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       ?突變型p53（mutp53）蛋白通常在人類癌癥中積累到非常高的水平，以通過功能獲得（GOF）機制促進癌癥進展。目前，mutp53積累和GOF的潛在機制尚未完全了解。TRIM21作為mutp53的一個關鍵的E3泛素連接酶，mutp53通過篩選特定的mutp53相互作用的蛋白質。本研究通過CO-IP和LC-MS/MS實驗確定了TRIM21直接靶向結合mutp53，且TRIM21能夠通過影響mutp53的泛素化負性調控mutp53的表達，抑制癌細胞的錨定非依賴性生長，并且能夠抑制原位和皮下瘤的生長，TRIM21的低表達了也逆轉了mutp3介導的癌癥的不良預后。本文章于2023年3月發表在《Journal Clinical Investigation》上，IF=15.9?

技術路線

主要研究內容

1.TRIM21是mutp53相互作用的蛋白

       ?在表達異位熱點R175H mutp53或wtp 53的人結直腸癌p53^?/? RKO細胞中使用co-IP與p53抗體篩選特異性mutp53相互作用蛋白，然后進行LC-MS/MS分析。TRIM21被鑒定為優先結合R175H mutp53但不結合wtp 53的潛在蛋白質。R175H、G245S、R248Q和R273H熱點mutp53已顯示出GOF活性并廣泛用于mutp 53 GOF研究。因此，在表達異位TRIM21-Flag和mutp53的p53^-/-RKO細胞中，使用co-IP，隨后進行Western印跡分析，研究了TRIM21和這四個熱點GOF mutp53之間的相互作用（圖1A）。在p53^+/+ RKO細胞中沒有觀察到內源性TRIM21和wtp53之間的明顯相互作用（圖1B），但觀察到內源性TRIM21和不同mutp53之間的相互作用（圖1C和D）。為了確定TRIM21-mutp53相互作用所需的TRIM21結構域，構建表達TRIM21-Flag系列缺失突變體的載體（圖1 E），并與R175H mutp53載體共轉染到p53^-/-RKO細胞中用于共IP測定。結果顯示SPRY和PRY結構域是TRIM21與R175H mutp53相互作用的重要位點（圖1 E）。同時，R175H mutp53的DBD結構域是R175H mutp53與TRIM21相互作用的位點（圖1F）。使用重組GST-TRIM21和His-mutp53或His-wtp53蛋白的體外谷胱甘肽S-轉移酶（GST）下拉實驗顯示，TRIM21在體外直接與mutp53相互作用，但不與wtp53相互作用（圖1H）。此外，SPRY和PRY結構域的缺失消除了GST-TRIM21在體外與His-mutp53直接相互作用的能力（圖1H）。總之，這些結果表明TRIM21直接且特異性地與細胞中的mutp53相互作用。?

圖1：TRIM21是一種特定的mutp53結合蛋白

2.TRIM21抑制了mutp53在癌癥細胞中的積累

       ?通過對TRIM 21穩定敲低檢測癌細胞中的mutp53蛋白水平，發現TRIM 21-Flag的異位表達顯著下調SK-BR3、HT29、LS1034和HCC70細胞中不同內源mutp53蛋白的水平，而wtp53蛋白的表達水平并無明顯改變（圖2A）。此外，TRIM21-KO分別明顯增加SK-BR3和HT29細胞中R175H和R273H mutp53的蛋白質水平（圖2B）。類似地，通過不同shRNA載體的TRIM21敲低分別明顯增加了LS1034和HCC70細胞中的G245S和R248Q mutp53蛋白水平，但對MCF 7和p53^+/+ RKO細胞中的wtp53蛋白水平影響較?。▓D2C）。通過將R172H mutp53敲入小鼠，提取源自TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF），發現TRIM21^-/-p53^R172H/R172H MEF顯示出比TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H MEF高得多的mutp53蛋白水平（圖2D）。然而，在TRIM21^+/+ p53^+/+和TRIM 21^-/- p53^+/+ MEF之間沒有觀察到wtp53蛋白水平的明顯差異（圖2D）。RT-qPCR測定的結果顯示，TRIM21沒有明顯影響上述細胞系中mutp53或wtp53的mRNA水平（圖2E-H）。這些結果表明，TRIM21優先下調mutp53而不是wtp53的蛋白水平，并且TRIM21缺陷導致mutp53在癌細胞中積累。?

