肺癌是一種常見的惡性腫瘤，是全球癌癥相關死亡率的主要原因。非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的85%。NSCLC患者臨床預后較差，總體5年生存率為15%。靶向治療的出現使NSCLC的治療取得了顯著進展，然而患者不可避免地會出現耐藥。因此，需要基于生物標志物的新靶點。Kremen2是一種由473個氨基酸組成的單跨膜結構域蛋白，是經典Wnt信號通路的重要調節因子。有研究報道，根據癌癥基因組圖譜（TCGA）分析，在來自18種不同癌癥類型的70%以上組織樣本中，腫瘤組織中的Kremen2表達水平顯著高于配對的正常組織，尤其是在Kremen2表達水平比高10倍以上的鱗狀肺癌中。然而，其在NSCLC中的生物學功能和臨床意義尚不明確。表皮生長因子受體（EGFR）是一種受體酪氨酸激酶，是目前公認的治療NSCLC的有效靶點。EGFR的異常活化被認為是惡性轉化和腫瘤轉移的主要原因。多種機制可誘導EGFR的致癌激活，如基因突變、轉錄過表達和EGFR降解缺陷。多項研究表明，EGFR的穩定性是調節肺癌進展的重要決定因素，EGFR降解失調加速了腫瘤的發生和進展。SOCS蛋白家族是眾所周知的細胞因子受體信號轉導的負調控因子。SOCS3是SOCS蛋白家族的成員，通過抑制JAK/STAT信號通路發揮腫瘤抑制作用。敲除SOCS3會破壞E3連接酶復合物的形成，并驅動整合素β1介導的小細胞肺癌轉移。在之前的研究中，SOCS3主要是基于其甲基化沉默導致功能喪失而在NSCLC中進行評估。該研究發表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.3。
技術路線

主要研究結果
1. Kremen2在非小細胞肺癌中表達上調，并與不良預后相關
       為了尋找新的與NSCLC相關的致癌基因，作者在TCGA數據庫中檢索了504例有病理信息的肺腺癌樣本，并篩選出57對配對的非癌和癌樣本。進一步分析這些配對患者樣本的RNA-seq結果，并使用一般線性模型（P<0.05）篩選差異表達基因（DEGs）（圖1A）。分析顯示，Kremen2的表達存在顯著差異，這在肺癌中尚未被研究過。此外，比較每對TCGA樣本的原始Kremen2 RNA-seq數據后，腫瘤組織中的Kremen2表達水平較高（圖1B）。采用GEPIA軟件分析Kremen2在NSCLC中的表達。結果顯示，與癌旁正常肺組織相比，在NSCLC組織中，尤其是肺鱗狀細胞癌組織中，Kremen2表達顯著上調（圖1C）。
為了評估Kremen2在NSCLC臨床標本中的表達，作者檢測了新鮮冷凍的NSCLC標本及其配對的正常組織中Kremen2 mRNA的水平。結果顯示，與正常組織相比，NSCLC組織中Kremen2 mRNA水平顯著升高（圖1D）。蛋白質印跡法檢測到大多數NSCLC標本中Kremen2蛋白水平升高（圖1E）。免疫組織化學染色進一步顯示，腫瘤組織中Kremen2高表達（圖1F）。此外，作者檢測了一些NSCLC細胞系中的Kremen2蛋白水平，發現在NSCLC細胞中Kremen2蛋白表達普遍較高（圖1G）。
       為了闡明Kremen2過表達與NSCLC患者生存的相關性，作者使用Kaplan-Meier plotter數據庫分析NSCLC病例。結果如圖1H和I所示，表明高Kremen2表達水平的NSCLC患者與較差的總生存期（OS）相關，如較低的OS和首次進展生存期（P<0.05）。卡方檢驗顯示，Kremen2表達上調與原發腫瘤（T）分期（P=0.041）和病理分級（P=0.045）相關。綜上所述，這些數據表明，Kremen2在NSCLC中過表達，并且Kremen2過表達可能與患者的不良預后相關。

