盡管越來越多的證據表明miR-297有助于腫瘤的發生和進展，但miR-297在肝細胞癌(HCC)中的作用及其潛在的分子機制仍不清楚。在這里，我們報道了在人羊膜上皮細胞(hAECs)條件培養基處理后，miR-297在hepG2細胞中的表達顯著增加。而過表達miR-297在體外可抑制HCC細胞系的細胞增殖、遷移和侵襲，在體內可抑制HCC的發生。PTBP3在HCC細胞系中被鑒定為miR-297的直接靶基因，并介導miR-297在HCC細胞中的功能。臨床樣本中miR-297水平有降低的趨勢。體外細胞實驗證實，過表達miR-297可通過下調PTBP3表達抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。綜上所述，我們的研究結果表明，miR-297可以下調PTBP3的表達，抑制PI3K/AKT信號通路的激活，從而阻止HCC的生長、遷移和侵襲。本文于2023年8月發表于“Cell Death Disease”（IF=9.0）上。
技術路線

結果
1）經hAEC-CM處理后，HepG2細胞中miR-297的表達升高
       通過CCK-8和創傷愈合試驗評估細胞增殖和遷移能力。用hAEC-CM處理可顯著抑制HepG2細胞的生長和遷移(圖1A, B)。為了確定生長抑制的機制，我們通過miRNA陣列和RT-qPCR驗證了miRNA的差異表達(圖1C)。通過miRNA陣列(圖1D)和RT-qPCR(圖1E)分別檢測和驗證了miR-297在hepG2中的表達，miRNA陣列的結果顯示，miR-297的表達與對照組相比明顯增加(圖1D)，我們通過RT-qPCR驗證了hAEC-CM處理72 h后，miR-297在hepG2中的差異表達。RT-qPCR結果顯示，hAEC-CM處理HepG2細胞72 h后，miR297的表達顯著升高(圖1E)。

2）MiR-297在體外抑制HCC細胞系的增殖、遷移和侵襲
       為了確定miR-297對肝癌細胞體外生長的影響，我們將miR-297模擬物、抑制劑和陰性對照引入肝癌細胞，包括HepG2和Huh7細胞。與陰性對照組相比，轉染miR-297模擬物后，肝癌細胞系中miR-297的表達顯著升高，而抑制劑處理的肝癌細胞中miR-297的表達顯著降低(圖2B)。細胞增殖能力通過CCK-8、菌落形成、細胞周期和細胞凋亡檢測進行評價。過表達miR-297顯著抑制了HepG2和Huh7細胞的生長(圖2A)。轉染miR-297的細胞在G0/G1期的比例顯著高于對照組(圖2C)，表明miR-297通過抑制G2到S細胞周期的轉變，在G0/G2期阻滯了細胞周期。此外，與對照組相比，轉染組形成的菌落數量顯著減少(圖2D)。我們的結果顯示，轉染組(miR-297 mimic)和陰性對照組(miR-NC)之間的細胞凋亡沒有顯著差異(圖2F)。轉染后，HepG2和Huh7細胞的遷移和侵襲能力降低(圖2E, G)。這些結果證實了miR-297在體外抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

3）過表達miR-297可抑制HepG2細胞的體內腫瘤生長
       由于miR-297在體外抑制HepG2和Huh7細胞的生長，我們進行了體內腫瘤形成實驗。我們通過裸鼠皮下注射HepG2-miR-297細胞和對照細胞來評估miR-297的體內抗腫瘤功效。每周測量腫瘤體積，腫瘤植入后6周處死小鼠。從第21天開始，miR-297組的腫瘤體積明顯低于對照組(圖3A)。實驗結束時，miR-297組的腫瘤平均重量明顯低于對照組(圖3B、C)。Ki67的表達弱于對照組的腫瘤(圖3D)。這些結果表明miR-397在體內顯著抑制腫瘤發生。

4）miR-297在人肝癌患者組織中的表達
       為了研究miR-297在肝癌患者組織中的表達模式，我們進行了組織微陣列。結果顯示，miR-297水平在癌組織中與非癌組織相比有降低的趨勢，但差異無統計學意義(圖4A, B)。并比較四組miR-297表達比例。結果顯示四組癌變組織與非癌變組織的比例無顯著差異(圖4C)。根據p53的表達水平，將70例肝癌患者樣本分為p53陽性組和p53陰性組。我們比較了兩組，發現陽性組的miR-297水平較低(圖4D)。

