在約90%的胰腺導管癌癌（PDAC）患者中鑒定出KRAS突變，并且KRASG12D是PDAC中最常見的等位基因。靶向KRAS^G12D突變的基因療法在轉移性PDAC中實現了70%的消退，表明靶向KRAS^G12D在轉移性PDAC中的治療潛力。本文找到了一個新的circRNA，其在KRAS^G12DPDAC中上調，并且與KRAS^G12D PDAC淋巴結（LN）轉移正相關。在機制上，KRAS^G12D ?PDAC中的circARFGEF生物發生被選擇性剪接因子QKI-5顯著激活，促進了circARFGEF生物發生。并探討了circARFGEF海綿化miR-1205并促進JAK 2的活化，JAK2將STAT3磷酸化觸發KRAS^G12D PDAC淋巴管生成和LN轉移。本文于2023年6月，發表于《Cancer Research》上，IF=11.2。?

1.circARFGEF在LN轉移的KRAS^G12DPDAC中高表達

       為了研究circRNA是否參與KRAS^G12D驅動的LN轉移，在3個配對的PDAC組織和9個正常的鄰近組織（NAT）（GSE234760）中進行了二代測序，發現了circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC組織中最顯著上調，與具有其他KRAS亞型的PDAC組織相比（KRAS^G12C、KRAS^G12V、KRAS^WT）（圖1A和B）。此外，circARFGEF2 在LN陽性KRAS^G12D PDAC 患者或具有高度病理性腫瘤淋巴結轉移（TNM）階段的患者中過表達，并且與原發性腫瘤相比，轉移性LN具有更高的circARFGEF2 表達（圖1C和D）。原位雜交（ISH）和免疫熒光分析顯示，circARFGEF2過表達伴隨著KRAS^G12DPDAC組織中的微淋巴管密度（MLD）增加（圖1 E和F）。此外，熒光原位雜交（FISH）揭示了在LN陽性KRAS^G12D PDAC組織中的circARFGEF2富集，與LN陰性相比（圖1G和H），表明circARFGEF 2與KRAS^G12D PDAC的LN轉移正相關。Kaplan-Meier存活分析表明，在患有KRAS^G12D PDAC的患者中，circARFGEF2過表達與總存活（OS）和無病存活（DFS）呈負相關（圖1 I和J）。此外，在使用互補DNA（cDNA）而不是基因組DNA（gDNA）作為模板的PCR產物中檢測到circARFGEF 2（圖1 K）。與ARFGEF2 mRNA相比，circARFGEF2表現出對RNaseR的更強抗性，而Actinomycin D測定表明circARFGEF2具有比ARFGEF2 mRNA更長的半衰期（圖1 M和N）。總之，這些發現證明circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC患者中高表達且具有高度穩定的結構。

