結直腸癌（CRC）是世界上最常見的癌癥之一。YTHDF1作為m⁶A閱讀器，可調控m⁶A修飾的mRNA。本研究中，作者闡明了YTHDF1在CRC腫瘤免疫微環境（TIME）中的功能和機制。他們發現YTHDF1通過m⁶A-p65-CXCL1/CXCR2軸促進CRC發展，且靶向YTHDF1聯合抗PD1治療CRC具有良好的療效。該研究于2023年1月發表在《Gut》，IF：24.5。
技術路線

主要研究結果
1. YTHDF1調控CRC患者免疫抑制微環境
       IFN-γ反應可誘導抗腫瘤免疫并且與免疫檢查點阻斷（ICB）治療有關。作者研究發現，在多個m⁶A調節因子中，YTHDF1與IFN-γ相關基因mRNA的表達呈現強烈的負相關（圖1A）。另一方面，CRC組織微陣列（TMA）免疫組化染色結果與TCGA數據分析結果一致，YTHDF1蛋白高表達與CD8⁺ T細胞低浸潤有關（圖1B和1C）。這些數據均表明，YTHDF1與抗腫瘤免疫受損和ICB治療效果降低有關。
       為研究YTHDF1在調節抗腫瘤免疫中的作用，作者利用CRISPR/Cas9敲除MC38（MSI-H-CRC）細胞中的Ythdf1（Ythdf1-KO），并將細胞注射到同系C57BL6小鼠中（圖1D）。他們發現，與對照組（NC）相比，Ythdf1敲除可減少腫瘤體積和重量（圖1E）。關于Ythdf1-KO是否影響TIME，作者從腫瘤中分離出CD45⁺免疫細胞，并進行單細胞RNA-seq（scRNA-seq）（NC:1480個細胞；Ythdf1-KO:1816個細胞）。與NC組相比，Ythdf1-KO腫瘤中的粒細胞樣髓系來源抑制細胞（G-MDSCs）和中性粒細胞顯著減少，而T細胞和NK細胞大量增加（圖1F）。作者進一步將T細胞和NK細胞分為CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、NKT細胞和NK細胞亞群，與對照組相比，它們在Ythdf1-KO腫瘤中同時增加（圖1F）。通過檢測MDSCs功能標志物Il1b、Arg2、Cxcr2和Ccr2，作者發現這些基因主要富集在Ythdf1未敲除腫瘤的MDSC細胞簇中（圖1G）。以上數據結果均支持YTHDF1在CRC中發揮免疫抑制功能。
       為驗證scRNA-seq數據中的發現，通過流式細胞術檢測MC38同系腫瘤小鼠中腫瘤浸潤免疫細胞構成。作者已經證實了Ythdf1敲除顯著抑制腫瘤的體積和重量（圖1C），而流式細胞術結果顯示，Ythdf1敲除降低MDSCs的同時，增加了腫瘤中CD8⁺T細胞和CD4⁺T細胞（圖1H和1I）。在MDSCs中，G-MDSCs為主要亞群，Ythdf1敲除導致G-MDSCs顯著減少（圖1I）。作者觀察到在Ythdf1-KO組中，功能性T細胞顯著增加，其中包括IFN-γ⁺ CD8⁺T細胞、顆粒酶B⁺ CD8⁺T細胞和IFN-γ⁺ CD4⁺T細胞，這與MDSCs發揮免疫抑制功能一致（圖1H和1J）。

