單細胞測序揭示特應性皮炎中的多細胞形態和互作
欄目：最新研究動態
發布時間：2023-12-13
本研究發現IL19+IGFL1+KCs可能參與了皮膚屏障的破壞、Th2和Th17炎癥反應的連接和放大以及皮膚瘙癢的介導......
特應性皮炎（AD）是一種慢性、復發性炎癥性皮膚病，以劇烈瘙癢和濕疹為特征。據報道，不同種族群體的特應性皮炎在臨床、分子和遺傳方面存在差異。本研究旨在對中國人群中的AD進行深入的轉錄組分析。ScRNA-seq共分析了 87,853個細胞，其中AD 中的角質細胞（KCs）表現出高表達的角質細胞活化和促炎癥基因。KCs表現出一種新的IL19 + IGFL1 +亞群，在AD病變中有所增加。炎性細胞因子IFNG、IL13、IL26和IL22在AD病變中高表達。在體外，IL19直接下調HaCaT細胞中的KRT10和LOR，并激活HaCaT細胞產生TSLP。因此，IL19+IGFL1+KCs可能參與了皮膚屏障的破壞、Th2和Th17炎癥反應的連接和放大以及皮膚瘙癢的介導。此外，在AD慢性病灶中會出現以2型炎癥反應為主的多種免疫軸的進行性激活。本文于2023年6月發表在《Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology》IF：9.2期刊上。
技術路線
主要實驗結果
1、AD和健康（HC）皮膚活檢樣本的scRNA-seq檢測皮膚細胞類型
本文scRNA-seq的程序流程如圖1a所示。使用降維分析展示了scRNA-seq檢測到的9種細胞cluster和10種細胞類型（圖1b）。頂端上調基因（根據平均log2(FC)和FDR）證實了細胞類型對特定簇的分配（圖1c）。經典marker基因也證實了細胞類型的注釋（圖1d）。比較了AD組和HC組的細胞組成，發現在AD慢性病變中，基礎KC的比例顯著降低，而增殖KC的比例顯著升高，符合AD的表皮過度增生和異常分化的本質，與此同時，AD慢性病變中黑素細胞的比例大幅下降（圖1e,f）。
圖1在AD和健康對照皮膚活檢中的細胞類型
2、AD和HC中的角質細胞的分化
在兩組中，所有四種KC簇都存在（圖2a），并表現出相似的結構和增殖標記的表達。比較scRNA-seq數據中AD和HC組的差異表達基因（DEGs），發現低表達干細胞和基礎角質形成細胞基因（KRT15, COL17A1），但高表達干擾素響應基因（IFI27, IFITM1）和基因SERPINB13，這些基因參與AD基礎KC的角質形成細胞增殖和分化（圖2b）。AD 基底上層KC的炎癥轉錄本進一步明顯上調，包括alarmins（S100A7、S100A8 和 S100A9）和Th 誘導基因SERPINB4；調節有絲分裂后細胞向分化的TXNIP6AD病變中的表達下降（圖2c）。在增殖的 KC 中，AD患者的角朊細胞活化標志物KRT6A、KRT6B、KRT6C和KRT16以及趨化因子CCL2均顯著上調（圖2d）。在AD的晚期分化KC中，大量下調的基因包括編碼屏障分子（FLG、LOR）和緊密連接復合體（CLDN1、OCLN）的基因。另一方面，參與局部炎癥反應的IL36信號系統基因IL36RN、IL36G在AD晚分化KC中上調（圖2e）。KCs DEGs的GO富集分析表明，主要的生物學過程包括先天免疫反應、激活信號轉導、髓細胞分化、上皮細胞增殖、抗原加工和遞呈、淋巴細胞分化（圖2f）。
圖2 AD與健康對照的角質細胞分化
所有單細胞的基因表達譜數據使作者得以解構KCs的時空分布。在HC中，作者發現了從干細胞基因（KRT15、COL17A1）富集的基底型KC到表達CDSN、FLG和LOR的晚分化型KC的雙重推斷分化軌跡（圖3a,b），這與之前的報道一致。為了深入了解基因表達沿軌跡的動態變化，分析了基因的表達變化，觀察到六大類轉錄基因簇的特征模式。Cluster 2的基因（如連接蛋白基因LAD1、皮膚屏障功能基因TMEM79和縫隙連接基因GJA1）表達上調并維持在高表達水平直至最后階段，主要參與調控 "皮膚屏障的建立、膽固醇代謝過程、脫絨毛組織 "等生物學過程（圖3c,d）。值得注意的是，在AD病變中，發現了KCs的多種分化軌跡（圖3e,f）。盡管發現cluster 4中的炎癥和過度增殖基因（SPRR1、SPRR2、S100A7 和 S100A8）也表現出了持續的高表達模式，在GO術語"中性粒細胞介導的免疫，粒細胞趨化的正向調節，肥大細胞趨化"中也有表達（圖3g,h）。
圖3 角質細胞分化軌跡
3、AD病變中新型炎癥分化的IL19+IGFL1+KC亞群
