????
        HBV感染的綜合免疫景觀是實現HBV治愈的關鍵，但目前尚未完全了解HBV感染患者的免疫特征。本文對23個人的46個配對肝臟和血液樣本的243 000個細胞進行了單細胞RNA測序，其中包括6個免疫耐受者、5個免疫活性者（IA）、3個急性恢復者（AR）、3個慢性解決者和6個無HBV健康對照者（HC）。流式細胞儀和組織學檢測被應用于第二個HBV隊列進行驗證。基于此，作者剖析了不同HBV感染階段的協調免疫反應，為全面了解免疫發病機制和開發有效的治療策略提供了豐富的資源。本文于2023年1月發表在《Gut》IF：24.5期刊上。

技術路線

主要實驗結果
1、HBV感染患者的單細胞免疫景觀
       為更好地了解HBV感染者內部和之間的異質性，應用scRNA-seq來描述IT、IA、AR和CR期個體的肝內免疫細胞以及外周血單核細胞（PBMCs）的轉錄組狀態（圖1A）。作為對照，對從肝移植捐贈者（HCs）那里獲得的外周血和正常肝臟組織進行分析。詳細的臨床和病理信息，包括HBV診斷以來的時間、HBsAg水平、HBV DNA水平、ALT和AST，見表1。
經過質量控制和過濾，獲得了23個人的243 000個單細胞的轉錄組。確定了八個主要的細胞集群，包括CD4+T細胞（CD3D+CD4+）、CD8+T細胞（CD3D+CD8A+）、γδT細胞（CD3D+TRDC+）、NKT樣細胞（CD3E+KLRF1+）、NK細胞（GNLY+NKG7+）、B細胞（MZB1+CD79A+）、漿B細胞（MZB1+CD38+）和骨髓細胞（LYZ+CD14+）（圖1B）。總共確定了10個CD4+T細胞亞群，12個CD8+T細胞亞群，9個γδT細胞亞群，1個NKT樣細胞亞群，7個NK細胞亞群，7個B細胞亞群，3個漿B細胞亞群和11個髓細胞亞群（圖1B）。根據前排10差異表達基因（DEGs），確定了60個集群中每個集群的獨特標志物（圖1C）。
       這些細胞群顯示出不同的組織來源和在疾病階段的富集（圖1D）。為研究不同疾病階段的獨特的免疫譜，分析了每個人的免疫細胞組成。發現CD4+和CD8+T細胞在IA和AR期的肝臟中都很豐富，這兩個階段的特點是肝臟炎癥水平升高。骨髓細胞在IT期和IA期的肝臟中顯示出優先富集，表明在慢性HBV感染期間骨髓細胞區系發生了改變。γδT細胞和B細胞在CR期的肝臟中增加，這意味著慢性感染對這些細胞的潛在長期影響與已解決的HCV感染相似。值得注意的是，CD8+T和骨髓細胞在不同疾病階段的趨勢在肝臟和血液之間是一致的（圖1E）。這些結果表明，HBV感染者的每個疾病階段可能與一個獨特的免疫特征有關。