圖1：YTHDF1與CRC免疫抑制微環境有關

2. Ythdf1敲除通過減少MDSC和增加功能性T細胞誘導抗腫瘤免疫
       作者接下來在CT26（MSS-CRC）細胞中敲除Ythdf1，驗證Ythdf1在抗腫瘤免疫調節中的作用。如預期，Ythdf1-KO導致CT26同系腫瘤小鼠的腫瘤體積和重量減小（圖2A和2B），同時，功能性T細胞增加以及MDSCs浸潤減少（圖2C和2D）。免疫熒光染色也證實Ythdf1敲除使MC38和CT26同系腫瘤中MDSCs（CD11b⁺Gr-1⁺）浸潤減少（圖2E）。總而言之，CRC細胞中Ythdf1缺失減少MDSCs并提高功能性T細胞浸潤。這些發現證明YTHDF1與CD8⁺T細胞和IFN-γ相關特征有關（圖1A-C）。
       關于Ythdf1-KO中腫瘤形成減弱是否依賴于CD8⁺T細胞抗腫瘤免疫，在MC38同系腫瘤模型中，作者利用CD8抗體耗竭CD8⁺T細胞。結果發現，CD8⁺T細胞耗竭恢復了Ythdf1-KO腫瘤生長（圖2F和2G），這表明Ythdf1-KO對腫瘤的抑制部分依賴于CD8⁺T細胞。這在CT26同系腫瘤模型小鼠中得到證實， CD8抗體處理挽救了Ythdf1-KO組中腫瘤停滯生長（圖2H和2I）。作者得出結論，Ythdf1敲除通過誘導CD8⁺T細胞依賴性抗腫瘤免疫抑制CRC生長。

圖2：Ythdf1-KO減少MDSCs的同時增加細胞毒性T細胞浸潤

3. 腸道特異性Ythdf1敲入促進小鼠結腸腫瘤發生并抑制抗腫瘤免疫
       為驗證YTHDF1在自發性CRC發生中的作用，作者構建了腸道特異性Ythdf1敲入小鼠（Ythdf1^loxp/loxpCDX2-cre），并通過AOM/DSS處理誘導小鼠CRC發生（圖3A）。他們發現，在AOM/DSS模型中，Ythdf1過表達引起結腸腫瘤的數量和尺寸增加（圖3C）。流式細胞術結果顯示，與野生型小鼠相比，Ythdf1敲入小鼠結腸腫瘤MDSC浸潤增加的同時，NK、CD4⁺T和CD8⁺T細胞減少（圖3D）。此外，作者還發現Ythdf1敲入降低了通過顆粒酶B、INF-γ和TNF-α表達鑒定的功能性T細胞占比（圖3E）。
       接下來，作者通過建立Apc^Min/+Ythdf1^loxp/loxpCDX2-cre小鼠，在Apc^Min/+造成的自發性CRC中驗證這些結果（圖3B）。與上述結果一致，相比于野生型，腸道特異性Ythdf1敲入的Apc^Min/+小鼠生長出更大的結腸腫瘤（圖3C）。腫瘤浸潤免疫細胞分析結果表明，在Ythdf1敲入與Apc^Min/+的影響下，腫瘤中NK細胞、CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞浸潤顯著減少的同時MDSCs增加（圖3F）。此外，Ythdf1敲入降低了Apc^Min/+小鼠中顆粒酶B⁺、INF-γ⁺或TNF-α⁺T細胞（圖3G）。總而言之，這些結果均支持YTHDF1促進免疫抑制微環境從而促進自發性CRC。

圖3：Ythdf1-KO促進小鼠結腸腫瘤發生并抑制抗腫瘤免疫

4. VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1增強CD34⁺人源化小鼠的抗腫瘤免疫
       為證實YTHDF1在調節人類抗腫瘤免疫反應中的作用，作者建立了CD34⁺人源化小鼠模型，這種小鼠外周血單核細胞（PBMC）>20% 人類CD45⁺細胞（圖4A）。作者使用了一種攜帶siRNA的VNPs，可以在體內靶向YTHDF1。待腫瘤達到50-100mm³，用VNP-siNC或-siYTHDF1處理攜帶有人CRC HCT116異種移植體的人源化NSG小鼠（圖4B）。與VNP-siNC相比，VNP-siYTHDF1顯著抑制腫瘤的體積和重量（圖4B和4C）。同時，作者通過流式細胞術來分析TIME（圖4D）。發現VNP-siYTHDF1降低MDSC浸潤，增加CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞和NK細胞的累積（圖4E）。此外，在VNP-siYTHDF1腫瘤中識別到更多的IFN-γ⁺、TNF-α⁺和顆粒酶B⁺ CD8⁺T細胞。
       作者還通過測量肝臟（丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶）和腎功能（肌酐和血尿素氮）的血清標志物來確定VNP-siYTHDF1的安全性，而用VNP-siNC或VNPsiYTHDF1處理的小鼠沒有表現出異常的肝臟或腎功能指標，這表明VNP治療具有良好的耐受性。因此，使用VNP-siYTHDF1靶向YTHDF1是增強人源化小鼠抗腫瘤免疫的安全有效手段。

