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靶向巨噬細(xì)胞免疫檢查點Siglec-9——提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤免疫治療療效

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時間:2023-11-22
本研究中,作者發(fā)現(xiàn)具有功能可塑性的單核細(xì)胞源腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群......



       新輔助免疫檢查點阻斷療法只能使一小部分多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者受益。因此,靶向髓系細(xì)胞上的其他免疫調(diào)節(jié)劑是一種有吸引力的治療選擇。本研究中,作者發(fā)現(xiàn)具有功能可塑性的單核細(xì)胞源腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞亞群,它們高度表達(dá)免疫抑制SIGLEC9基因,并優(yōu)先在抗PD-1治療無反應(yīng)者中積累。在小鼠模型中,敲除Siglece(小鼠同源基因)可顯著抑制腫瘤發(fā)展并延長存活時間。機(jī)制上,靶向Siglece可通過抗原呈遞、分泌趨化因子和共刺激因子相互作用直接激活CD4+T細(xì)胞和 CD8+T細(xì)胞。此外,Siglece缺失與抗PD-1/PD-L1治療協(xié)同提高抗腫瘤療效。該研究于2023年7月17日發(fā)表在《Nature Cancer》,IF:22.7。
技術(shù)路線


主要研究結(jié)果
1. 新輔助免疫療法重塑GBM微環(huán)境  
       將24名GBM患者分為三組:7名新診斷患者(ND)、5名復(fù)發(fā)患者(Rec)和12名接受帕博利珠單抗和安羅替尼新輔助聯(lián)合療法(Neo)的患者。Neo組又分為5例非應(yīng)答者和7例應(yīng)答者(圖1a,b)。與非應(yīng)答者相比,應(yīng)答者的PFS和總生存期(OS)更長(圖1b)。對腫瘤進(jìn)行scRNA-seq分析,獲得  149048個高質(zhì)量細(xì)胞(圖1c)。比較結(jié)果顯示,Neo/Rec樣本和ND樣本中的T細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞存在顯著差異。巨噬細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的 37.5%,并且在不同疾病階段的代表性逐漸降低,這表明巨噬細(xì)胞在GBM進(jìn)展和治療過程中發(fā)揮重要作用(圖1d)。對24名患者中18名患者的34個組織切片進(jìn)行ST分析,使用非負(fù)矩陣分解(cNMF)尋找共有的表達(dá)模塊(圖1e)。與瘤旁區(qū)相比,腫瘤核心區(qū)的缺氧、血管生成和炎癥反應(yīng)基因特征更為明顯(圖1f)。腫瘤核心區(qū)基因表達(dá)的增加與細(xì)胞外基質(zhì)組織、血管生成、IL-4/IL-13 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和炎癥反應(yīng)有關(guān)(圖1g)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了不同GBM腫瘤區(qū)域的動態(tài)空間景觀。


圖1. ND、Rec和Neo中腫瘤微環(huán)境重編程的單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究


