Amyloid-b（Ab）在阿爾茲海默癥（AD）中發揮著重要的作用，但一些促進Ab生成和Ab寡聚物（Abo）神經毒性的因素尚不清楚。作者發現，在AD患者和淀粉樣前體蛋白（APP）/早衰蛋白-l（PS1）小鼠中，Ras同源GTP酶激活蛋白ArhGAP11A基因的水平顯著升高。降低神經元ArhGAP11A基因水平，不僅通過RhoA/ROCK/Erk信號通路降低APP、PS1、b-分泌酶（BACE1）的表達，抑制Ab生成，而且通過降低凋亡相關p53靶基因的表達，減輕Abo的神經毒性。在APP/PS1小鼠中，特異性降低神經元中的ArhGAP11A基因水平顯著減少Ab產生和斑塊沉積，改善神經元損傷、神經炎癥和認知缺陷。此外，Abos通過激活E2F1增強ArhGAP11A基因在神經元中的表達，進而形成一個有害的循環。作者的研究結果表明ArhGAP11A基因可能參與AD的發病機制，降低ArhGAP11A基因的表達可能是一種很有前途的AD治療策略。本研究于2023年6月發表于期刊《Cell Reports》，IF：8.8。

技術路線

主要研究結果
1、ArhGAP11A水平在AD患者和APP/PS1小鼠中顯著升高
       為探討AD發展過程中可能存在的危險因素，作者通過AD患者和健康老年人海馬的數據集（GEO數據庫）分析ArhGAP11A表達的變化。與健康年長患者相比，AD患者海馬體中ArhGAP11A mRNA水平顯著上升（圖1A）。為進一步證實AD患者中ArhGAP11A表達的變化，作者測量了輕度認知障礙（MCI）患者、AD患者和健康老年人血漿中的ArhGAP11A蛋白水平，健康組作為對照。MCI患者血漿中ArhGAP11A水平顯著高于對照組，并隨著AD的發展而顯著升高（圖1B）。與之一致的是，5月齡APP/PS1小鼠小鼠腦內ArhGAP11A基因水平也顯著升高，早于小鼠的認知缺陷，隨后ArhGAP11A基因水平隨著年齡的增長而顯著升高，而野生型（wild-type, WT）小鼠ArhGAP11A基因水平在測試周期內無明顯變化（圖1C-D）。免疫組織化學（IHC）結果進一步顯示，APP/PS1小鼠皮層神經元和小膠質細胞中ArhGAP11A基因水平持續高于5月齡WT小鼠，并隨著年齡持續升高（圖1E-F），而小鼠星形膠質細胞中ArhGAP11A基因水平過低，無法通過IHC檢測。

圖1 ArhGAP11A水平在AD患者和APP/PS1小鼠中顯著升高

2、ArhGAP11A基因影響APP、PS1、BACE1表達及Ab生成
       為探究ArhGAP11A基因對APP加工和Ab產生的影響，培養原代皮層神經元，用攜帶ArhGAP11A基因short hairpin RNA（shRNA；sh-ArhGAP11A基因）或ArhGAP11A基因（LV-ArhGAP11A）的慢病毒感染原代皮層神經元（圖2A）。在神經元中下調ArhGAP11A基因的表達，APP、PS1和BACE1的水平分別顯著降低至48.2%、49.4%和32.7%（圖2A-B），在感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經元中免疫細胞化學（ICC）實驗進一步驗證了這一點（圖2C-2G）。與此一致，ArhGAP11A基因敲低使原代皮層神經元中Ab42和Ab40的水平分別下降至49.9%和46.3%（圖2H）。
       為確定ArhGAP11A基因下調引起的Ab減少是由于APP、PS1和BACE1的合成減少還是降解增加，在原代皮層神經元中加入CHX抑制蛋白合成，然后分析APP、PS1和BACE1蛋白水平。ArhGAP11A基因敲低不影響APP、PS1和BACE1的降解，但顯著降低原代皮層神經元中APP、PS1和BACE1的mRNA水平（圖2I）。這些結果表明ArhGAP11A基因在轉錄水平上介導了APP、PS1和BACE1的表達，但不影響蛋白的降解。