圖1 Kremen2在非小細胞肺癌中表達上調，并與不良預后相關

2. 沉默NSCLC細胞中Kremen2表達可抑制細胞增殖
       為了研究Kremen2在NSCLC中的生物學功能，作者利用CRISPR/Cas9方法產生敲除Kremen2的A549細胞（A549-krm2ko），其中插入胸腺嘧啶殘基導致移碼突變。通過克隆形成實驗和EdU摻入實驗檢測Kremen2對A549和A549-krm2ko細胞增殖的影響。A549-Krm2KO細胞的克隆形成能力低于野生型細胞（圖2A），EdU陽性細胞顯著減少，表明細胞增殖能力下降，而在A549-Krm2KO細胞中過表達外源性Flag-Kremen2（Flag-Krm2）時，edu陽性細胞比例增加（圖2B），證實了Kremen2對細胞增殖的影響。此外，作者利用慢病毒介導的shRNA沉默內源性Kremen2表達，建立了穩定沉默Kremen2的NSCLC細胞株。同樣，A549和H1703細胞（shKrm2）中的Kremen2敲低抑制了集落形成和細胞增殖能力（圖2D-F）。通過皮下注射穩定敲低Kremen2的A549細胞建立裸鼠移植瘤模型，驗證這些體外發現是否與體內腫瘤生長相關。在A549異種移植模型中獲得了一致的結果，敲低Kremen2的表達顯著抑制了腫瘤的大小和重量（圖2G-I）。IHC染色顯示，由于A549細胞的Kremen2敲低，A549種植小鼠組織中的ki67陽性細胞百分比較低（圖2J）。綜上所述，這些數據表明，Kremen2在NSCLC細胞生長中發揮重要作用。

圖2 沉默NSCLC細胞中內源性Kremen2表達可抑制細胞增殖

3. Kremen2高表達促進NSCLC細胞轉移
       臨床資料顯示，Kremen2的表達與LUAD患者病理分級呈正相關，提示Kremen2可能參與了腫瘤的轉移。為了解決這一問題，作者檢測了體內外Kremen2對腫瘤細胞轉移能力的影響。Transwell實驗結果顯示，在A549細胞中，敲除Kremen2可減弱細胞的侵襲能力，而在A549-krm2ko細胞中過表達Flag-Krm2可增強細胞的侵襲能力（圖3A）。同樣，通過shRNA下調Kremen2表達后，H1703和A549細胞的侵襲數量減少（圖3B，C）。此外，來自傷口愈合實驗的數據表明，敲低Kremen2降低了細胞遷移（圖3D-G）。通過實時熒光定量PCR檢測沉默Kremen2后NSCLC細胞中上皮-間充質轉化（EMT）標志物的變化，探討其對NSCLC細胞EMT的抑制作用。Kremen2敲低和低pro-EMT Snail1和Twist1水平之間存在明顯的正相關。為了進一步了解Kremen2在體內是否促進腫瘤轉移，作者對A549-Krm2KO細胞和A549-Krm2KO + OE-Krm2細胞（A549-Krm2KO細胞過表達Kremen2）進行了尾靜脈轉移實驗。結果顯示，刪除Kremen2減少了肺轉移結節的數量，而過表達Kremen2顯著增加了肺轉移結節的數量（圖3H-J）。為了更好地觀察肺內轉移結節的形成，作者在A549細胞中構建了共表達GFP的shCtrl和shKrm2細胞，觀察細胞的熒光強度（圖3K和L）。將兩種表達GFP的細胞注射到裸鼠尾靜脈。HE染色和熒光信號結果顯示，在A549細胞中下調Kremen2與對照組相比，肺轉移結節數量減少（圖3M-O）。綜上所述，這些發現表明，Kremen2是NSCLC轉移的促進因子。