2. GBM中多種SIGLEC9+TAM亞群
       對小膠質(zhì)細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)和單核細(xì)胞進(jìn)行深入分析(圖2a)。發(fā)現(xiàn)一個主要的小膠質(zhì)細(xì)胞集群(C1,表達(dá)TMEM119和P2RY12)和一個小的高表達(dá)CXCL10的小膠質(zhì)細(xì)胞集群(C8)(圖2a,b)。TAM(CD68+、TGFBI+ 和 CSF1R+)再聚類顯示五個亞群:增殖TAMs(C7,MKI67)、IL1+ TAMs(C6,IL1)、一個未定義的亞群(C5)和兩個具有SIGLEC9 表達(dá)特征的亞群,分別命名為SIGLEC9+SEPP1+TAMs(C2,SIGLEC9+和SEPP1+)和SIGLEC9+MARCO+TAMs(C9,SIGLEC9+和MARCO+)(圖2a,b)。還發(fā)現(xiàn)兩個單核細(xì)胞集群:CD14+單核細(xì)胞(C3)和CD16+單核細(xì)胞(C4)(圖2a)。與Rec樣本相比,主要的小膠質(zhì)細(xì)胞集群(C1)在ND樣本中富集(圖2c)。Rec組主要觀察到SIGLEC9+ SEPP1+ TAMs(C2)和CD14+單核細(xì)胞(C3)(圖2c)。在Neo組中,與應(yīng)答者相比,SIGLEC9+MARCO+TAMs(C9)更多地出現(xiàn)在非應(yīng)答者中,而SIGLEC9+SEPP1+TAMs(C2)則略有增加(圖2c)。進(jìn)行基因集變異分析(GSVA)(圖2d),小膠質(zhì)細(xì)胞在抗腫瘤相關(guān)途徑略有富集,表明這些組織常駐髓系細(xì)胞可能不是抗腫瘤免疫反應(yīng)的驅(qū)動力(圖2d)。IL1+TAMs(C6)強烈富集的炎癥反應(yīng)途徑強調(diào)了IL-1在激活巨噬細(xì)胞中的關(guān)鍵作用(圖2d)。IL1+ TAM(C6)在Neo組中的優(yōu)先分布表明,它們可能是由免疫檢查點阻斷療法(ICB)誘發(fā)的(圖2c)。值得注意的是,單核細(xì)胞衍生TAMs的兩個異質(zhì)亞群(SIGLEC9+SEPP1+TAMs,C2;SIGLEC9+MARCO+TAMs,C9)在活化和抗腫瘤途徑中都有富集(圖2d)。使用基于熵的統(tǒng)計算法ROGUE量化亞群的異質(zhì)性,發(fā)現(xiàn)SIGLEC9+SEPP1+TAMs(C2)和SIGLEC9+MARCO+TAMs(C9)在不同疾病階段(圖2e)的ROGUE指數(shù)都很低,CXCL10+小膠質(zhì)細(xì)胞集群(C8)也表現(xiàn)出高度異質(zhì)性(低ROGUE指數(shù))(圖2e)。
3. SIGLEC9引導(dǎo)兩個表達(dá)SEPP1或MARC的TAM亞群
       將單細(xì)胞熵應(yīng)用于TAMs,用統(tǒng)一的流形逼近與投影(UMAP)表示它們的細(xì)胞狀態(tài)可能性。與初始狀態(tài)相比,耗竭SIGLEC9+TAMs后,整體細(xì)胞熵大幅增加,而耗竭M(jìn)ARCO+TAMs則沒有出現(xiàn)整體變化(圖2f)。SEPP1+TAM的耗竭導(dǎo)致大部分區(qū)域的整體細(xì)胞熵更低(圖2f)。因此,維持這兩個TAM亞群的是 SIGLEC9而不是SEPP1或MARCO。值得注意的是,SIGLEC9+SEPP1+TAMs(C2)表達(dá)高水平的抗炎和血管生成相關(guān)基因,如IL10、VEGFB、SLC40A1、FOLR2 和CSF1R(圖2g)。相反,與 SIGLEC9-SEPP1-TAMs相比,SIGLEC9+SEPP1+TAMs中的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-II基因(HLA-DQA1和HLA-DRB1)、促炎細(xì)胞因子IL18以及抗原遞呈和吞噬相關(guān)基因C1QA/C1QB/C1QC也有所升高(圖2g)。SIGLEC9+MARCO+TAMs的抗炎基因(如MRC1、MARCO和VSIG4)和炎癥基因(如ALOX5、ENO1和FBP1)的表達(dá)均上調(diào)(圖2h)。這些結(jié)果說明SIGLEC9+SEPP1+TAMs和SIGLEC9+MARCO+TAMs代表高度可塑性的免疫抑制巨噬細(xì)胞群。
4. SIGLEC9+TAMs源自單核細(xì)胞
       RNA速率分析表明,CD14+單核細(xì)胞(C3)向SIGLEC9+SEPP1+TAMs(C2)和SIGLEC9+MARCO+TAMs(C9)定向流動(圖2i)。這表明SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+TAMs并不是離散的細(xì)胞群,而是連續(xù)的,并且來自單核細(xì)胞。值得注意的是,SIGLEC9+MARCO+TAMs在單核細(xì)胞趨化通路中表現(xiàn)出富集(圖2d),進(jìn)一步支持單核細(xì)胞遷移到腫瘤并逐步分化成SIGLEC9+TAMs的觀點。測量各細(xì)胞群的空間共定位,發(fā)現(xiàn)SIGLEC9+SEPP1+TAMs或SIGLEC9+MARCO+TAMs與CD14+單核細(xì)胞共定位,進(jìn)一步表明它們來自 CD14+單核細(xì)胞(圖2j)。