圖1：circARFGEF2在LN轉移的KRAS^G12D PDAC患者

2.QKI-5與circARFGEF2結合加速在circARFGEF2在LN轉移的KRAS^G12DPDAC中的生物合成
       用circRNA構建了6個雙色熒光報告子給予IRES介導的GFP翻譯，并將線性mRNA用mCherry標記以同時定量ARFGER2前體mRNA的線性和circRNA 剪接（圖2A）。在PANC-1細胞中應用KRAS^G12D抑制劑MRTX1133或KRAS^G12D siRNA后，由HA-mCherry表達指示的線性ARFGEF2增加，并且由FLAG-GFP表達指示的circARFGEF2形成以及GFP-mCherry比率顯著減少。而在Mia PaCa-2（KRAS^G12C）和BxPC-3（KRAS^WT）細胞中應用MRTX1133后未觀察到明顯變化（圖2B-D）。已經證明了QKI在circRNA生物發生中的關鍵作用。因此，在3對KRAS^G12D PDAC組織和NAT中進行二代測序以評估QKI是否調節KRAS^{G 12D} PDAC中的circARFGEF2生物發生，并確定QKI在KRAS^G12D PDAC組織中上調（GSE 234927）（圖2E）。雙色熒光報告基因測定顯示，下調QKI表達的顯著降低了GFP-mCherry比率（圖 2F和G），表明QKI是circARFGEF2生物發生所需的。雙色熒光報告測定和蛋白質印跡測定，并揭示降低QKI-5表達顯著降低FLAG-GFP表達，同時增加HA-mCherry表達（圖2H）。前體mRNA選擇性剪接通常由剪接體催化，剪接體的組裝與相關的蛋白輔因子相伴逐步發生。免疫共沉淀（Co-IP）測定，隨后質譜（MS）和蛋白質印跡鑒定出QKI-5與U2輔助因11（U2AF35）相互作用，直接觸發剪接體組裝以刺激剪接的U2AF亞基（圖2 I和J）。此外，降低U2AF35表達顯著阻礙QKI-5誘導的circARFGEF2生物發生（圖2K和L）。上述結果表明QKI-5募集U2AF35來調節ARFGEF2前體mRNA剪接，并促進circARFGEF2生物合成。為了證實ARFGEF2前mRNA上的精確QKI-5結合位點，我們用內含子3和6的截短序列進行了下拉測定，其揭示了QKI-5特別富集內含子3^{1000-1200 nt}和內含子6^{7600-7800 nt}（圖2 M和N）。內含子3^{1128-1180 nt}和內含子 6^{7672-7740 nt}的突變損害QKI-5和ARFGEF前mRNA結合，表明QKI-5 直接結合這兩個ARFGEF2前mRNA區域（圖2 O和P）。此外，我們評估了QKI-5和ARFGEF2前mRNA之間的相互作用是否影響PDAC中的circARFGE 2產生。CRISPR/Cas9介導的ARFGEF2前mRNA中內含子3^{1128-1180 nt}和內含子6^{7672-7740 nt}的敲除顯著降低了QKI-5介導的circARFGEF2過表達（圖2Q）?？傊?，我們的結果證明QKI-5募集U2AF35并結合內含子3^{1128-1180 nt}和6^{7672-7740 nt}的轉錄水平，以促進circARFGEF 2剪接（圖2R）。

圖2：QKI亞群結合至circARFGEF2剪接外顯子的側翼內含子，并加速KRAS^G12D PDAC中的circARFGEF2生物合成

3.增加circARFGEF2生物合成促進KRAS^G12D PDACLN轉移
       circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC細胞中下調抑制HLEC管形成和迀移能力，而circARFGEF2過表達促進KRAS^G12D PDAC細胞誘導的HLEC管形成和迀移（圖3A和B）。進一步評估QKI-5是否調節KRAS^G12D PDAC中的circARFGEF 2誘導的管形成和迀移，并且證明QKI-5過表達增強HLEC管形成和迀移能力，而下調circARFGEF2表達抑制QKI-5誘導的HLEC的淋巴管生成（圖3C）。QKI-5過表達顯著促進了KRAS^G12D PDAC細胞的LN轉移，而下調circARFGEF2的明顯逆轉了這種作用（圖3D）。原發性腫瘤的免疫組織化學（IHC）分析表明，降低circARFGEF2表達逆轉了由QKI-5上調誘導的MLD的增加（圖3E）。使用正電子發射斷層掃描-計算機斷層掃描18（PET-CT）掃描來評估裸鼠的原位致瘤性，發現QKI-5促進KRAS^G12D PDAC細胞的原位致瘤性，而當circARFGEF2下調時，這種作用受到阻礙（圖3F）。IHC結果顯示，QKI-5可顯著促進癌細胞向胰周淋巴結轉移，增加胰腺移植瘤模型中轉移淋巴結的數量，同時降低circARFGEF 2的表達可以逆轉這種效應（圖3G）。綜上所述，上述結果表明QKI-5介導的circARFGEF2促進體外KRAS^G12D PDAC淋巴管生成以及體內KRAS^G12D PDAC LN轉移。