圖1 肝臟和血液中免疫細胞的單細胞轉錄組圖譜

2、HBV感染患者中Tex的擴增和MAIT細胞的缺失
       如圖2A所示，再次聚類CD8+T細胞產生了12個亞群。為了解CD8+T細胞群的潛在發展轉變，應用基于分區的圖抽象（PAGA）分析來構建12個CD8+T集群的發展軌跡。CD8T_c11-SLC4A10細胞作為一個獨特的群體在軌跡之外脫穎而出，與MAIT細胞的注釋一致。對于其他CD8+T細胞亞群，Tex（CD8T_c08-LAYN）和Temra（CD8_C03-CX3CR1）亞群被描述為兩個不同的分支（圖2B）。RNA速度分析進一步支持了Tex和Temra的這種發展特征（圖2C）。
       此外，每個亞群都顯示出不同的組織偏好：CD8T_c01-LEF1、CD8T_c02-SELL、CD8T_c03-CX3CR1、CD8T_c05-GZMK-GPR183和CD8T_c09-ACTN1集群主要來自血液，而CD8T_c04-GZMK-SIRPG、 CD8T_c06_GZMK-IFNG、CD8T_c07-GZMK-PDCD1、CD8T_c08-LAYN、CD8T_c10-BACH2和CD8T_c11-SLC4A10集群主要存在于肝臟（圖2D，E）。12個CD8+T細胞亞群顯示出階段性的異質性（圖2F）。在CD8+T亞群中，所有四組HBV感染者的肝臟中MAIT群體明顯減少，其中IA組最低（圖2G）。這些結果與此前的報道一致，該研究報告了HBV相關HCC患者肝臟MAIT細胞的損失。令人震驚的是，CR中的MAIT細胞比例未能恢復到HC的水平（圖2G），盡管這些患者已經HBsAg損失超過8個月，這表明HBV感染引起的肝內MAIT的損失是持久的。值得注意的是，CD8T_c08-LAYN細胞的比例在IT、IA和AR患者中有所增加（圖2H），其中IA患者的CD8T_c08-LAYN細胞也顯示出最高的衰竭得分（圖2H）。
       由于從scRNA-seq中捕獲了TCR序列，這使作者能夠通過以前開發的生物信息學指標，即通過RNA測序和TCR追蹤（STARTRAC）指數來追蹤T細胞的動態，如克隆擴張（expa）、遷移（migr）和發育過渡（tran）（圖2I）。STARTRAC-expa指數顯示，CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c08-LAYN表現出高度的克隆性擴張，主要是在AR和IA階段。CD8T_c03-CX3CR1在AR患者中的擴展程度更高，而CD8T_c08-LAYN在IA患者中的擴展程度更高（圖2J）。STARTRAC-tran分析表明，CD8T_c08-LAYN與GZMK+亞群高度相關，包括CD8T_c07-GZMK-PDCD1、CD8T_c04-GZMK-SIRPG和CD8T_c06_GZMK-IFNG。與AR患者相比，IA患者的CD8T_c08-LAYN與CD8T_c06_GZMK-IFNG聯系更緊密，但與CD8T_c03-CX3CR1聯系不緊密（圖2K），表明IA和AR患者的CD8+T細胞來源不同。STARTRAC-migr分析顯示CD8T_c08-LAYN顯示中度的流動性，與腫瘤中的觀察相似。然而，與IA患者相比，AR患者的衰竭T細胞表現出更高的STARTRAC-migr分數（圖2L）。總之，IA和AR患者的Tex細胞表現出動態差異。

圖2 CD8+ T細胞亞群的免疫學特征

3、IT和IA患者的肝內調節性CD4+T細胞增加
       如圖3A所示，共鑒定了10個CD4+T細胞群。PAGA軌跡分析顯示，CD4+T細胞有四種不同的命運，其中CD4T_c02-ANXA2、CD4T_c03-GNLY、CD4T_c04-FOXP3和CD4T_c06-TIMP1是不同的終點（圖3B）。朝向效應器和調節子集的進化方向也被RNA速度分析所證實（圖3C）。組織偏好分析顯示，CD4T_c05-CCR7、CD4T_c07-TIMP1、CD4T_c08-GZMK、CD4T_c09-CTLA4和CD4T_c10-CXCL13聚集在肝臟，其余五個亞群主要存在于血液中（圖3D，E）。
       然后比較了不同組別中CD4+T細胞（圖3F）中的CD4+T細胞亞群的分數。在這些CD4+T亞群中，CD4T_c10-CXCL13亞群在AR患者的肝臟CD4+T細胞（圖3G）中被富集。此外，在IT和IA患者的肝臟CD4+T細胞（圖3H）中，CD4T_c09-CTLA4，也被稱為肝臟駐留調節性T細胞（Treg）亞群，有所增加。此外，各階段CD4T_c09-CTLA4細胞的調節效應器得分分析顯示，IT和IA患者的調節效應器功能水平很高（圖3H）。這些結果表明，Treg細胞的免疫調節可能與CHB的免疫耐受和病毒持久性有關。