圖2. 源自單核細(xì)胞的SIGLEC9+巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤和免疫抑制的雙重功能


5. SIGLEC9+TAMs在新輔助治療后積聚
       與其他疾病階段相比,SIGLEC9在非應(yīng)答者樣本中表達(dá)明顯較高(圖3a)。此外,在應(yīng)答者中SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+TAMs中SIGLEC9表達(dá)明顯減少,這表明其具有抑制功能(圖3b)。差異基因表達(dá)(DGE)分析顯示,與ICB治療應(yīng)答者相比,非應(yīng)答者的SIGLEC9+SEPP1+和SIGLEC9+MARCO+TAMs表達(dá)更高的C1QA、C1QB、CD14和SPP1(圖3c,d)。在應(yīng)答者中,炎癥因子如APOE、IL1B、STAT1,T細(xì)胞趨化因子CCL3、CCL4和與IFN-γ相關(guān)的ISG15均上調(diào)(圖3c,d)。值得注意的是,SIGLEC9+TAMs 在應(yīng)答者中顯示出更好的T細(xì)胞趨化性,這表明它們可以增強ICB治療的陽性反應(yīng)(圖3e)。SIGLEC9+TAMs顯示出與新輔助抗PD-1治療的GBM數(shù)據(jù)集中髓樣細(xì)胞-C6亞群的相似性,均表達(dá)免疫抑制基因,如GPNMB、CSTB和MRC1(圖3f-h)。在人類復(fù)發(fā)性GBM數(shù)據(jù)集中,SIGLEC9+SEPP1+TAM與表達(dá)吞噬/脂質(zhì)和抗炎基因的TAM亞群一致,而SIGLEC9+MARCO+TAM與缺氧性TAM相似(圖3i)。SIGLEC9+TAMs與其他數(shù)據(jù)集的相似性表明這些細(xì)胞類型的免疫抑制功能。


圖3. 新輔助抗PD-1治療后SIGLEC9+巨噬細(xì)胞持續(xù)存在


6. SIGLEC9+TAMs與不良臨床結(jié)局相關(guān)
       評估大型臨床隊列中的SIGLEC9基因表達(dá),發(fā)現(xiàn)癌癥基因組圖譜(TCGA)GBM隊列中,SIGLEC9 的表達(dá)與OS呈負(fù)相關(guān)(圖 4a)。以scRNA-seq為參照,對TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行CIBERSORTx反卷積分析,發(fā)現(xiàn)在同一隊列中,SIGLEC9+TAM 的比例與OS呈負(fù)相關(guān)(圖4b)。通過免疫組化(IHC)方法評估Siglec-9,該方法使用的組織芯片來自一個大型 GBM 隊列,在該隊列中,高水平的 Siglec-9 與OS呈負(fù)相關(guān)(圖4c)。
7. Siglece基因缺失增強小鼠的抗腫瘤活性
       Siglece是人類 SIGLEC9的小鼠功能同源物,使用野生型(WT)和 Siglece 基因敲除(Siglece-/-)小鼠進(jìn)行反向翻譯研究。首先在蛋白質(zhì)水平上評估C57/BL6 小鼠的 Siglec-E(圖4d)。在脾臟和淋巴結(jié)中,WT小鼠的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中高表達(dá)Siglec-E,樹突狀細(xì)胞(DC)中表達(dá)較少,T細(xì)胞、B細(xì)胞或自然殺傷(NK)細(xì)胞上幾乎沒有表達(dá),而Siglece-/-小鼠在所有這些免疫細(xì)胞上都沒有表達(dá)Siglec-E(圖4e,f)。Siglec-E在腫瘤浸潤白細(xì)胞中的表達(dá)與接種CT2A膠質(zhì)瘤細(xì)胞的小鼠同系腫瘤中的脾和淋巴結(jié)中的表達(dá)相似(圖4g)。Siglece的缺失明顯阻礙了內(nèi)臟腫瘤的生長(圖4h),從而延長小鼠的存活時間(圖4i)。鑒于Siglec-E在其他髓系細(xì)胞上也有表達(dá)(圖 4d-g),使用CSF1R單克隆抗體阻斷導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的大量消減和 TAM在腫瘤中的浸潤,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的耗竭完全消除Siglece基因缺陷小鼠的腫瘤生長抑制(圖4j)。將骨髓衍生巨噬細(xì)胞(BMDMs)轉(zhuǎn)移到腫瘤小鼠體內(nèi),評估腫瘤生長和小鼠存活率。發(fā)現(xiàn)移植的Siglece-/- BMDMs阻礙WT 腫瘤小鼠的腫瘤生長,并延長小鼠的存活時間,復(fù)制Siglece-/-小鼠腫瘤生長受阻和存活時間延長的現(xiàn)象(圖4k、l)。相反,與WT BMDCs相比,被轉(zhuǎn)移的Siglece-/-骨髓源性DCs(BMDCs)對腫瘤生長沒有不同的影響(圖4m,n)。這些結(jié)果表明,在小鼠GBM模型中,表達(dá)Siglece的巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)腫瘤根除的主要細(xì)胞群。