5）MiR-297靶向并下調PTBP3，抑制PI3K/AKT信號通路
       接下來，我們檢索了四個在線miRNA靶點生物信息學預測數據庫(TargetScan、PicTar、miRWalk和miRanda)，以確定miR-297的候選靶基因。最初，在所有四個數據庫中預測了miR-297的13個潛在基因(圖5A)。所有四個數據庫都預測PTBP3是miR-297的直接靶點。在PTBP3 mRNA的3 ' -UTR中發現了一個互補的miR-297序列(圖5B)。過表達miR-297可下調HepG2細胞中PTBP3 mRNA和蛋白水平(圖5C, D)。為了驗證PTBP3是miR-297的真正下游靶點，我們進行了雙熒光素酶報告基因實驗。結果表明，轉染miR-297模擬物顯著降低PTBP3熒光素酶報告基因活性(圖5E)，而miR-297抑制劑具有相反的效果(圖5F)。然而，當與突變的PTBP3報告基因共轉染時，miR-297模擬物并沒有抑制PTBP3的熒光素酶活性。結果強調了miR-297與PTBP3-3 ' -UTR的結合。
       先前的報道表明，PTBP3在HCC中的作用很可能與Akt的磷酸化有關。為了驗證，通過western blotting檢測AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的表達。我們發現miR-297模擬處理導致miR-297升高，但降低PTBP3、p-PI3K、AKT和p-AKT的表達以及p-AKT/ AKT比值；轉染PTBP3質粒后，PTBP3、p-PI3K、AKT、p-AKT表達增加，p-AKT/AKT比值增加。相對于miR-297 mimic處理，miR-297 mimic+PTBP3質粒處理對miR-297的表達沒有影響，但增加了PTBP3、p-PI3K和p-AKT的表達以及p-AKT/AKT比值(圖5D)。這些結果表明miR-297可以特異性結合PTBP3-3 ' -UTR下調PTBP3表達，從而抑制PI3K/AKT信號通路。我們還對EMT相關基因進行了western-blot分析。我們發現miR-297過表達下調PTBP3、間質標記物(N-cadherin和Vimentin)，但增強上皮標記物(E-cadherin)，而PTBP3質粒轉染導致PTBP3、N-cadherin和Vimentin表達增加，但降低E-cadherin表達(圖5D)。MiR-297模擬物+PTBP3質粒處理恢復了EMT相關水平。綜上所述，PTBP3過表達誘導HepG2和Huh7細胞發生EMT。miR-297在HCC細胞中的過表達可以通過下調PTBP3的表達來抑制EMT。

6）PTBP3表達降低可阻斷PI3K/AKT信號通路，抑制肝癌細胞系體外增殖、遷移和侵襲
       在確認PTBP3是HepG2細胞中miR-297的直接靶點后，我們進一步探討了miR-297介導的PTBP3在HCC生物學功能中與PI3K/AKT信號通路的關系。我們首先將si-PTBP3和陰性對照(si-NC)轉染HepG2細胞，以確定PTBP3的減少是否能抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。結果表明，轉染si-PTBP3可抑制HepG2細胞的增殖(圖6A)、遷移(圖6C)和侵襲(圖6D)。細胞周期阻滯在G0/G1期(圖6B)。為了進一步證實PTBP3在miR-297對HepG2細胞抑制作用中的作用，我們將miR-297模擬物和PTBP3質粒共轉染到HepG2細胞中，以確定PTBP3過表達是否可以逆轉miR-297過表達對HepG2細胞進展的抑制作用。結果表明，PTBP3過表達逆轉了miR-297過表達對HepG2細胞增殖(圖6E)、遷移(圖6G)和侵襲(圖6H)以及細胞周期阻滯效應(圖6F)的抑制作用。
       此外，miR-297 mimic處理后，HepG2和Huh7細胞中p-PI3K、p-AKT和PTBP3的表達以及p-AKT/AKT比值均降低，而在miR-297抑制劑處理的HCC細胞中觀察到相反的趨勢。此外，相對于miR-297抑制劑治療，進一步LY294002治療不影響PTBP3表達，但導致HepG2和Huh7細胞中p-PI3K和p-AKT表達以及pAKT/AKT比值下降，而miR-297抑制劑+ si-PTBP3治療導致p-PI3K、p-AKT和PTBP3表達降低(圖6I)。CCK-8檢測發現，在第3天和第4天，miR-297抑制劑誘導細胞生長，而LY294002或miR-297模擬治療導致相反的趨勢；與抑制劑處理相比，miR-297抑制劑+ si-PTBP3或miR-297抑制劑+ LY294002處理抑制了HCC細胞系的細胞增殖(圖6J)。此外，miR-297抑制劑誘導HCC細胞的侵襲和遷移，而LY294002或miR-297 mimic轉染則導致相反的趨勢；相對于miR-297抑制劑治療，miR-297抑制劑+ si-PTBP3或miR-297抑制劑+ LY294002治療抑制HCC細胞的侵襲和遷移(圖6K, L)。綜上所述，這些結果支持miR-297過表達通過降低PTBP3，抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制HCC細胞的增殖、遷移和侵襲。

結論
       我們證明過表達miR-297在體外抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲，在體內抑制肝癌細胞的腫瘤發生。在肝癌細胞中發現PTBP3是miR-297的直接靶基因。MiR-297可直接靶向PTBP3，滅活PI3K/AKT信號通路，抑制HCC細胞系的生長、遷移和侵襲。因此，miR-297可能是一個有效的潛在肝癌治療靶點。

實驗方法
RT-qPCR，Western blotting，熒光素酶報告試驗，CCK-8，克隆形成實驗，流式，傷口愈合及侵襲試驗，裸鼠體內腫瘤發生實驗，miR-297原位雜交，免疫組織化學染色，miRNA芯片分析。
參考文獻
Lu N, Min J, Peng L, Huang S, Chai X, Wang S, Wang J. MiR-297 inhibits tumour progression of liver cancer by targeting PTBP3. Cell Death Dis. 2023 Aug 26;14(8):564. doi: 10.1038/s41419-023-06097-0.