圖3 體內外實驗顯示，Kremen2促進NSCLC細胞轉移

4. Kremen2參與多種癌癥相關信號通路
       為了闡明Kremen2促進肺癌發生的機制，采用RNA-seq比較H1703細胞中對照組和Kremen2敲低（shKrm2）組的轉錄組變化。根據表達的倍數變化（≥1或≤-1），shKrm2組中共鑒定出273個上調基因和281個下調基因。對上調和下調基因進行層次聚類分析（圖4A）。GO分析表明，DEGs與細胞增殖、發育、運動和遷移密切相關（圖4B）。KEGG富集分析表明，這些DEGs富集在與癌癥相關的信號通路，如MAPK、Wnt和PI3K-AKT信號通路（圖4C）。由于之前的Kremen2研究多集中在Wnt信號通路，作者首先檢測到了Wnt信號通路中關鍵蛋白表達的變化。蛋白質印跡結果顯示，敲低Kremen2并沒有顯著影響β-catenin蛋白水平，但增加了H1703細胞中LRP6的總蛋白和磷酸化水平（圖4D），可能是由于LRP6的內吞降解減少。此外，在H1703細胞中敲低Kremen2后，PI3K（Y607）和AKT（Ser473）的磷酸化水平顯著下調（圖4E），這與在胃癌中對Kremen2的研究結果一致。
       由于STAT3信號通路的激活已經在相當比例的NSCLC病例中被報道，作者也測試了Kremen2是否調節STAT3信號通路。蛋白質印跡結果顯示磷酸化JAK2（Y1007和Y1008）和STAT3（Y705）水平下調，而總JAK2和STAT3水平無變化。與此同時，STAT3通路中負責調節細胞增殖的下游因子c-Myc和Cyclin D1蛋白水平也顯著降低（圖4F和G）。相反，過表達Kremen2增強了p-JAK2、p-STAT3、c-Myc和Cyclin D1蛋白水平（圖4H），表明Kremen2影響了JAK2-STAT3信號通路。

圖4 抑制Kremen2參與多種癌癥相關信號通路

5. Kremen2通過穩定EGFR促進NSCLC細胞增殖
       考慮到EGFR是JAK2-STAT3和PI3K-AKT信號通路的上游共同激活因子，在NSCLC的進展中發揮重要作用，作者將從shKrm2 H1703細胞中篩選的DEGs輸入FunRich軟件進行功能分析。結果顯示大多數基因聚集在EGFR相關通路上。然后，作者檢測了Kremen2是否影響EGFR蛋白水平。蛋白質印跡結果表明，siRNA介導沉默Kremen2可下調A549和H1703細胞中的EGFR蛋白水平（圖5A）。在Kremen2穩定敲低的細胞中，EGFR蛋白水平也降低，而過表達Kremen2增加了EGFR蛋白水平（圖5B）。作者在A549-Krm2KO細胞中獲得了類似的結果。將Flag-tagged Kremen2重新引入A549-Krm2KO細胞中可恢復EGFR蛋白水平（圖5C）。如圖5D所示，蛋白酶體抑制劑MG132逆轉了Kremen2敲除細胞中EGFR蛋白水平的下降，表明Kremen2可能通過蛋白酶體降解來調節EGFR蛋白水平。作者進一步研究了敲低Kremen2是否影響EGF刺激后EGFR的磷酸化。結果顯示，沉默Kremen2降低了A549和H1703細胞中EGF誘導的EGFR、STAT3和AKT的磷酸化（圖5E）。為了評估Kremen2是否通過調節EGFR促進細胞增殖，作者在過表達Kremen2的A549細胞中去除內源性EGFR，觀察到抑制內源性EGFR的表達減弱了Kremen2誘導的細胞增殖（圖5F）。相反，在Kremen2敲低的A549細胞中過表達EGFR表明外源性EGFR表達促進了Kremen2敲低細胞的增殖（圖5H）。綜上所述，這些數據表明，在NSCLC中，Kremen2的高表達水平可能通過維持EGFR的穩定性促進腫瘤進展。

