乳腺癌是全世界女性中最常見的癌癥，也是癌癥相關死亡的第二大原因。腦轉移（BrM）是乳腺癌最致命的形式。三陰性乳腺癌（TNBC）是最具侵襲性的亞型，多達46%的患者發(fā)生腦轉移。盡管近年來系統(tǒng)治療取得了進展，但乳腺癌腦轉移（BCBrM）的治療仍具有挑戰(zhàn)性。因此，作者迫切需要提高對BCBrM，尤其是TNBC亞型的潛在機制的理解。癌細胞表現(xiàn)出顯著的代謝重編程以支持轉移能力，其中之一是脂質代謝重編程。最近的證據(jù)表明，能轉移到大腦的乳腺癌細胞具有獨特的脂質代謝特征，干擾這些細胞的脂質代謝可抑制BrM。這些有限的發(fā)現(xiàn)闡明了脂質代謝重編程在BrM中的潛在重要性，但其確切的潛在機制還遠未完全闡明。維甲酸受體反應蛋白2（RARRES2）是一種重要的調節(jié)脂肪生成和脂肪細胞脂質代謝的脂肪因子。已有多項研究報道了RARRES2在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有腫瘤抑制作用，但目前對RARRES2在癌細胞脂質代謝中的作用知之甚少，也不清楚RARRES2與脂質代謝以及BCBrM之間的關系。該研究發(fā)表在《Military Medical Research》，IF：21.1。
技術路線

主要研究結果
1. BCBrM中RARRES2表達降低
       為了研究BrM潛在的脂質代謝重編程特征，作者對三陰性乳腺癌原發(fā)腫瘤和BrM樣本進行了scRNA-seq分析。本研究中使用的兩個BrM數(shù)據(jù)集來自作者自己的scRNA-seq數(shù)據(jù)（BrM1）和GSE186344（BrM2）。通過評估特定標記基因的表達水平，共識別出9個不同的細胞簇。通過對原發(fā)腫瘤（n=87045個腫瘤細胞，GSE176078）和BrM（n=29173個腫瘤細胞）的腫瘤細胞簇進行比較分析，作者發(fā)現(xiàn)BrM腫瘤細胞表現(xiàn)出上調的脂質合成和脂肪酸代謝標簽，這與之前的文獻一致。為了確定一個可能在BCBrM的啟動和發(fā)展中起關鍵作用的潛在脂肪因子，作者利用Gene Expression Omnibus公共數(shù)據(jù)集進行了數(shù)據(jù)挖掘分析。具體而言，在人TNBC MDA-MB-231父代細胞和MDA-MB-231 BrM（GSE12237）之間，以及在異種移植到小鼠脂肪墊、皮膚和腦（GSE19184）中的MDA-MB-231-BrM細胞之間，比較了編碼脂肪因子或脂質代謝關鍵酶的823個基因的表達（GSE19184）（圖1a）。在兩個數(shù)據(jù)集中，與親代細胞或注射到脂肪墊的腫瘤細胞相比，BrM中顯著下調的基因被確定。值得注意的是，RARRES2是BCBrM中下調最顯著的基因（圖1a）。為了驗證作者的發(fā)現(xiàn)，作者使用一個由配對的原發(fā)性乳腺腫瘤和BrM組成的獨立患者隊列進行了額外的分析。在這個隊列中檢測RARRES2的表達，發(fā)現(xiàn)BrM中RARRES2的表達水平顯著低于匹配的乳腺原發(fā)腫瘤樣本（圖1b）。此外，作者采用免疫組織化學方法評估了人類腫瘤樣本中RARRES2蛋白的表達。結果表明，與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，BrM樣本中的RARRES2表達顯著降低（圖1c）。此外，基于上述scRNA-seq數(shù)據(jù)，作者觀察到與原發(fā)性乳腺癌相比，BrM中RARRES2的表達水平較低（圖1d）。
       為了進一步研究RARRES2在不同腫瘤部位的表達，作者分析了另一個獨立的患者隊列，包括不匹配的原發(fā)性乳腺腫瘤和腦轉移病灶。在該隊列中，與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，RARRES2在BCBrM中的表達顯著降低，而且在原發(fā)性腦腫瘤（GSE100534）中也顯著降低（圖1e）。GSE14020分析顯示，RARRES2在腦轉移乳腺癌中的表達水平明顯低于骨轉移和肺轉移乳腺癌（圖1f）。此外，作者使用MetMap數(shù)據(jù)（GSE148283）檢測了RARRES2的表達，發(fā)現(xiàn)與肝轉移的乳腺癌細胞相比，腦轉移的乳腺癌細胞中RARRES2的表達顯著下調（圖1g）。此外，在分析GSE62598數(shù)據(jù)集時，作者未觀察到與原發(fā)性乳腺腫瘤相比，RARRES2在肝、骨或肺轉移瘤中的表達降低（圖1h）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明RARRES2的表達在乳腺癌的BrM中特異性降低，凸顯了RARRES2下調和BrM之間的潛在關聯(lián)。