圖3：QKI-5介導的circARFGEF2促進體外KRAS^G12D PDAC淋巴管生成以及體內KRAS^G12D PDAC LN轉移

4.circARFGEF2海綿化KRAS^G12D PDAC中的miR-1205

       研究circARFGEF2誘導KRAS^G12D PDAC LN轉移的機制。首先確定了circARFGEF2主要位于KRAS^G12D PDAC細胞的細胞質中（圖4A和4 B）。
       通過數據庫預測和驗證發現這些miRNA中，miR-1205最特異地在KRAS^G12D PDAC細胞系中過表達，而不是具有其他KRAS亞型的PDAC細胞系中過表達。RNA下拉測定揭示，與Oligo探針相比，在KRAS^G12D PDAC細胞而不是KRAS^WT PDAC細胞中，miR-1205被circARFGEF 2探針顯著富集（圖4C）。circARFGEF 2和miR-1205 序列的分析揭示了反向互補序列的存在（圖4D）。雙熒光素酶報告基因測定揭示miR-1205顯著降低circARFGEF2組的熒光素酶活性，而反向互補序列的突變削弱了這種作用（圖4 E），表明circARFGEF 2通過特異性序列海綿化miR-1205。此外，FISH測定證明circARFGEF2和miR-1205共定位在KRAS^{G 12D} PDAC細胞的細胞質中（圖4F），表明 circARFGEF2和miR-1205之間的相互作用。體外實驗表明，過表達circARFGEF2的觸發HLEC管形成和迀移，而過表達miR-1205的明顯逆轉了這種作用（圖4G）。綜上所述，結果表明circARFGEF2在KRAS^G12D PDAC細胞中充當miR-1205海綿。
       KEGG通路分析揭示JAK-STAT途徑是與circARFGEF2相關的最顯著富集的通路（圖4H）。JAK代表用于激活JAK-STAT途徑的核心組分，并且由JAK 1、JAK 2、JAK 3和TYK 2組成。隨后，檢測了JAK亞型的表達譜，發現JAK 2與KRAS^G12D PDAC細胞中circARFGEF 2的表達正相關（圖4I）。此外，miR-1205與KRAS^G12D PDAC細胞中的JAK2表達負相關（圖4J和K）。雙熒光素酶報告基因測定表明，miR-1205明顯降低JAK2 3′UTR熒光素酶構建體中的熒光素酶活性，而不是miR-1205結合位點中的突變序列（圖4L）。miR-1205過表達明顯抑制circARFGEF2誘導的JAK2表達，這表明 circARFGEF2充當miR-1205海綿以增加JAK2表達（圖4 M和N）。WB顯示circARFGEF2過表達促進JAK2表達和STAT 3磷酸化（圖4O），而circARFGEF2下調降低JAK2表達并抑制STAT 3磷酸化（圖4P）。