圖2 ArhGAP11A下調通過降低神經元中APP、PS1和BACE1的表達來減少Ab的產生

3、ArhGAP11A通過RhoA/ROCK/Erk信號通路介導APP、PS1和BACE1轉錄
       為揭示ArhGAP11A基因介導APP、PS1和BACE1轉錄的潛在機制，作者首先檢測了ArhGAP11A基因對Rho-GTP成員RhoA-GTP、Rac1-GTP和Cdc42-GTP水平的影響。pull-down實驗結果表明，在N2a細胞和原代皮層神經元中，敲低ArhGAP11A基因顯著誘導RhoA-GTP水平增加1.5-2倍，而不是Rac1-GTP或Cdc42-GTP水平增加1.5-2倍（圖3A-B），表明ArhGAP11A基因是RhoA的特異性GAP。
       然后，作者檢測了ArhGAP11A基因是否改變了APP、PS1和BACE1的轉錄因子SP1和c-Fos的水平。SP1是PS1和BACE1的重要轉錄因子，c-Fos磷酸化（p-c-Fos）與c-Jun和/或其他伴侶一起是APP的重要轉錄因子。ArhGAP11A基因敲低降低了p-c-Fos和SP1的水平，但沒有降低c-Jun磷酸化（p-c-jun）的水平（圖3C-D），而ArhGAP11A基因過表達顯著增加了p-c-Fos和SP1的水平，表明ArhGAP11A基因通過調控轉錄因子p-c-Fos和SP1改變了APP、PS1和BACE1的表達。此外，RhoA的下游信號蛋白Rho激酶（ROCK）可以抑制ERK1/2磷酸化（p-Erk1/2）的激活，而p-Erk1/2正性調節p-c-Fos和SP1的水平。本研究觀察到，感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經元中ROCK1和ROCK2水平顯著升高，而感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經元中p-Erk1/2水平顯著降低（圖3C-D），提示ArhGAP11A基因可能通過ROCK/Erk信號通路調控轉錄因子p-c-Fos和SP1。在原代皮層神經元中，通過ICC實驗進一步證實了ArhGAP11A基因敲低引起的p-c-Fos和SP1的減少（圖3E-3G）。

圖3 ArhGAP11A通過RhoA/ROCK/Erk信號通路介導APP、PS1和BACE1轉錄

4、下調ArhGAP11A基因通過抑制p53介導的細胞凋亡途徑減輕Abo的神經毒性
       Abos是最具神經毒性的聚集體，通過引起功能性神經元死亡、認知損傷和癡呆，在AD的發生和發展中起關鍵作用。為探究ArhGAP11A基因對Abos神經毒性的影響，作者在感染sh-ArhGAP11A基因或sh-negative control（NC）的原代皮層神經元中加入Abos。結果顯示，2 mM的Abos使細胞存活率降低了50.3%，而ArhGAP11A基因敲低顯著降低Abos的神經毒性，使細胞存活率升高至78.3 % 圖4A）。相反，用LV-ArhGAP11A基因過表達ArhGAP11A基因，Abos的神經毒性顯著增加，從41.4%增加到65.1%。此外，鈣黃綠素-乙酰氧基甲基酯-碘化丙啶（AM-PI）染色檢測細胞凋亡結果進一步證實，ArhGAP11A基因敲低有效逆轉了Abos的神經毒性，而ArhGAP11A基因過表達顯著增強Abos的神經毒性（圖4B-C）。
       有文獻報道p53參與Abos下游信號通路，引發神經元凋亡。此外，ArhGAP11A基因可與p53相互作用，增強p53的轉錄功能，誘導細胞凋亡。結果顯示，ArhGAP11A基因在神經元中與p53結合，且在感染sh-ArhGAP11A基因的原代皮層神經元中，ArhGAP11A基因與p53的結合顯著降低（圖4D）。作者隨后分析p53在神經元中的分布，發現Abos誘導ArhGAP11A基因和p53水平的顯著增加，而ArhGAP11A基因敲低顯著降低ArhGAP11A基因和p53的水平，特別是在細胞核部分，而在細胞質部分p53的水平沒有顯著變化（圖4E）。這些結果表明，敲低ArhGAP11A基因通過減少ArhGAP11A基因與p53的結合，降低細胞核中p53的水平，從而抵抗Abo的神經毒性。
       P53作為轉錄因子，啟動細胞核內凋亡相關蛋白的表達。作者進一步檢測了p53下游信號通路中凋亡相關蛋白的水平。qPCR結果顯示，Abo處理增加Bax、Puma和Noxa的mRNA水平，而ArhGAP11A基因敲低顯著逆轉了這些變化（圖4F），表明ArhGAP11A基因敲低通過減少p53向細胞核的轉移，阻止凋亡相關蛋白的異常表達，從而減少Abos的神經毒性和神經元凋亡。