圖1 RARRES2在乳腺癌腦轉移（BrM）中表達下調

2. RARRES2缺失促進BrM形成
       為了探索RARRES2在三陰性乳腺癌BrM中的作用，作者的下一個目標是研究RARRES2的表達是否影響腦轉移細胞的侵襲或增殖。對基因型-組織表達數(shù)據(jù)庫進行的初步分析顯示，正常腦組織中RARRES2表達水平相對較低。這使作者推測，在轉移到大腦的乳腺癌細胞中，RARRES2表達下降可能是對大腦微環(huán)境的適應。為了模擬BrM中RARRES2的低表達，作者分別用兩種不同的短發(fā)夾RNA在MDA-MB-231和4T1細胞中穩(wěn)定敲低RARRES2（RARRES2-KD）（圖2a, d）。隨后，作者觀察到RARRES2-KD顯著促進了兩種細胞的增殖和侵襲（圖2b, c, e, f）。相反，過表達RARRES2（RARRES2-OE）（圖2g, j）顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖和侵襲（圖2h, i）。
       為了在體內追蹤腫瘤細胞的行為，作者使用了熒光素酶標記的RARRES2-OE 4T1細胞的BLI。值得注意的是，當將RARRES2-OE注入小鼠顱內時，顯示出對4T1細胞生長的顯著抑制（圖21），盡管在體外沒有統(tǒng)計學差異（圖2k）。此外，RARRES2-OE還抑制了心臟內注射后4T1細胞的腦轉移（圖2m, n）。然而，值得注意的是，RARRES2-OE沒有表現(xiàn)出對肝轉移的顯著抑制（圖2n）。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)強烈提示，RARRES2在BCBrM中發(fā)揮關鍵作用，因為高水平的RARRES2會阻礙乳腺癌中BrM的進程。

圖2 RARRES2-OE抑制乳腺癌腦轉移

3. RARRES2調控脂質代謝重編程和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路
       為了更深入地了解RARRES2調控BCBrM的分子機制，作者在TCGA-BRCA轉錄組測序數(shù)據(jù)中鑒定了RARRES2共表達基因。隨后，GO和KEGG富集分析表明，這些基因主要參與脂質代謝通路，包括磷脂酰肌醇磷酸化、甘油三酯穩(wěn)態(tài)、脂氧合酶通路、PI3K-Akt信號通路和mTOR信號通路（圖3a, b）。這些發(fā)現(xiàn)揭示了這些通路在RARRES2介導的BCBrM調節(jié)中的潛在作用。
       作者進一步擴展了研究，分別在乳腺癌和BrM癌上皮細胞的單細胞轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定了RARRES2共表達基因，并探索了受RARRES2調控的生物學過程。值得注意的是，與RARRES2呈正相關的基因主要與腫瘤轉移相關過程相關，包括生物黏附、細胞遷移和增殖（圖3c）。另一方面，與RARRES2表達呈負相關的基因主要參與物質和酸的代謝（圖3d）。這些發(fā)現(xiàn)進一步揭示了RARRES2在乳腺癌轉移相關生物學過程中的潛在調控作用。
       為了進一步研究與RARRES2過表達相關的分子改變，作者在RARRES2過表達的細胞和對照MDA-MB-231細胞中進行了轉錄組測序。差異表達基因富集于轉移性生物學過程，如細胞黏附（圖3e, g）。此外，功能富集分析進一步突出了脂質代謝過程，包括磷脂外流。此外，基于京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫的基因集富集分析表明，RARRES2-OE組甘油磷脂代謝和泛酸鹽和輔酶A的生物合成上調，而視黃醇代謝和類固醇激素的生物合成下調（圖3f）。值得注意的是，對差異表達基因的通路分析也發(fā)現(xiàn)了PI3K信號通路（圖3g）。這些發(fā)現(xiàn)讓作者了解了與RARRES2過表達相關的分子變化，特別是轉移過程、脂質代謝和PI3K信號通路的變化。

