以順鉑(DDP)為基礎的化療是食管鱗狀細胞癌(OSCC)患者常用的一線治療方案，但其較高的耐藥率限制了其臨床應用，其作用機制尚不清楚。本研究旨在闡明缺氧條件下異常信號傳遞和代謝在OSCC耐藥中的作用，并尋找增強DDP化療敏感性的靶向藥物。通常，腫瘤細胞存在于缺氧微環境中。通過基因組分析，我們確定IGF1R在低氧條件下在OSCC中上調。臨床上，IGF1R表達增強與OSCC患者腫瘤分期高、預后差相關，其抑制劑linsitinib在體內和體外均與DDP治療有協同作用。由于缺氧經常導致代謝重編程，我們通過代謝組學分析進一步了解到，異常的IGF1R通路通過c-MYC的轉錄活性促進代謝酶ASS1和PYCR1的表達。具體而言，ASS1的表達增強促進精氨酸代謝以進行生物合成代謝，而PYCR1則激活脯氨酸代謝以維持氧化還原平衡，從而在缺氧條件下維持DDP治療期間OSCC細胞的增殖能力。靶向IGF1R信號的Linsitinib可能為DDP耐藥的OSCC患者帶來有希望的聯合治療選擇。本文于2023年3月發表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.3）上。
技術路線

結果
1）IGF1R在OSCC中過表達，與疾病進展和不良預后相關
       我們首先分析了TCGA的數據。其中，IGF1R、MET、EGFR、FGFR2、FGFR3、PDGFRB的表達水平在OSCC中較非癌組織顯著上調，其中IGF1R表達差異最顯著(圖1A)。同時，通過RNA-seq，在OSCC患者組織中也發現MET和IGF1R過表達(圖1B左)。為了進一步分析在模擬缺氧(1%)條件下RTKs失調對化學耐藥的作用，我們最初考慮選擇對DDP具有最大抗性的OSCC細胞系。最近的研究表明KYSE150細胞對DDP的藥物敏感性最低。我們選擇IC50值最高的KYSE150和ECA109細胞進行后續RNA測序(圖1B右)。在缺氧條件下，只有IGF1R顯著上調。通過整合臨床組織和細胞系樣本的RNA-seq，我們將后續的研究重點放在了IGF1R上(圖1C)。與上述RNA-seq結果一致，在缺氧條件下，RTKs中只有IGF1R以濃度(圖1D)和時間(圖1E)依賴的方式持續表達水平升高。
       在臨床上，TMA(圖1F-H)和WB(圖1I)分析結果反映了上述差異，其中腫瘤組織中IGF1R蛋白表達高于癌旁組織。此外，在79例OSCC患者中，IGF1R高表達水平與腫瘤分期呈正相關(圖1F-G)，與總生存期預后不良正相關(圖1H)。具體而言，與鄰近正常組織相比，早期食管癌組織中IGF1R蛋白豐度中度升高(圖1J-K)，這可能為早期診斷和治療提供指導。綜上所述，這些數據表明IGF1R在人類OSCC中過表達，這可能具有預后意義，并與缺氧下DDP抵抗有關。

2）抑制IGF1R可增強OSCC在體內和體外對DDP的敏感性
       為了探索異常表達的IGF1R在DDP耐藥中的作用，我們最初干擾了IGF1R的表達(圖2A)，在體外(圖2B)和體內(圖2C-E)均發現了適度抑制OSCC增殖的能力。此外，IGF1R抑制劑linsitinib可以在接近IC50的濃度下有效抑制p-IGF1R的表達(圖2F)。隨后，將linsitinib與DDP聯合治療(圖2G)，說明linsitinib與DDP聯用可協同抑制OSCC細胞的增殖。這些協同效應在體外(圖2H)和體內(圖2I-J)也有體現?？偟膩碚f，抑制IGF1R表達可能顯著增加OSCC細胞對DDP的敏感性。接下來，我們將探討潛在的機制。

3）缺氧條件下，代謝酶ASS1/PYCR1在OSCC中上調
       代謝適應有助于癌細胞在缺氧微環境中的發育。具體來說，代謝酶的改變是整個代謝途徑異常的關鍵。因此，通過整合代謝組學和基因組分析(圖3G)，我們有望在缺氧條件下找到活化的代謝酶。一方面，作為精氨酸代謝關鍵酶的ASS1和負責脯氨酸合成的PYCR1在腫瘤組織(圖3A左)和限氧條件下的細胞系(圖3A右)中均有高表達。另一方面，我們進行了非靶向代謝組學分析(圖3B)，在缺氧條件下的KYSE150細胞中發現了45種異常積累的代謝物(圖3C)。通過the Small Molecule Pathway Database分析，發現這些代謝物與多種代謝途徑密切相關(圖3D)。我們發現TCA循環和FAO被抑制，同時伴隨著糖酵解的增強(圖3E)。值得注意的是，天冬氨酸-精氨酸-脯氨酸代謝也增強了(圖3F)。我們主要關注通過ASS1和PYCR1改變的精氨酸/脯氨酸代謝(圖3G)。

4）ASS1和PYCR1的表達改變與IGF1R相關
       我們初步驗證了ASS1和PYCR1在OSCC中的表達水平。與IGF1R一致，ASS1和PYCR1在KYSE150和ECA109細胞系中表達最高(圖3H-I)。此外，缺氧也以時間依賴性的方式刺激了這兩種酶的表達(圖3J-K)。此外，TMA(圖4A-D)和WB(圖F)顯示，與癌旁組織相比，OSCC患者組織中ASS1/PYCR1蛋白表達上調。臨床上，ASS1/PYCR1的高表達與腫瘤分期相關(圖4A-D)，即使在EOC中與正常組織樣本相比(圖4G-H)，以及OSCC患者的無進展生存期(圖4E)。此外，我們發現TMA中ASS1和PYCR1的表達與IGF1R呈正相關(圖5A)。因此，我們想知道ASS1和PYCR1是否受IGF1R的調節。