圖3 CD4+ T細胞亞群的免疫學特征及其與CD8+ T細胞的相互作用

4、Treg和Tex細胞之間潛在的細胞間相互作用
       使用細胞空間組織圖（CSOmap），一個推斷組織空間組織和細胞相互作用分子決定因素的生物信息學工具，作者估計了CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群在計算構建的偽空間中的細胞相互作用潛力。在IT和IA階段，發現Treg（CD4T_c09-CTLA4）和Tex（CD8T_c08-LAYN）之間有明顯的相互作用（圖4A）。值得注意的是，Tex和Treg在IT和IA患者的肝臟中被協調性地擴展（圖2H）。通過多色免疫組化（IHC）染色，進一步證實了IT和IA患者中Tex（CD8+PD-1+）和Treg（CD4+FOXP3+）細胞之間的相鄰空間關系（圖4B）。
       然后，比較了在IT和IA患者中促成Treg-CD8 Tex相互作用的潛在配體-受體（L-R）對的強度。發現幾個L-R對，CD44_VIM、HLA-B_CANX、TNFRSF1A_LTB和CD74_APP，在IT期顯示出較高的相互作用潛力，而HLA-A_APLP2、KLRD1_HLA和KLRD1_HLA-E在IA期顯示出較高的相互作用潛力（圖4C、D）。最近有報道說HLA-B_CANX軸能夠抑制T細胞的抗腫瘤免疫。由VIM基因編碼的Vimentin是Treg活性的關鍵代謝和功能控制器，而CD44免疫檢查點控制CD8+T細胞的激活。此外，HLA-E_KLRD1信號參與介導慢性HBV和HCV感染的T細胞功能障礙和病毒持久性。總之，這些數據為今后有關免疫發病機制的研究以及CHB的治療嘗試提供了寶貴的功能驗證信息。

圖4肝臟Treg和Tex細胞的多色免疫組化染色

5、HBV感染者的肝內骨髓細胞及其與T細胞的相互作用
       如圖5A所示，髓細胞被聚類為11個細胞亞群，屬于四個共同的系（樹突狀細胞（DCs）、巨噬細胞、巨核細胞和單核細胞）。DCs進一步分為兩個經典的cDC亞群（CLEC9A+cDC1和CLEC10A+cDC2），一個成熟的cDC亞群（cDC2-LAMP3），一個增殖的亞群（cDC2-MKI67）和pDC。所有這五種DC亞群都主要存在于肝臟（圖5B,C），并在IT患者中富集（圖5D,E），表明這些細胞可能是由IT患者的高水平病毒復制所驅動。巨噬細胞被進一步分為macro_c01-C1QC、macro_c02-NLRP3和macro_c03-FCGR3A。與DCs類似，巨噬細胞亞群也主要分布在肝臟（圖5B,C）。在五個病人組中，macro_c01-C1QC和macro_c03-FCGR3A在IT病人的肝臟CD45+細胞中顯示出明顯的擴展（圖5F）。
       為了解巨噬細胞亞群的來源，根據報道的標記物定義了關于Kupffer來源（Kupffer score）或單核細胞來源巨噬細胞（MoMF score）的分數。基于與Kupffer/單核細胞來源相關的基因的表達分析并不能完全解釋巨噬細胞的異質性（圖5G）。進一步比較巨噬細胞群體之間的DEGs發現，macro_c01-C1QC表達了高水平的補體C1Q基因和第二類HLA分子，表明該集群具有吞噬能力（圖5H）。Macro_c02-NLRP3表達高水平的促炎癥基因，如S100基因、IL1B、VCAN和LYZ，并以高促炎癥評分為特征（圖5H）。Macro_c03-FCGR3A表達高水平的抗病毒ISG（IFITM2、IFITM3、SPN、WARS和CTSC）和免疫調節基因（SOD1、MT2A、LST1、LYN、MTSS1、PECAM1、LILRB2和LILRA5），表現出高促炎性評分和高抑制T細胞活化的能力（圖5H）。

圖5 骨髓細胞亞群的免疫學特征及其與T細胞的相互作用

       為剖析巨噬細胞和T細胞的潛在串擾，使用CSOmap來推斷巨噬細胞亞群和T細胞之間的細胞-細胞相互作用。驚人的是，CSOmap分析顯示，macro_c03-FCGR3A在兩個慢性期（IT和IA）與T細胞的相互作用中占主導地位，而在兩個緩解期（AR和CR）這種相互作用的強度下降，而macro_c02-NLRP3在解決期與T細胞的相互作用占主導地位（圖5I）。通過檢查macro_03-FCGR3A和CD8T_c08-LAYN之間的L-R對相互作用，HLA一類分子（HLA-I）和白細胞免疫球蛋白樣受體（LILR）家族之間的幾個L-R對表現出強烈的潛在相互作用（圖5J）。一致的是，觀察到在IT和IA患者的肝臟中，LILRB2陽性的巨噬細胞與Tex細胞相鄰的位置富集（圖6）。這些潛在的相互作用可能是功能性的，考慮到以前的研究結果，LILRB1和LILRB2可以通過與CD8+T細胞競爭HLA-I的結合，以及通過其免疫受體酪氨酸為基礎的抑制性受體圖案招募抑制性分子，促進腫瘤微環境中的免疫逃避。總之，這些結果表明，FCGR3A+巨噬細胞在CHB中調節T細胞反應方面起著核心作用，可能是通過HLA-I_LILRB信號傳導。

