4的免疫共沉淀TGF β通路上游的TGFβR1（圖5I）。添加小分子NOTUM抑制劑ABC 99似乎增強了這些相互作用（圖5 H-I）。因此，研究了NOTUM對通過TAK1-p38 a信號轉導介導的非典型TGFβ途徑活性的影響。與在AP類腫瘤中的發現一致，NOTUM抑制導致APKS細胞裂解物中GPC4增加（圖5 J）。進一步與NOTUM作為TGFβ信號傳導負調節劑的作用一致，APKS類腫瘤中的Notum抑制導致TGFβ活化激酶（TAK 1）的磷酸化和下游p38a磷酸化增加（圖5 J）。觀察到AP和APKS類腫瘤中的p38a抑制增加增殖并抑制細胞死亡（圖5 K）。這些發現支持了NOTUM可能在腺癌中發揮致癌作用的觀點，至少部分是通過抑制非α經典TGFβ途徑的腫瘤抑制活性。

圖5：磷脂酰肌醇蛋白聚糖介導Apc突變體與Apc/Trp 53突變體小鼠類腫瘤中NOTUM活性的差異效應

6.藥理學NOTUM抑制在轉移性結腸癌的臨床前動物模型中有效

       最初證實ABC99處理表型模仿了Apc?和APKS類腫瘤中NOTUM的遺傳抑制（圖6A和B）。接下來，將APKS類瘤通過內窺鏡引導的注射將原位植入到同系小鼠的結腸粘膜中，并允許腫瘤移植并生長1個月，之后將小鼠隨機分配至媒介物對照或ABC 99組。然后用ABC 99或媒介物對照再處理小鼠4周。ABC 99治療在很大程度上阻止了原發性腫瘤生長，BLI和腫瘤重量相對于對照動物顯著降低（圖6C-E）。值得注意的是，NOTUM抑制幾乎完全抑制了該高度侵襲性CRC模型中的肝臟和淋巴結轉移（圖6 F和G），并且ABC 99-γ處理的原發性和罕見轉移性病變在實驗結束時表現出顯著的細胞增殖抑制（圖6 H）。構建了另一組具有原位APKS腫瘤的小鼠，如前所述允許它們移植1個月，然后開始ABC99或媒介物對照治療并監測存活長達4個月。值得注意的是，雖然媒介物對照組-β處理的小鼠在該時間過程中變得垂死，但ABC99-β處理的組在該實驗的持續時間內均未死于疾病（圖6 I）。

圖6：NOTUM的小分子抑制劑抑制結直腸癌小鼠模型中的腫瘤生長和轉移

結論
       本研究發現了NOTUM在APC缺失腺瘤中保留腫瘤抑制活性，另外，在進展為腺癌伴P53丟失時，NOTUM成為專性癌基因。這些表型是不依賴于Wnt-β的，分別由NOTUM在早期階段與晚期階段疾病中對Gpc1和4的不同活性引起。最終，臨床前小鼠模型和人類器官培養物證明，NOTUM的藥理學抑制在阻止原發性腺癌生長和抑制遠端器官的轉移性定殖方面是高度有效的。因此，靶向細胞外酶NOTUM的單一藥物在治療臨床前小鼠模型和人類類器官中的高度侵襲性轉移性腺癌中是有效的，這使得NOTUM及其磷脂酰肌醇聚糖靶向晚期CRC中的治療弱點。

實驗方法
構建正常和腫瘤類器官，AOM/DSS結直腸癌模型，ApcMin/+小鼠模型，單細胞轉錄組測序，原位移植瘤模型，原發腫瘤模型，Westernblot，MTT增殖實驗，慢病毒感染，免疫熒光實驗，流式細胞術，免疫共沉淀實驗，生物發光成像實驗，生存分析。
參考文獻
Tian, Y., Wang, X., Cramer, Z., Rhoades, J., Estep, K. N., Ma, X., Adams-Tzivelekidis, S., Katona, B. W., Johnson, F. B., Yu, Z., Blanco, M. A., Lengner, C. J., & Li, N. (2023). APC and P53 mutations synergise to create a therapeutic vulnerability to NOTUM inhibition in advanced colorectal cancer. Gut, gutjnl-2022-329140. Advance online publication. https://doi.org/10.1136/gutjnl-2022-329140