圖4：VNP-siYTHDF1增強CD34⁺人源化小鼠抗腫瘤免疫

5. YTHDF1促進p65翻譯激活TNF-κB信號傳導
       為鑒定YTHDF1引發免疫抑制的分子機制，作者對YTHDF1敲除或非敲除CRC細胞進行RNA-seq和Ribo-seq。其結果表明，YTHDF1敲除或非敲除之間的差異表達基因主要富集于TNF和NF-κB信號通路中。此外，Ribo-seq數據顯示YTHDF1缺失與TNF信號失活顯著相關；相應地，YTHDF1敲除降低了參與TNF信號傳導的核糖體保護片段基因的豐度（圖5A）。因此得出結論，YTHDF1可以通過促進蛋白質翻譯來調節TNF-κB信號傳導。YTHDF1作為m⁶A閱讀器發揮功能，作者接下來對m⁶A進行MeRIP-seq確定m⁶A修飾的轉錄產物。通過篩選參與TNF信號傳導的mRNA中的m⁶A峰，鑒定出兩個靠近p65 mRNA終止密碼子的m⁶A位點（圖5B），MeRIP-qPCR得到了同樣的驗證結果（圖5C）。重要的是，作者通過RIP測序和抗YTHDF1抗體的RIP-qPCR鑒定到YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5D）。這說明p65 mRNA是YTHDF1的直接靶點。作者還發現，Ythdf1敲除在蛋白翻譯水平上減弱了CT26和MC38細胞中p65蛋白的表達，尤其是核p65，但不影響NF-κB途徑的其他調節因子的表達，比如IKKα和IκBα（圖5E）。人CRC細胞野生型YTHDF1過表達提高p65蛋白表達，相反地，YTHDF1基因敲低降低人CRC細胞中p65蛋白表達（圖5F）。抗YTHDF1的RIP-qPCR也證實人CRC細胞中YTHDF1和p65 mRNA之間的直接相互作用（圖5G）。接下來，作者回歸體內驗證YTHDF1和p65的相關性。在Ythdf1敲入小鼠中，p65和磷酸化p65蛋白在結腸腫瘤中均有增加（圖5H）。綜上所述之，YTHDF1在體外和體內均促進p65蛋白表達以激活TNF和NF-κB信號傳導。

圖5：YTHDF1通過促進p65 mRNA翻譯促進CRC中TNF-NF-kB信號傳導

6. YTHDF1通過p65-CXCL1軸促進MDSC遷移
       為了解YTHDF1誘導的p65與其免疫抑制之間的聯系，作者進行了細胞因子多重免疫測定，在CRC細胞、腫瘤裂解物的條件培養基和患有同系腫瘤的小鼠血清中檢測到23種不同的小鼠細胞因子。在這些細胞因子中，經ELISA測定證實Ythdf1-KO持續降低CXCL1（圖6A和6B）。CXCL1是NF-κB信號傳導的轉錄靶點，它與受體CXCR2結合促進MDSC趨化。Ythdf1-KO在CRC TIME中減少MDSC浸潤，為驗證Ythdf1是否調節MDSC遷移，作者進行了體外MDSC遷移測定。他們發現野生型CRC細胞的條件培養基增強了MDSC的遷移，Ythdf1敲除后這種遷移效果減弱（圖6C）。CXCR2抑制劑SB265610阻斷CXCL1-CXCR2結合從而消除對照組和Ythdf1-KO培養上清在介導MDSC遷移方面的差異（圖6C）。YTHDF1是通過CXCL1/CXCR2軸促進MDSC遷移。那么，YTHDF1是否可以調節Cxcl1 mRNA的表達呢？與預期一致，Ythdf1敲除顯著抑制小鼠和人CRC細胞系中Cxcl1 mRNA表達水平（圖6D）。
       作者接下來研究YTHDF1是否影響MDSC功能。從MC38同系腫瘤中分離出CD11b⁺Gr-1⁺ MDSCs與T細胞體外共培養（圖6E）。從對照腫瘤中分離的MDSCs抑制T細胞增殖；然而，與對照組MDSCs相比，Ythdf1-KO腫瘤MDSCs對CD8⁺T細胞和CD4⁺T細胞增殖表現出較低的抑制作用（圖6F和6G）。這些數據證實了之前所報道的MDSCs對關鍵效應細胞（包括CD8+T細胞和CD4+T細胞）的免疫抑制功能，并支持CRC通過表達YTHDF1募集功能性MDSCs。