圖4 ARHGAP11A基因下調通過阻斷p53轉錄活性降低Abos的神經毒性

5、Aβos通過激活E2F1增強ArhGAP11A基因的表達
       為確定在AD和APP/PS1小鼠患者中ArhGAP11A基因的表達與Abos的相關性，作者用Abos處理原代皮層神經元，發現Abos顯著提高ArhGAP11A基因的蛋白水平（圖S7A-B）。為確定Abo誘導的ArhGAP11A基因增加是由于降解受損還是合成增強，對原代皮層神經元進行CHX實驗以抑制蛋白質合成，并通過western blotting分析在不同時間點檢測ArhGAP11A基因蛋白水平。結果顯示，Abo處理不干擾ArhGAP11A基因降解（圖S7C-D），但顯著提高ArhGAP11A基因的mRNA水平（圖S7E），表明Abos在轉錄水平上提高ArhGAP11A基因的生成。有報道顯示，E2F1作為轉錄因子調控ArhGAP11A基因的表達，這種調控作用被Rb蛋白所阻斷，并由Rb磷酸化介導。為研究Abo介導的ArhGAP11A基因表達增加是否由E2F1誘導，用Abos處理原代皮層神經元，檢測Rb（p-Rb）、Rb和E2F1的磷酸化水平。Abo處理顯著增加E2F1和p-Rb的水平，而不是Rb （圖S7A和S7B），證明Abos通過激活轉錄因子E2F1增強ArhGAP11A基因的表達。

圖S7 Abos通過激活E2F1增強ArhGAP11A基因的表達

6、神經元ArhGAP11A下調可減輕APP/PS1小鼠的認知缺陷
       作者通過Morris水迷宮（MWM）實驗檢測ArhGAP11A基因敲低對APP/PS1小鼠空間學習記憶能力的影響。在訓練階段，注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠表現出空間學習能力顯著改善，比shNC處理的APP/PS1小鼠潛伏期更短，而它們的運動功能在不同小鼠組之間沒有顯著差異（圖5A）。隨后，進行移除平臺的探測實驗以評估記憶回憶。與之一致的是，注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠的保持記憶顯著提高，在目標象限停留的時間和穿越平臺位置的次數比注射shNC的APP/PS1小鼠更多（圖5B-D）。
       隨后，作者進行了Y迷宮和新奇物體識別（NOR）測試來進一步評估小鼠海馬依賴的空間工作記憶和長短期識別記憶。結果表明，注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠在Y迷宮的新異臂中花費了更多的時間，進入新異臂的次數更多（圖5E-F），在NOR測試中表現出了新異物體的探索次數和辨別指數的顯著增加（圖5G-H）。這些結果表明，神經元ArhGAP11A基因敲低顯著減輕APP/PS1小鼠的認知和記憶損傷。

圖5 神經元ArhGAP11A下調可減輕APP/PS1小鼠的記憶缺陷和神經病理

7、神經元ArhGAP11A下調可改善突觸喪失和神經元損傷
       為評估神經元ArhGAP11A基因對突觸數量的影響，作者檢測不同組小鼠腦內突觸后致密物-95（PSD95）和突觸素（SYN）的水平。結果顯示，與shNC處理的APP/PS1小鼠相比，ArhGAP11A基因敲低小鼠的PSD95和SYN水平以及完整突觸（PSD95與SYN共定位）的數量顯著增強（圖5I和圖5J）。此外，作者進行高爾基染色以驗證ArhGAP11A基因敲低對突觸的改善作用。結果顯示，shArhGAP11A基因處理的APP/PS1小鼠的平均樹突棘密度顯著增加，而shNC處理的小鼠的平均樹突棘密度無顯著變化（圖5K-L）。
       作者接下來進行Nissl染色評估神經元損傷和凋亡的變化，發現神經元ArhGAP11A基因下調顯著增加了注射shArhGAP11A基因的APP/PS1小鼠海馬和皮層神經元中尼氏小體的數量，表明ArhGAP11A基因敲低顯著改善神經元損傷（圖6A-C）。研究進一步通過TUNEL染色發現，APP/PS1小鼠的海馬和皮層中存在大量的TUNEL ⁺細胞，而shArhGAP11A基因處理顯著降低TUNEL ⁺細胞的數量（圖6D-F）。這些結果表明，敲低ArhGAP11A基因顯著減少APP/PS1小鼠的突觸丟失和神經元損傷。此外，作者還通過IHC實驗測定了小鼠神經元中p53的水平和分布，發現APP/PS1小鼠的神經元中p53的水平明顯升高，尤其是在細胞核中，促進了p53的轉錄活性，引起了p53依賴的神經元凋亡，而shArhGAP11A基因處理顯著降低了p53的水平，特別是在細胞核中，這可能解釋為什么ArhGAP11A基因敲低明顯減輕的神經元損傷（圖6G-H）。

