索拉非尼是一種酪氨酸激酶抑制劑,在包括胃癌(GC)在內(nèi)的多種癌癥中作為鐵死亡誘導(dǎo)劑具有重要的抗腫瘤作用。然而,最近索拉非尼作為鐵死亡誘導(dǎo)劑的狀態(tài)受到質(zhì)疑。關(guān)于鐵死亡和ATF2之間關(guān)系的信息非常有限,且ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用尚未被研究。在本文中,作者探討了GC中ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中的作用及其相關(guān)分子機制。本文于2023年1月發(fā)表在《Redox Biology》IF:11.4期刊上。
技術(shù)路線
主要實驗結(jié)果
1、ATF2在胃癌中表達(dá)上調(diào)并預(yù)示不良預(yù)后
TCGA數(shù)據(jù)庫顯示與正常組比較,ATF2 mRNA表達(dá)在腫瘤中顯著上調(diào)(圖1A)。此外,與正常細(xì)胞系GES-1比較,GC細(xì)胞系中ATF2的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(圖1B),該結(jié)果被臨床12對癌與癌旁的檢測結(jié)果所驗證(圖1C)。使用IHC檢測了107例GC組和22例正常組織中ATF2的表達(dá),代表性圖像見圖1D,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GC組織中61.7%的樣本ATF2高表達(dá),而癌旁中63.6%的樣本ATF2低表達(dá)(圖1E)。結(jié)合患者預(yù)后的生存分析顯示ATF2高表達(dá)組的總體生存期顯著下降(圖1F)。KM數(shù)據(jù)庫得出了類似的結(jié)論(圖1G)??傊?,ATF2在GC中表達(dá)上調(diào)并預(yù)示不良預(yù)后。
圖1 ATF2在GO中上調(diào)且預(yù)測不良預(yù)后
2、ATF2促進(jìn)GC細(xì)胞惡性表型
如圖2所示,在GC細(xì)胞中敲低ATF2后顯著抑制細(xì)胞的增殖遷移和侵襲,過表達(dá)ATF2則相反,表明ATF2促進(jìn)GC細(xì)胞惡性表型。
圖2 ATF2敲低抑制GC細(xì)胞惡性表型
3、索拉非尼誘導(dǎo)GC細(xì)胞鐵死亡
由于先前的研究表明索拉非尼誘導(dǎo)鐵死亡的不確定性,作者首先探究了索拉菲尼是否誘導(dǎo)GC細(xì)胞鐵死亡。如圖3A所示,索拉菲尼處理細(xì)胞24h后,AGS和MGC-803細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出收縮,變圓,排列松散,而同時使用鐵死亡抑制劑Fer-1處理則可反轉(zhuǎn)這種效果。與對照組相比,索拉非尼處理導(dǎo)致總細(xì)胞ROS和脂質(zhì)ROS均顯著增加(圖3B-C),并且導(dǎo)致MDA水平增加(圖3D),GSH水平下降(圖3E),然而Fer-1處理抑制上述效果。
圖3 索拉非尼誘導(dǎo)AGS和MGC-803細(xì)胞鐵死亡
鑒于鐵死亡與線粒體功能息息相關(guān),因此,作者進(jìn)一步檢測了索拉菲尼對MMP和線粒體形態(tài)的影響。JC-1染色結(jié)果顯示,與對照組比較,索拉菲尼顯著減低AGS和MGC-803細(xì)胞MMP(圖4A)。此外,TEM顯示索拉菲尼處理的MGC803細(xì)胞線粒體嵴明顯減少或缺失,線粒體膜密度增加(圖4B)。這些結(jié)果表明索拉非尼可以誘導(dǎo)GC細(xì)胞的鐵死亡。
作為一種關(guān)鍵的應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,ATF2在索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡中的表達(dá)變化尚不清楚。如圖4C所示,索拉非尼處理增加ATF2的表達(dá),尤其是磷酸化形式。免疫熒光顯示,索拉非尼刺激后ATF2在細(xì)胞核中的表達(dá)更高(圖4D)。因此,索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡可能會促進(jìn)ATF2的核轉(zhuǎn)位并增強ATF2在GC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性。