圖4. SIGLEC9+巨噬細(xì)胞與不良臨床結(jié)局有關(guān),Siglece基因缺失阻礙小鼠GBM模型腫瘤的生長 


8. Siglece基因缺失激活巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞
       利用scRNA-seq分析評估Siglece-/-小鼠的顱內(nèi)腫瘤微環(huán)境(圖5a)。觀察到 Siglece-/-小鼠腫瘤中的免疫細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞和DCs大量增加(圖5b)。巨噬細(xì)胞增加參與抗腫瘤反應(yīng)的基因的表達(dá),包括趨化因子,如 Ccl3、Ccl4、Ccl5、Ccl7、Ccl8、Ccl9、Cxcl9和Cxcl10,它們能招募和激活細(xì)胞溶解性T細(xì)胞,以及IFN-γ刺激基因,如Isg15(圖5c,d)。與WT腫瘤相比,體內(nèi)Siglece-/-腫瘤中T細(xì)胞表達(dá)更高水平的Il2、Il17a和Ifng(圖5d)。流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(FACS)分析顯示,與 WT 相比,Siglece 基因缺失后,CD45+細(xì)胞、骨髓細(xì)胞(CD11b+、F4/80+、Ly6C+和DCs)和淋巴細(xì)胞(CD4+T、CD8+T 和NK細(xì)胞)的浸潤明顯增加(圖5e),這與scRNA-seq分析結(jié)果一致。皮下腫瘤的實時PCR分析也驗證了這些結(jié)果(圖5f)。接下來,分析了瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)Siglece-/-巨噬細(xì)胞中CD80和MHC-II等活化標(biāo)記物的表達(dá)增加(圖5g)。與WT BMDMs相比,將Siglece-/- BMDMs與CT2A細(xì)胞共培養(yǎng)顯著增加趨化因子的表達(dá),包括Ccl4、Ccl8和Cxcl9(圖5h)。當(dāng)與CT2A細(xì)胞共培養(yǎng)時,BMDMs中Siglece的缺失顯著增加Il4和Il10的表達(dá)(圖5i)。雖然Siglece缺失增加Pd-l1的表達(dá),但與WT BMDMs共培養(yǎng)后,Pd-l1的表達(dá)仍與WT BMDMs 相似(圖5i)。Siglece-/- BMDMs分別顯著增加來OT-II或OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖比例(圖5j,k)。來自Siglece基因缺失小鼠的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TILs)也顯示出CD107a、IFN-γ和Ki67等活化標(biāo)志物的表達(dá)增加(圖 5l)。此外,在WT小鼠皮下腫瘤生長過程中,發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞上Siglec-E的表達(dá)增加,而DC上的表達(dá)卻沒有增加(圖5m)。這一結(jié)果進(jìn)一步支持了負(fù)反饋環(huán)的存在,在負(fù)反饋環(huán)中,Siglece可防止免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng),并作為巨噬細(xì)胞的免疫檢查點。