作者聚焦于基底層KC，聚類后使用t-SNE 進行可視化降維描繪了14個細胞簇（圖4a），其中基底層KC cluster 5主要包含病變的AD細胞（圖4b），其IL19和IGFL1高表達（圖4c,d），這在之前的健康KC研究中沒有報道過。同時，IL19+IGFL1+KC主要存在于AD病灶中（圖4e）。為驗證并確定這些IL19+IGFL1+KC的解剖位置，對代表性標記物進行了多重免疫組化。IL19和IGFL1雙重染色細胞在棘層中最為顯著（圖4f），在AD病變中明顯多于HC（圖4g）。接下來，探討了IL19在體外的表達和功能。將HaCaT細胞與Der p（100 μg/mL）共培養24小時。通過RT-qPCR，發現Der p可誘導HaCaT細胞產生IL19（圖4h）。與PBS相比，在IL19（40 ng/mL）處理的HaCaT細胞中檢測到了更高的TSLP mRNA水平（圖4i）；然而，KRT10和LOR mRNA水平則出現了下調（圖4j,k）。對IL19+IGFL1+KC的DEGs分析顯示，Th17軸相關基因（S100A12、DEFB4A和PI3）、高增殖基因（KRT6A、KRT16、NTRK1和EPGN）和S100基因（S100A7、S100A8）高度表達。此外，分析表明，與HCs相比，AD病變中組胺受體（HRH1、HRH2）、allikin釋放酶KLK7和整合素相關基因CD47的基因表達大幅上調，而KRT15、CLDN1則下調（圖4l）。IL19+IGFL1+KC的DEGs的GO分析顯示主要涉及調控凋亡和表皮生長因子受體信號通路，角質形成細胞增殖，髓樣細胞和淋巴細胞分化（圖4m）。
圖4 AD病變中新型炎癥分化的IL19 + IGFL1 + KC亞群
4、免疫細胞激活促進免疫微環境重塑
在AD慢性病變中，2型和22型細胞因子IL13、IL22的表達進一步升高，1型和17型細胞因子IFNG、IL26的表達進一步升高。在病變T細胞中，KC分泌分子IL25、IL19和IGFL1的受體分子IL17RB、IL20RB和IGFLR1表達較高（圖5a）。GO富集分析顯示，T細胞分化增殖、Th1型免疫應答和Th17型免疫應答在病變T細胞中富集（圖5b）。因此，scRNA-seq數據證實了記憶/效應1型、2型、17型和22型T細胞在AD慢性病變中的活躍擴增。
在AD病變中，髓系細胞對T細胞的招募和極化起著至關重要的作用。根據先前的研究，AD特異性DCs包括CD1A、FCER1A和MRC1陽性的炎性樹突狀表皮細胞（IDEC）亞群和一個少量但重要的表達LAMP3（成熟DCs的標記）的細胞亞群，后者以CCL19受體CCR7的強表達而與之區分（圖5c）。同樣，AD標志性趨化因子CCL17、CCL2222以及TSLP受體成分IL7R也出現了上調（圖5d）。GO富集分析表明，DEGs在抗原處理和表達、T細胞分化、活化和遷移方面有顯著富集（圖5e）。總之，免疫細胞顯示出多個炎癥基因的失調，并促進了AD病變中免疫微環境的重塑。
圖5 AD病變中的免疫細胞激活
5、細胞類型簇中潛在配體-受體相互作用分析
scRNA-seq數據提供了一個獨特的機會用來研究由配體-受體相互作用介導的潛在細胞-細胞通訊。在所有細胞的網絡圖中觀察到，KC細胞、T細胞和類髓鞘細胞之間的相互作用最為豐富，這表明KCs和免疫細胞之間的相互作用信號在AD中的重要性（圖6a, b）。接下來確定了配體-受體對。AD病變中，IFNG IFNG、IL13、IL26、IL22與各自受體之間的相互作用在T細胞和KC之間的相互作用明顯增強。值得注意的是，血管內皮生長因子信號，如VEGFA-KDR、VEGFA-FLT1和NRP2-VEGFA在KCs、骨髓細胞和血管內皮細胞之間發生了改變。配體-受體相互作用分析還預測髓系細胞上的CXCL8和CCL17與血管內皮細胞上的ACKR1有顯著的富集相互作用，而ACKR1能介導免疫細胞的遷移，這與之前的研究結果相當一致。AD中髓系細胞與T細胞之間的配體-受體相互作用增強，如CD28-CD86和CTLA4-CD80（圖6c,d）。
圖6 細胞類型簇中潛在配體-受體相互作用分析
實驗方法
采集臨床樣本，細胞培養和刺激，單細胞樣本懸浮液制備，單細胞測序（scRNA-seq）和生信分析，多色免疫組化，RT- qPCR，
參考文獻
Zhou J, Liang G, Liu L, Feng S, Zheng Z, Wu Y, Chen X, Li X, Wang L, Wang L, Song Z. Single-cell RNA-seq reveals abnormal differentiation of keratinocytes and increased inflammatory differentiated keratinocytes in atopic dermatitis. J Eur Acad Dermatol Venereol. 2023 Jun 16. doi: 10.1111/jdv.19256.