圖4 索拉非尼處理增加GC細(xì)胞中ATF2的表達(dá)并促進(jìn)其核易位
4、ATF2敲低抑制索拉菲尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡
如圖5A所示,敲低ATF2導(dǎo)致GC細(xì)胞的IC50下降,過表達(dá)則相反。此外,索拉菲尼和ATF2敲低均顯著增加細(xì)胞內(nèi)總ROS和脂質(zhì)ROS含量,而兩者同時進(jìn)行則進(jìn)一步促進(jìn)其增加,但是,索拉菲尼處理同時過表達(dá)ATF2則顯著回落ROS的水平(圖5B-C)。類似的,過表達(dá)ATF2可顯著逆轉(zhuǎn)因索拉菲尼處理引起的MDA增加(圖5D)和GSH下降(圖5E),以及線粒體形態(tài)改變(圖5F)。這些發(fā)現(xiàn)表明ATF2過表達(dá)抑制索拉非尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡。
圖5 ATF2敲低抑制索拉菲尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡
5、ATF2在GC細(xì)胞中激活HSPH1的轉(zhuǎn)錄
為進(jìn)一步闡明ATF2的潛在機制,進(jìn)行RNA-seq和ChIP-seq分析,以鑒定ATF2的全基因組DNA結(jié)合位點和潛在轉(zhuǎn)錄靶點。如圖6A所示,RNA-seq分析顯示,與對照組相比,MGC803細(xì)胞中ATF2敲除后,1059個基因上調(diào),370個基因下調(diào)。重要的是,RNA-seq數(shù)據(jù)的通路富集分析表明,ATF2敲除明顯影響鐵死亡通路(圖6B)。ChIP-seq共鑒定出24119個峰,對應(yīng)3641個RefSeq基因,其中2.88%位于啟動子-轉(zhuǎn)錄起始位點(圖6C)。在染色體上觀察到了不同的峰值,并掃描了峰值之間共享的motifs(圖6D和E)。
圖6 RNA-seq和ChIP-seq鑒定ATF2的全基因組DNA結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄靶點
然后對RNA-seq和ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉分析,篩選出222個受ATF2直接調(diào)控的候選轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)(圖7A)。其中,HSPH1在ATF2敲除后顯著下調(diào)(圖7B)。此外,在TCGA數(shù)據(jù)集中,HSPH1在GC中的表達(dá)與ATF2呈顯著正相關(guān)(圖7C)。如圖7D所示,ChIP-seq數(shù)據(jù)顯示在HSPH1的啟動子區(qū)域有明顯的ATF2結(jié)合峰。因此,推測HSPH1可能是ATF2的潛在靶基因。WB分析結(jié)果顯示,HSPH1在ATF2過表達(dá)后增加,而在ATF2敲除后減少(圖7E)。此外,ChIP-qPCR進(jìn)一步證實ATF2可以結(jié)合到HSPH1的啟動子區(qū)域(圖7F)。這些數(shù)據(jù)表明ATF2可以通過與HSPH1啟動子結(jié)合來激活HSPH1的表達(dá)。
圖7 ATF2與HSPH1啟動子結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄
6、HSPH1與SLC7A11結(jié)合并增加其穩(wěn)定性