圖5. Siglece基因缺失導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞活化增強。


9. Siglece-/-與T細(xì)胞合作抑制腫瘤生長
       使用抗體特異性地清除WT小鼠和Siglece-/-小鼠皮下腫瘤中的CD4+或CD8+T細(xì)胞。Siglece-/-小鼠中消耗CD4+T細(xì)胞明顯降低腫瘤生長抑制作用,導(dǎo)致腫瘤生長率與WT小鼠相似(圖6a)。在Siglece-/-或WT小鼠中消耗CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致Siglece缺失型小鼠無法抑制腫瘤生長,而與WT小鼠相比加速腫瘤生長,這表明Siglec-E可能以CD8+T細(xì)胞細(xì)胞毒性依賴的方式介導(dǎo)腫瘤排斥反應(yīng)(圖6b)。這些結(jié)果表明,靶向Siglece減輕Siglece+TAMs的免疫抑制屬性,而這種屬性是由CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的。
10. SIGLEC9+TAMs直接與GBM中的T細(xì)胞相互作用
       將WT或Siglece-/-BMDMs共同培養(yǎng)并評估T細(xì)胞遷移(圖6c)。與WT BMDMs相比,Siglece-/- BMDMs顯著增強CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的遷移(圖6d)。這些結(jié)果表明,SIGLEC9+/Siglece+巨噬細(xì)胞直接招募T細(xì)胞。對ST 數(shù)據(jù)中CD68+SIGLEC9+細(xì)胞與T細(xì)胞特征的共定位分析表明,應(yīng)答者樣本中的 TH1和共刺激特征有所增加(圖6e、f)。多重IHC顯示,與非應(yīng)答者樣本相比,應(yīng)答者樣本中CD68+Siglec-9+細(xì)胞與CD8+PD-1+T細(xì)胞的空間距離更近(圖6g,h)。scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示,SIGLEC9+TAMs通過各種基因?qū)εcT細(xì)胞廣泛相互作用,如CCL4-CCR5、CCL3-CCR5、SPP1-CD44、SPP1-CC8、CD40-CD40LG和4-1BBL-4-1BB(圖6j)。在小鼠GBM中也發(fā)現(xiàn)了這些相互作用,而且Siglece 缺失會增強這些相互作用,支持它們是Siglec-9/Siglec-E依賴性相互作用的觀點(圖6k)。


圖6. 靶向Siglece+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞合作抑制腫瘤生長,且Siglece+/SIGLEC9+巨噬細(xì)胞與T細(xì)胞在空間上相關(guān)


11. Siglece基因缺失提高抗PD-1/PD-L1療法的療效
       WT或Siglece -/-小鼠顱內(nèi)接種CT2A膠質(zhì)瘤細(xì)胞,用抗PD-1或抗PD-L1抗體治療(圖7a)。與不進(jìn)行治療、單獨進(jìn)行Siglece基因缺失和單獨進(jìn)行PD-1/PD-L1阻斷治療相比,Siglece基因缺失與抗PD-1或抗PD-L1抗體相結(jié)合可顯著延長生存期(圖7b,c)。用由Siglec-E細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與小鼠IgG2a Fc結(jié)構(gòu)域融合而成的重組蛋白(Siglec-E-Fc)治療顱內(nèi)腫瘤小鼠,與IgG治療相比,小鼠存活時間延長(圖7d,e)。Siglec-E-Fc可與腫瘤細(xì)胞膜上的唾液酸化蛋白或游離的唾液酸化蛋白結(jié)合,從而與巨噬細(xì)胞上的內(nèi)源性Siglec-E競爭,阻斷Siglec-E信號傳導(dǎo)(圖7f)。


圖7. Siglece缺失增強ICB療法的療效,Siglece是治療GBM的潛在治療靶點


結(jié)論
       綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Siglec-9是一種新穎的巨噬細(xì)胞免疫檢查點分子,可以作為靶點提高抗PD-1/PD-L1治療GBM的療效,為GBM的治療提供了新的思路。

實驗方法
小鼠GBM模型構(gòu)建,ICB處理,治療性Siglec-E-Fc競爭實驗,流式細(xì)胞術(shù),胞內(nèi)細(xì)胞因子染色,細(xì)胞培養(yǎng),Transwell,RT-qPCR,人體組織芯片免疫染色和分析,多重免疫熒光,scRNA-seq文庫構(gòu)建,差異基因表達(dá)(DGE)分析,基因本體(GO)分析,單細(xì)胞熵值分析,單細(xì)胞軌跡構(gòu)建,細(xì)胞互作評估,拷貝數(shù)變異(CNV)檢測,細(xì)胞亞群的組織富集,空間轉(zhuǎn)錄組文庫制備,bulk RNA-seq
參考文獻(xiàn)
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