圖6：Ythdf1缺失通過降低CXCL1分泌促進MDSCs減少

7. YTHDF1是CRC免疫療法的潛在治療靶點
       MDSC浸潤減少與各種類型癌癥的免疫治療效果增強有關，作者嘗試靶向YTHDF1是否增強CRC中抗PD1治療。作者發現敲除Ythdf1顯著提高抗PD1在MC38（MSI-H）同系腫瘤中的療效，并延長荷瘤小鼠生存率（圖7A）。作者進一步利用VNPs將特異性Ythdf1-siRNA遞送到腫瘤中。當MC38同系腫瘤達到50～100mm³時，用VNP-siYthdf1（或VNP-siNC）和抗PD1（或IgG）處理小鼠。與VNP-siNC相比，VNP-siYthdf1顯著抑制MC38腫瘤生長，而VNP-siYthdf1與抗PD1聯合處理對腫瘤生長產生最強抑制作用（圖7B，C）。
       基于同系CT26（MSS CRC）腫瘤模型，作者同樣探討了靶向YTHDF1能否解決MSS CRC中抗PD1的耐藥性。將Ythdf1敲除CT26細胞注射同系腫瘤小鼠，并用抗PD1處理。結果發現，Ythdf1敲除顯著增強抗PD1在CT26同系腫瘤中的治療效果（圖7D和7E）。
       流式細胞術結果顯示，在CT26和MC38同系模型中，Ythdf1沉默與抗PD1聯合處理顯著增加了腫瘤功能性CD8⁺T細胞浸潤，包括IFN-γ⁺ CD8⁺T細胞和顆粒酶B⁺ CD8⁺T細胞。此外，二者聯合處理顯著降低MDSCs積累，并誘導CD4⁺T細胞和CD8⁺T細胞。因此，靶向YTHDF1不僅增強ICB在MSI-H CRC中的治療效果，而且通過抑制MDSCs募集和改善CD8+T細胞的功能，克服MSS CRC中ICB抵抗。

圖7：YTHDF1增強MSI-H和MSS CRC的抗PD1阻斷治療

結論
       綜上所述，CRC中YTHDF1表達通過激活m⁶A-p65-CXCL1軸招募免疫抑制性MDSCs抑制T細胞，從而促進CRC。靶向YTHDF1聯合抗PD1治療CRC具有治療前景，這證實YTHDF1是CRC潛在的治療靶點。

實驗方法
細胞培養，免疫組化，流式細胞術，免疫熒光，CRISPR/Cas9，scRNA-seq，VPN-siRNA, Western blot, RIP-seq, Ribo-seq，RIP-q PCR, MeRIP,
參考文獻
Bao Y, Zhai J, Chen H, Wong CC, Liang C, Ding Y, Huang D, Gou H, Chen D, Pan Y, Kang W, To KF, Yu J. Targeting m6A reader YTHDF1 augments antitumour immunity and boosts anti-PD-1 efficacy in colorectal cancer. Gut. 2023 Aug;72(8):1497-1509. doi: 10.1136/gutjnl-2022-328845. Epub 2023 Jan 30. PMID: 36717220.