圖3 富集分析表明，RARRES2在乳腺癌中調節(jié)脂質代謝重編程和PI3K信號通路

4. RARRES2改變MDA-MB-231細胞的脂質代謝
       為了研究RARRES2在調節(jié)BCBrM中脂質代謝中的作用，作者在RARRES2-KD及其對照MDA-MB-231細胞中進行了非靶向脂質組學分析，并觀察到脂質代謝物的顯著變化（圖4a, b）。具體而言，作者注意到磷脂酰膽堿和phosphatidyl ethanolamine 水平的增加，這兩種物質是甘油磷脂家族的關鍵組成部分（圖4c）。相反，TAGs水平降低（圖4c）。對差異表達脂質進行的通路分析顯示，甘油磷脂代謝、鞘脂代謝和甘油脂代謝顯著富集（圖4d）。此外，對RARRES2-OE及其對照MDA-MB-231細胞的RNA測序顯示，RARRES2調節(jié)參與甘油磷脂代謝、脂肪酸合成和膽固醇合成的基因的表達，如FASN、SCD、HMGCR、CPT1A和PTDSS1的表達等（圖4e）。此外，RT-qPCR也證實了ACACA和HMGCR在RARRES2敲低后表達上調（圖4f）。這些發(fā)現(xiàn)強烈表明，RARRES2的表達降低與MDA-MB-231細胞系的脂質代謝失調密切相關，提示RARRES2在BCBrM中調節(jié)脂質代謝的潛在作用。
       為了研究干擾RARRES2介導的脂質代謝重編程是否影響乳腺癌細胞的惡性表型，作者使用CPT1抑制劑etomoxir對RARRES2表達改變的MDA-MB-231細胞進行了實驗。有趣的是，作者觀察到在RARRES2敲低的細胞中，與對照細胞相比，CPT1的抑制顯著逆轉了細胞增殖（圖4g）。綜上所述，遺傳、代謝、轉錄組學和功能學證據(jù)為RARRES2在調節(jié)脂質代謝中的作用提供了支持。

圖4 RARRES2調節(jié)MDA-MB-231細胞的脂質代謝

5. RARRES2負調控PTEN-mTOR-SREBP1信號通路
       脂質代謝重編程受到多種代謝途徑的嚴格調控，參與代謝產物的合成和降解。值得注意的是，PI3K/mTOR軸及其下游的SREBP信號成為脂質代謝的關鍵調控樞紐。
       最近的證據(jù)強調了PIK3CA突變作為與BCBrM相關的主要突變的重要性，以及SREBP1在腦中促進乳腺癌細胞增殖的重要作用。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)和作者的功能富集分析（圖3b, g），作者提出RARRES2可能通過mTOR-SREBP1信號通路調節(jié)脂質代謝重編程。根據(jù)這一假設，在MDA-MB-231細胞中，p-Akt、mTOR、p-mTOR、SREBP1/cleaved SREBP1的蛋白水平與RARRES2-KD或RARRES2-OE呈負相關（圖5a），表明RARRES2對mTOR-SREBP1信號通路具有負性調控作用。在這一背景下，另一個關鍵的參與者是PTEN，這是一種在TNBC中經常缺失的腫瘤抑制因子，并與PI3K通路激活相關。據(jù)報道，TNBC中PTEN缺失/突變的比例高達35-40%。此外，在BCBrM的基因組圖譜中，PTEN位于基因組改變最多的5個基因內。既往研究報道RARRES2通過PTEN調節(jié)PI3K-mTOR軸，作者觀察到PTEN的蛋白水平與RARRES2直接相關（圖5a）。
       為了研究是否可以通過抑制mTOR通路來逆轉RARRES2缺陷的促癌作用，作者使用mTOR抑制劑雷帕霉素處理RARRES2-KD及其對照MDA-MB-231細胞。結果表明，雷帕霉素處理顯著逆轉了RARRES2-KD細胞的增殖和侵襲增加（圖5b, c）。此外，蛋白質印跡分析顯示，雷帕霉素處理逆轉了RARRES2敲低引起的P-mtor和SREBP1表達水平的升高（圖5d）。
       CMKLR1是RARRES2發(fā)揮其生物學功能的主要受體。因此，作者進一步研究了CMKLR1在RARRES2介導的脂質代謝重編程及其下游信號通路中的作用。敲低CMKLR1消除了在RARRES2-OE細胞中觀察到的PTEN表達的顯著增加和p-Akt表達的降低（圖5e）。此外，在RARRES2過表達和對照細胞中，CMKLR1敲低導致FASN在mRNA水平的表達上調（圖5f）。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，RARRES2調節(jié)PTEN-mTOR-SREBP1軸，而PTEN-mTOR-SREBP1軸反過來調節(jié)TNBC中的脂質代謝和BCBrM。

圖5 RARRES2負調控PTEN-mTOR-SREBP1軸

結論
       該研究聚焦于BrM，即乳腺癌的臨床困境，并確定了RARRES2和BCBrM之間的特異性關聯(lián)。該研究表明，由RARRES2介導的脂質代謝重編程對三陰性乳腺癌的腦轉移形成至關重要。該研究結果不僅為目前對脂質代謝和乳腺癌BrM的理解提供了新的見解，而且提示了RARRES2作為這種危及生命的疾病的潛在治療靶點的干預措施。

實驗方法
IHC染色，RNA測序，RT-qPCR，蛋白質印跡，細胞增殖測定，體外侵襲試驗
參考文獻：
Li YQ, Sun FZ, Li CX, Mo HN, Zhou YT, Lv D, et al. RARRES2 regulates lipid metabolic reprogramming to mediate the development of brain metastasis in triple negative breast cancer. Mil Med Res. 2023 Jul 25;10(1):34. doi: 10.1186/s40779-023-00470-y.