圖6 神經元ArhGAP11A下調可改善APP/PS1小鼠的神經元損傷和凋亡

8、神經元ArhGAP11A下調可降低Ab負荷
       接下來，作者進行IHC實驗來評估ArhGAP11A基因對APP/PS1小鼠海馬神經元中p-c-Fos、SP1、APP、PS1和BACE1水平的影響。結果顯示，與注射sh NC的小鼠相比，在APP/PS1小鼠和WT小鼠中，ArhGAP11A基因敲低顯著降低了p-c-Fos、SP1、APP、PS1和BACE1的水平（圖7A-F）。此外，APP/PS1小鼠的可溶性和不可溶性海馬組分中Ab42和Ab40的水平顯著降低了（圖7G和7H）。與此一致的是，在注射shArhGAP11A基因（圖7I-7K）的APP/PS1小鼠小鼠的海馬和皮層中，斑塊數量明顯減少。總之，這些數據表明神經元ArhGAP11A基因敲低有效地抑制了小鼠APP、PS1和BACE1的表達和Ab的生成。

圖7 ArhGAP11A下調可降低小鼠大腦中APP、BACE1、PS1和Aβ的水平

9、神經元ArhGAP11A下調可減輕神經膠質瘤和神經炎癥
       作者進一步評估了神經元ArhGAP11A基因敲低對APP/PS1小鼠中神經膠質增生和神經炎癥的影響。IHC結果顯示，與注射shNC的小鼠相比，sh ArhGAP11A基因處理顯著降低APP/PS1小鼠海馬和皮層中的小膠質細胞增生和星形膠質細胞增生（圖S11A-S11F），并通過Western blotting分析進一步證實了這些發現（圖S11G和S11H）。此外，qPCR實驗還檢測了活化的小膠質細胞和星形膠質細胞中細胞因子的表達。與膠質細胞增生的結果一致，shArhGAP11A基因顯著降低APP/PS1小鼠腦中腫瘤壞死因子a（TNF-a）、白細胞介素-6（IL-6）和IL-1b的水平，而shNC則無此作用（圖S11I-K）。這些結果表明神經元ArhGAP11A基因敲低有效地減弱APP/PS1小鼠腦中的神經炎癥。

圖S11 神經元ArhGAP11A下調可減輕神經膠質瘤和神經炎癥

結論
       綜上所述，ArhGAP11A基因通過增加Ab生成和增強Abo神經毒性參與AD的神經病理發展。同時，Abos進一步增加神經元ArhGAP11A基因的表達，導致AD的病理惡化。因此，ArhGAP11A基因可能是緩解AD病理特征和治療AD的潛在靶點。

機制示意圖

實驗方法
APP/PS1小鼠（6月齡），N2a細胞培養，293T細胞培養，GEO數據庫分析，MTT檢測，Pull-down實驗，CoIP，蛋白提取，Western blotting，行為測試，免疫組織化學（IHC），免疫細胞化學（ICC），Golgi染色，qRT-PCR
參考文獻
Huang YR, Xie XX, Yang J, Sun XY, Niu XY, Yang CG, Li LJ, Zhang L, Wang D, Liu CY, Hou SJ, Jiang CY, Xu YM, Liu RT. ArhGAP11A mediates amyloid-β generation and neuropathology in an Alzheimer's disease-like mouse model. Cell Rep. 2023 Jun 9;42（6）:112624. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112624. Epub ahead of print. PMID: 37302068.