圖5 Kremen2通過促進EGFR的穩定促進NSCLC細胞增殖

6. Kremen2和SOCS3的相互作用可抑制EGFR的泛素化和降解
       為了了解Kremen2是如何調控EGFR的，作者使用co-IP來下調參與EGFR信號通路的Kremen2相互作用蛋白。令人驚訝的是，Kremen2不與EGFR、AKT或STAT3蛋白相互作用，但與STAT3信號通路的負調控因子SOCS3強相關（圖6A）。此外，在A549細胞（圖6B）中觀察到內源性Kremen2和SOCS3共定位。在變性條件下純化外源性SOCS3，然后對Kremen2進行免疫印跡分析，證實了Kremen2和SOCS3之間的相互作用（圖6C）。接下來，作者分別在A549和A549-oe-krm2細胞中過表達SOCS3，以探索SOCS3在Kremen2和EGFR之間關系中的作用。如圖6D所示，過表達外源性SOCS3降低了A549細胞中EGFR蛋白水平和STAT3的磷酸化水平，而穩定過表達Kremen2部分逆轉了這一現象（圖6D）。
       此外，SOCS3過表達細胞中EGFR水平的下降被蛋白酶體抑制劑MG132逆轉，表明SOCS3通過蛋白酶體降解調節EGFR水平（圖6E）。為了進一步研究SOCS3是如何調控EGFR的，作者用cicloheximide處理細胞并檢測EGFR的半衰期。結果表明，過表達SOCS3可縮短EGFR蛋白的半衰期（圖6F）。接下來，作者對內源性蛋白進行了相互共IP。正如預期的那樣，內源性SOCS3與EGFR相互作用（圖6G），而內源性EGFR與SOCS3結合（圖6H）。這些結果表明SOCS3可以與EGFR結合并促進細胞中EGFR的降解。
       據報道，SOCS3可促進TBK1和整合素β1的泛素化和降解；因此，作者接下來研究了SOCS3對EGFR泛素化的影響。結果，與對照組相比，在A549細胞中過表達SOCS3增加了EGFR的多泛素化（圖6I）。為了進一步研究Kremen2是否影響SOCS3介導的EGFR泛素化，作者進行了體外泛素化實驗。在HEK293T細胞中，Flag-SOCS3和His-EGFR共表達，在變性條件下純化His-EGFR，隨后對EGFR進行免疫印跡分析，證明在SOCS3過表達細胞中外源性EGFR泛素化增加，而Kremen2過表達導致SOCS3對EGFR的多泛素化減少（圖6J）。
       綜上所述，這些數據表明，Kremen2與SOCS3相互作用，并通過阻止SOCS3介導的EGFR泛素化和降解來穩定EGFR蛋白；從而增強EGFR信號通路的活化，促進NSCLC細胞的增殖和轉移。

圖6 Kremen2與SOCS3的相互作用抑制EGFR的泛素化和降解

結論
       該研究證明了Kremen2在NSCLC腫瘤發生中的新作用。機制上，Kremen2可能通過與SOCS3相互作用，阻斷泛素依賴的EGFR降解，從而維持EGFR介導的腫瘤信號通路，促進NSCLC細胞的增殖和轉移。因此，Kremen2可能成為NSCLC新的治療靶點。
機制圖

實驗方法
免疫組織化學（IHC），菌落形成和EdU測定，流式細胞術，Transwell和傷口愈合測定，定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR），蛋白質印跡，免疫沉淀，免疫熒光，動物實驗
參考文獻
Sun Y, Gao Y, Dong M, Li J, Li X, He N, et al. Kremen2 drives the progression of non-small cell lung cancer by preventing SOCS3-mediated degradation of EGFR. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Jun 3;42(1):140.