圖4：circARFGEF2海綿化KRAS^G12D PDAC中的miR-1205并激活KRAS^G12D PDAC中的JAK2-STAT3信號通路

5.JAK2-STAT3通路阻斷抑制circARFGEF 2誘導的KPC小鼠LN轉移

       circARFGEF2過表達顯著促進HLEC管形成和迀移能力，而JAK2-STAT3通路抑制劑WP1066顯著逆轉該作用（圖5A和B）。此外，體內實驗證明，與對照裸小鼠相比，circARFGEF2過表達裸小鼠具有更大的膝彎淋巴結轉移瘤，并且WP1066顯著阻礙circARFGEF2誘導的LN轉移（圖5C和D）。IHC分析顯示，circARFGEF2過表達促進膝彎LN的轉移，增加足墊腫瘤中的MLD，而抑制JAK 2-STAT3通路逆轉了這些作用（圖5E和F）。這些結果表明，circARFGEF2 通過JAK2-STAT3通路促進KRAS^G12D PDAC中的淋巴管生成和LN轉移。為了更好地理解circARFGEF2在體內KRAS^G12D PDAC LN轉移中的作用，使用工程化的轉基因Kras^G12D/+ Trp 53 ^{R172 H/+}Pdx-1-Cre（KPC）小鼠模型。結果表明circARFGEF2過表達顯著增加了原發性PDAC腫瘤體積，并且抑制JAK2-STAT3信號通路則逆轉了這種作用（圖6A和B）。此外， circARFGEF2過表達顯著增加了KPC小鼠中轉移性腹部LN的數量和原發性PDAC腫瘤中的MLD，而阻斷 JAK 2-STAT 3信號傳導途徑阻礙了這些作用（圖6C和D）。這些結果表明，阻斷JAK2-STAT3通路對CircARFGEF2誘導的KRAS^G12D PDAC的淋巴管生成和LN轉移表現出抑制作用。

圖5：JAK2-STAT3通路阻斷抑制circARFGEF 2誘導的KPC小鼠LN轉移

6.KRAS^G12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2軸的臨床相關性

       評估 QKI-5介導的circARFGEF2-miR-1205-JAK2軸在患有KRAS^G12D PDAC的患者中的臨床意義。結果表明，與NAT相比，miR-1205在KRAS^{G 12D} PDAC組織中下調，并且circARFGEF2、QKI-5、JAK2在KRAS^G12D PDAC組織中上調（圖6 E和F）。此外，miR-1205與LN轉移負相關，而circARFGEF 2、QKI-5和JAK2在LN轉移性KRAS^G12D PDAC組織中顯著上調（圖6 G和H）。IHC分析顯示，QKI-5和JAK2與KRAS^G12D PDAC組織中的circARFGEF2表達正相關（圖6 I-K）。相關性分析揭示JAK2與miR-1205表達負相關，而與QKI-5表達正相關，并且在circARFGEF2和miR-1205表達之間觀察到負相關（圖6L和M）?？傊@些研究結果表明，來源于QKI-5依賴性剪接的circARFGEF2海綿化miR-1205并激活JAK2-STAT3信號傳導通路以誘導KRAS^G12D PDAC LN轉移。

圖6：KRAS^G12D PDAC患者中QKI-5-circARFGEF 2-JAK 2軸的臨床相關性

結論
       總之，本文提出了KRAS^G12D突變驅動的 circARFGEF2生物合成的新機制，其經由QKI-5依賴性剪接介導miR-1205-JAK2-STAT3軸以觸發PDAC LN轉移。抑制circARFGEF2表達或JAK2-STAT3通路顯著阻礙了KPC模型中的腫瘤生長。這些發現使得能夠對PDAC LN轉移中的調節機制有新的理解，表明circARFGEF2是KRAS^G12D PDAC中的潛在治療靶標。

實驗方法
臨床樣本收集，RNA測序和數據分析，免疫組化，膝彎淋巴結轉移模型，體外移植瘤模型， Kras^G12D/+Trp53^R172H/+Pdx-1-Cre (KPC)小鼠注射AVV載體，質粒和siRNA轉染，CRISPR/Cas9介導的基因敲除，熒光原位雜交實驗，瓊脂糖凝膠電泳，RNase R消化和Actinomycin D處理實驗，RNA下拉實驗，Transwell，管形成實驗，5-EDU實驗，雙熒光素酶實驗，WB，RT-qPCR，亞細胞分離試驗。
參考文獻
Kong, Y., Luo, Y., Zheng, S., Yang, J., Zhang, D., Zhao, Y., Zheng, H., An, M., Lin, Y., Ai, L., Diao, X., Lin, Q., Chen, C., & Chen, R. (2023). Mutant KRAS mediates circARFGEF2 biogenesis to promote lymphatic metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma. Cancer research, CAN-22-3997. Advance online publication. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3997