5）IGF1R通過相關信號通路- cMYC軸調控ASS1和PYCR1的表達
       為了進一步探索IGF1R調控ASS1和PYCR1表達的機制，我們首先抑制IGF1R的表達，發現ASS1/PYCR1下調(圖5B)。此前，IGF1R已被證明在促進多種細胞功能的兩個主要信號通路(即PI3K/AKT和Ras/MAPK通路)中負責下游級聯蛋白的磷酸化。因此，我們抑制IGF1R表達來檢測各種信號通路，發現Ras/MAPK通路和JAK/STAT通路(圖5C)的磷酸化水平顯著降低。此外，JAK和ERK1/2的下調伴隨著ASS1/PYCR1表達的降低(圖5D)，證實IGF1R通過這兩條信號通路調控ASS1/PYCR1。為了確定IGF1R通路與ASS1/PYCR1之間的橋梁，多種轉錄因子(TF)引起了我們的注意，并且它們的轉錄活性可以通過RTK通路的磷酸化而增強。因此，在幾種常見的TF中，只有磷酸化的c-MYC與ASS1/PYCR1 (圖5E)和IGF1R通路(圖5F)表現出明確的調控關系。為了確定c-MYC與ASS1/PYCR1之間的直接調控，我們進行了JASPAR分析(圖5 G)，結果表明ASS1 (圖5H)和PYCR1 (圖5I)在啟動子區域都有c-MYC結合序列。對c-MYC進行ChIP檢測，然后進行定量PCR，證實c-MYC直接與ASS1(圖5J)和PYCR1(圖5K)啟動子結合。此外，雙熒光素酶報告基因檢測顯示，c-MYC可以促進ASS1(圖5L, N)和PYCR1(圖5M, O)的轉錄激活。綜上所述，這些結果表明，缺氧條件下ASS1和PYCR1表達的改變是由IGF1R信號通路- c-MYC軸誘導的(圖5P)。

6）IGF1R通過靶向精氨酸代謝降低OSCC細胞對DDP的敏感性
       為了進一步研究ASS1和PYCR1增強在DDP耐藥中的作用，我們首先干擾ASS1(圖6A)和PYCR1(圖6C)的表達，分別觀察到體外(圖6B, D)和體內(圖6E-G)的增殖能力略有抑制。與IGF1R抑制劑linsitinib的作用一致，shASS1/PYCR1在體外(圖H-I)和體內(圖6J-L)均表現出與DDP協同抑制腫瘤增殖的作用。接下來，我們還進行了代謝組學分析，以研究ASS1(圖7A)和PYCR1(圖7D)在代謝重編程中的作用。ASS1(圖7B、C、G)和PYCR1(圖7E、F、H)抑制誘導的異常與精氨酸/脯氨酸代謝密切相關。更具體地說，shRNA-PYCR1細胞中的脯氨酸水平降低，shRNA-ASS1細胞中的精氨酸水平降低(圖7I)。此外，為了揭示精氨酸的作用，我們進行了拯救實驗。與對照+ DDP組相比，shASS1 + DDP或linsitinib + DDP組被抑制的增殖能力通過補充外源性精氨酸得到部分恢復(圖7J)。這些數據表明，IGF1R通過在缺氧條件下調節ASS1促進精氨酸代謝，導致精氨酸積累，作為維持化療期間增殖能力的生物合成前體。

7）IGF1R通過靶向脯氨酸代謝降低OSCC細胞對DDP的敏感性
       與精氨酸相比，外源性脯氨酸在shPYCR1 + DDP或linsitinib + DDP組中未能挽救增殖(圖7K)。眾所周知，PYCR1催化脯氨酸合成伴隨著NAD+的生物合成，在維持氧化還原平衡中起著關鍵作用。我們想知道通過PYCR1增強脯氨酸代謝的NAD +是否補償了TCA循環。正如預期的那樣，PYCR1表達減弱抑制了NAD +水平(圖7L)。最后，我們在DDP + shPYCR1組中添加了額外的外源性丙酮酸，它可以支持TCA循環中中間代謝物的積累；結果，外源性丙酮酸逆轉了shPYCR1 + DDP處理引起的增殖抑制(圖7K)。綜上所述，IGF1R通過調節PYCR1促進脯氨酸代謝，提供足夠的NAD +維持TCA循環中的氧化還原平衡，最終支持化療期間的細胞增殖。

結論
       我們發現激活的IGF1R通路在低氧微環境下的OSCC化療耐藥中發揮重要作用。靶向IGF1R和相關的精氨酸/脯氨酸代謝可能是減輕DDP耐藥的關鍵方法。這些發現提高了我們對DDP耐藥性中的信號傳遞和代謝重編程的理解。DDP和IGF1R抑制劑聯合治療可能有利于OSCC的治療。

實驗方法
CCK-8，RT?qPCR，RNA測序，WB，ChIP，熒光素酶報告實驗，IHC，TMA，代謝組學分析，NAD +和ATP水平的測定。
參考文獻
Fang K, Sun M, Leng Z, Chu Y, Zhao Z, Li Z, Zhang Y, Xu A, Zhang Z, Zhang L, Chen T, Xu M. Targeting IGF1R signaling enhances the sensitivity of cisplatin by inhibiting proline and arginine metabolism in oesophageal squamous cell carcinoma under hypoxia. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Mar 28;42(1):73. doi: 10.1186/s13046-023-02623-2.