圖2：TRIM21抑制了mutp53在癌癥細胞中的表達

3.TRIM21促進mutp53的泛素化和降解

       用表達R175H或R273H mutp53的載體連同表達WT TRIM21-Flag或缺失RING結構域（ΔRING）的突變TRIM21-Flag的載體共轉染p53^-/-RKO細胞。發現WT而非ΔRING TRIM21-Flag明顯下調p53^?/? RKO細胞中的外源mutp53蛋白水平，而用蛋白酶體抑制劑MG132處理細胞后這種變化又被消除（圖3A和B）。為了研究TRIM21是否泛素化mutp53，在不同細胞中進行體內泛素化測定。WT而非ΔRING TRIM21-Flag的異位表達顯著促進了p53^?/? RKO細胞中外源R175H和R273H mutp53的泛素化（圖3C）。此外，TRIM21 KO分別降低SK-BR3和HT29細胞中內源性R175H和R273H mutp53的泛素化（圖3D）。TRIM 21介導的mutp53泛素化通過使用重組蛋白的體外泛素化測定進一步證實; WT GST-TRIM 21誘導His-mutp53的泛素化，但不誘導Hiswtp53的泛素化，其通過TRIM21 RING結構域的缺失而消除（圖3E）。驗證TRIM21是否使mutp53不穩定，在內源性R175H mutp53蛋白水平的蛋白質印跡分析之前，用蛋白質合成抑制劑環己酰胺（CHX）處理具有TRIM 21-Flag表達或TRIM21 KO的SK-BR3細胞及其對照細胞不同的時間段。R175H mutp53蛋白的半衰期通過TRIM21-Flag的異位表達而明顯降低（圖3F），并且通過TRIM21 KO而增加（圖3G）。這些結果表明TRIM21直接結合mutp53以泛素化和降解mutp53，并且TRIM21缺陷導致mutp53穩定和積累。

圖3：TRIM21通過泛素化促進mutp53蛋白的降解

4.TRIM21抑制mutp53積累以抑制癌細胞的錨定非依賴性生長

       ?驗證TRIM21是否影響mutp53 GOF活性，促進錨定非依賴性細胞生長。發現癌細胞中mutp53的敲低顯著抑制了錨定非依賴性細胞生長，mutp53在癌細胞中的GOF活性（圖4A和B）。癌細胞中的TRIM21 KO顯著促進非貼壁依賴性細胞生長，但這種效應在很大程度上被mutp53 KO消除（圖4A和B）。異位TRIM 21-Flag表達顯著抑制細胞的貼壁非依賴性生長，但對其相應的mutp53 KO細胞中抑制作用減弱（圖4C）。轉化的MEFs的錨定非依賴性生長被wtp53顯著抑制（p53 ^+/+ vs p53^-/-），但被R172H mutp53促進（p53^R172H/R172H vs p53^-/-）。另外，TRIM21缺失顯著促進p53^R172H/R172H MEFs的錨定非依賴性生長，但不促進p53 ^+/+或p53^?/? MEFs的錨定非依賴性生長（圖4D）。這些結果共同表明，TRIM21通過抑制mutp53積累和GOF來抑制貼壁非依賴性細胞生長。?

圖4：TRIM21抑制mutp53 GOF，促進癌細胞的非錨定生長

5.TRIM21抑制mutp53積累以抑制原位和皮下腫瘤的生長

      ? 通過SKBR3細胞構建的原位乳腺腫瘤和在無胸腺裸鼠中皮下注射HT29細胞形成的結腸直腸異種移植腫瘤，SK-BR3細胞中的TRIM21 KO顯著促進SK-BR3原位腫瘤的生長，而R175H mutp53 KO顯著抑制腫瘤生長并在很大程度上消除了TRIM21 KO對腫瘤生長的促進作用（圖5A）。SK-BR3腫瘤組織的蛋白質印跡分析和IHC染色顯示TRIM21 KO明顯增強mutp53蛋白水平（圖5B和C）。同樣，HT29細胞中的TRIM21 KO顯著促進腫瘤生長并明顯增加腫瘤中mutp53蛋白水平，但HT29細胞中的mutp53 KO顯著抑制腫瘤生長并在很大程度上消除了TRIM21 KO對腫瘤生長的促進作用（圖5D和E）。另外，TRIM21-Flag表達大大降低了SK-BR3和HT29腫瘤中的mutp53水平（圖5G和I）。這些結果共同證明了TRIM21抑制mutp53積累以抑制mutp53 G0F促進腫瘤生長。?