鑒于一些研究報道了HSP蛋白在鐵死亡中的突出作用,作者試圖確定HSPH1是否可能影響SLC7A11在GC中的表達(dá)。首先查詢了GeneMANIA數(shù)據(jù)庫,其預(yù)測并顯示了HSPH1和SLC7A11之間潛在的相互作用(圖8A)。為驗證這一預(yù)測,進(jìn)行co-IP實驗,確定HSPH1與SLC7A11存在物理相互作用(圖8B)。接下來,采用siRNA敲除HSPH1的表達(dá)(圖8C),并將HSPH1 siRNA轉(zhuǎn)染到ATF2穩(wěn)定過表達(dá)的AGS細(xì)胞中。觀察到HSPH1的敲除降低了SLC7A11的蛋白表達(dá)水平,但沒有降低mRNA水平(圖8D)。因此,進(jìn)行了CHX試驗,以確定在HSPH1敲除或未敲除的情況下SLC7A11蛋白的半衰期。WB分析表明,與對照組相比,抑制HSPH1加速了AGS細(xì)胞中SLC7A11蛋白的降解(圖8E)。這些結(jié)果表明,HSPH1可以與SLC7A11相互作用,并至少部分地通過增加SLC7A11蛋白的穩(wěn)定性來增加其表達(dá)。
敲除HSPH1可以部分消除ATF2過表達(dá)對細(xì)胞ROS和脂質(zhì)ROS的影響(圖8F和G)。同樣,與HSPH1 siRNA共轉(zhuǎn)染可顯著逆轉(zhuǎn)ATF2過表達(dá)對鐵死亡細(xì)胞MDA和GSH水平的影響(圖8H和I)。這些結(jié)果為ATF2通過HSPH1調(diào)控索拉非尼誘導(dǎo)的GC細(xì)胞鐵死亡提供了證據(jù)。
圖8 HSPH1與SLC7A11結(jié)合并增加其穩(wěn)定性
7、ATF2敲低增加小鼠GC腫瘤對索拉菲尼的敏感性
最后,為評估ATF2單獨敲除和與索拉非尼聯(lián)合敲除對體內(nèi)GC的影響,建立了裸鼠異種移植模型(圖9A)。與對照組相比,穩(wěn)定敲除ATF2細(xì)胞形成的腫瘤體積更小,重量更輕,表明ATF2敲除可以有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長(圖9B)。此外,索拉非尼治療后,皮下腫瘤的體積和重量均顯著進(jìn)一步下降(圖9C和D)。表明ATF2敲除聯(lián)合索拉非尼治療對腫瘤生長的抑制作用最強。為更好地觀察潛在的鐵死亡,皮下腫瘤切片被4-HNE染色,4-HNE是一種敏感的脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物。IHC染色顯示sh-ATF2+索拉非尼組4-HNE表達(dá)最高(圖9E)。因此,ATF2敲除可增強索拉非尼對體內(nèi)GC的抗腫瘤作用。
圖9 ATF2敲低增加小鼠GC腫瘤對索拉菲尼的敏感性
總之,作者發(fā)現(xiàn)索拉非尼激活A(yù)TF2的表達(dá),并進(jìn)一步促進(jìn)HSPH1的表達(dá),減少SLC7A11蛋白的降解,從而導(dǎo)致了對脂質(zhì)過氧化的保護(hù)(圖10)。因此,以ATF2/HSPH1軸為靶點增強索拉非尼誘導(dǎo)的鐵變態(tài)反應(yīng)是一種有吸引力的GC治療策略。
圖10 圖像摘要
實驗方法
臨床收集福爾馬林固定石蠟包埋的GC樣本,細(xì)胞培養(yǎng),WB,qRT?PCR,免疫組織化學(xué)染色,細(xì)胞增殖曲線,半數(shù)抑制濃度(IC50)實驗,Transwell遷移和侵襲實驗,Calcein-AM/PI染色,細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)過氧化檢測,MDA和GSH檢測,線粒體膜電位(MMP)檢測,透射電鏡實驗(TEM),RNA測序,染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)測序,ChIP-qPCR,co-IP,蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實驗,小鼠腫瘤模型
參考文獻(xiàn)
Xu X, Li Y, Wu Y, Wang M, Lu Y, Fang Z, Wang H, Li Y. Increased ATF2 expression predicts poor prognosis and inhibits sorafenib-induced ferroptosis in gastric cancer. Redox Biol. 2023 Feb;59: 102564. doi: 10.1016/j.redox.2022.102564.