圖6 IT組、IA組和AR組大鼠肝臟特克斯細胞和巨噬細胞的多色免疫組化染色

6、肝臟免疫亞群與臨床參數的相關性
       為了解HBV感染者的肝臟免疫亞群與臨床參數的關系，對所有17名HBV感染者的細胞頻率與HBsAg、HBV DNA、ALT、AST以及組織學分級和分期的水平進行了相關性分析。年齡和診斷后的時間也被納入分析，以撇開受這兩個參數影響的因素。有趣的是，ALT水平與MAIT細胞的頻率呈負相關，與肝臟中CD8+ Tex、Treg和CD4T_c10-CXCL13的頻率呈正相關（圖7A），表明這些細胞亞群可能是肝損傷的關鍵執行者或反應者。與ALT類似，觀察到MAIT細胞和CD8+ Tex與肝臟活檢的組織學分級分數分別負相關和正相關（圖7B）。此外，組織學分級與CD8T_c05-GZMK-GPR183的頻率呈正相關，與PlasmaB_c01-SDC1和兩個骨髓亞群（cDC1和macro_c03-FCGR3A）呈負相關（圖7B）。相比之下，組織學分級僅與肝臟CD45+細胞中CD8T_c05-GZMK-GPR183的頻率呈正相關。隨后作者評估了肝內免疫亞群與血清HBsAg和血清HBV DNA水平的關系。血清HBsAg水平與macro_c03-FCGR3A、macro_c02-NLRP3、cDC-LAMP3和cDC-MKI67的頻率成正相關（圖7C）。
       為剖析血液和肝臟之間是否存在協調的免疫變化，對17名HBV感染者的血液和肝臟之間所有確定的免疫亞群進行了相關分析。在60個亞群中，4個亞群（CD8T_c03-CX3CR1、CD8T_c09-ACTN1、CD8T_c12-MKI67和plasmaB_c03-MKI67）在血液和肝臟之間顯示出明顯的相關性（圖7D）。肝內免疫細胞亞群在不同階段有明顯改變，如MAIT、Treg和CD8+ Tex，在血液中幾乎找不到（圖7D）。值得注意的是，CD8T_c03-CX3CR1和CD8T_c09-ACTN1的頻率在血液和肝臟之間呈現正相關（圖7D）。CD8T_c03-CX3CR1（類似于Temra）和CD8T_c09-ACTN1（Tcm亞群）細胞都表現出類似的功能特征，包括低衰竭和高細胞毒性水平（圖7E）。通過使用額外的驗證隊列，作者證實CX3CR1+GNLY+Tcm細胞（CD8T_c09-ACTN1細胞的潛在替代物）在AR患者的血液中優先擴展（圖7F）。因此，應研究CX3CR1+GNLY+ CD8+Tcm細胞在治愈HBV中的可能作用。

圖7 HBV感染患者肝內免疫特征與臨床參數的相關性

實驗方法
臨床樣本收集和細胞分離，單細胞RNA測序和數據生物信息學分析，流式細胞術，多色免疫組化，
參考文獻
Zhang C, Li J, Cheng Y, Meng F, Song JW, Fan X, Fan H, Li J, Fu YL, Zhou MJ, Hu W, Wang SY, Fu YJ, Zhang JY, Xu RN, Shi M, Hu X, Zhang Z, Ren X, Wang FS. Single-cell RNA sequencing reveals intrahepatic and peripheral immune characteristics related to disease phases in HBV-infected patients. Gut. 2023 Jan;72(1):153-167. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325915. Epub 2022 Mar 31. PMID: 35361683; PMCID: PMC9763233.

????