圖5：TRIM21抑制mutp53積累促進腫瘤生長

6.TRIM21的低表達校正mutp53癌癥中的不良預后

       組織芯片的結果顯示，TRIM21的表達在兩個不同的結腸直腸癌組中，分別有63%（n=57/90）和44%（n=22/50）的結腸直腸癌下調（圖6A），在50%（n=20/40）的乳腺癌中下調（圖6 B）。此外，與其匹配的相鄰非腫瘤組織相比，結直腸癌和乳腺癌中TRIM21的平均蛋白水平顯著降低（圖6A和B）。同樣，與非腫瘤乳腺組織相比，TRIM21蛋白水平在這些乳腺癌中顯著下調（圖6C）。TCGA數據庫中的TRIM21表達的分析顯示，幾種類型的腫瘤中的低TRIM21表達與患有mutp53癌癥而非wtp53癌癥的患者中的不良臨床結果顯著相關（圖6D）。這些結果表明TRIM21在一些攜帶mutp53的癌癥中的腫瘤抑制功能。

圖6：TRIM21的低表達校正mutp53癌癥中的不良預后

7.TRIM21缺失導致mutp53在正常組織中積累并促進p53^R172H/R172H小鼠的腫瘤發生

       ?構建TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠，發現TRIM21缺失沒有明顯影響p53^-/-或p53^+/+小鼠的壽命，但TRIM21缺失導致腫瘤發病更早，這顯著降低了p53^R172H/R172H小鼠的壽命。TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53 ^R172H/R172H小鼠的中位生存期分別為157天和134天（p=0.0002；圖7A）。在p53 ^{R172 H/R172H}小鼠的正常組織（包括脾、胸腺、小腸和結腸組織）中未觀察到mutp53蓄積，通過Western印跡和IHC分析，在TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的這些正常組織中mutp53蛋白蓄積至高水平（圖7B和C）。而在正常（非應激）條件下，wtp53蛋白水平在正常組織中保持在非常低的水平（圖7D）。盡管mutp53在TRIM21^+/+ p53^R172H/R172H和TRIM21^-/-p53^R172H/R172H小鼠的腫瘤中積累，但與TRIM 21^+/+ p53^R172H/R172H腫瘤相比，在TRIM21^-/-p53^R172H/R172H腫瘤中觀察到更高水平的mutp53積累（圖7 E）。通過co-IP測定證實了腫瘤中TRIM21和R172H mutp53蛋白之間的相互作用，表明TRIM21與mutp53在體內相互作用（圖7 F）?？傊@些結果表明TRIM 21缺失導致mutp53在正常組織中積累，并且mutp53在腫瘤中進一步積累，導致p53^R172H/R172H小鼠的更早的腫瘤發作和壽命縮短。?

圖7：TRIM21缺失導致mutp53積累并促進p53^R172H/R172H小鼠的腫瘤發生

結論
       ?總之，這個研究揭示了癌癥中mutp53積累和GOF的關鍵機制，并且還鑒定了TRIM21在癌癥中的腫瘤抑制功能的重要機制。更好地理解腫瘤中mutp53積累和GOF的機制將為開發針對攜帶mutp53的癌癥的有效治療策略提供新的機會。
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實驗方法
細胞培養和載體構建，CRISPR/Cas9構建 KO細胞系，LC-MS/MS測定，western blot，免疫共沉淀實驗，GST pull-down，RT-qPCR，泛素化測定，半衰期分析，錨定非依賴性生長測定，小鼠成瘤實驗，免疫組化，TCGA數據庫分析。
參考文獻：
Liu, J., Zhang, C., Xu, D., Zhang, T., Chang, C. Y., Wang, J., Liu, J., Zhang, L., Haffty, B. G., Zong, W. X., Hu, W., & Feng, Z. (2023). The ubiquitin ligase TRIM21 regulates mutant p53 accumulation and gain of function in cancer. The Journal of clinical investigation, 133(6), e164354. https://doi.org/10.1172/JCI164354

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