我們之前報道過,來自成骨細胞、破骨細胞和混合前列腺癌細胞的細胞外囊泡(EVs)通過轉移miR-92a-1-5p促進破骨細胞分化,抑制成骨細胞分化。在本研究中,我們專注于將miR-92a-1-5p工程化到EVs中,并確定工程化EVs的任何治療作用和機制。qPCR證實,miRNA-92a-5p穩定過表達的細胞與EV上調該microRNA相關。此外,miR-92a-1-5p富集的EVs通過降低MAPK1和FoxO1的表達來促進體外破骨細胞分化,通過TRAP染色和破骨細胞功能基因mRNA表達顯示,這與破骨細胞功能增加有關。靶向MAPK1或FoxO1的siRNA導致類似的破骨細胞功能增加。在體內,通過靜脈注射給予miR-92a-1-5p富集的EVs促進骨溶解,這與骨髓中MAPK1和FoxO1表達的降低有關。這些實驗表明,miR-92a-1-5p富集的EVs通過減少MAPK1和FoxO1來調節破骨細胞的功能。本文于2023年6月發表于Journal of Experimental & Clinical Cancer Research(IF=11.3)上。
技術路線
結果
1)miR?92a?1?5p富集的EVs的產生
通過慢病毒載體(pHBLV-U6-miR-92a-1-5pEF1-fLUC-T2A-Pro)轉染,miR-92a-1.5p在MDA PCa 2b細胞中穩定過表達。通過qPCR證實miR-92a1-5p過表達約為兩倍(圖1A)。為了收集miR-92a-1-5p富集的EVs,將穩定表達的細胞在貧化培養基中培養48小時。來自EVs的總RNA顯示miR-92a-1.5p增加了兩倍(圖1B)。接下來,將miR-92a-1-5p+EVs添加到Raw264.7細胞的培養基中,并在共培養后90分鐘內觀察到它們的快速內化(圖1C)。在這種情況下,成熟miR-92a-1-5p的表達在24小時和48小時增加(圖1D),而pre-miR-92a-1.5p的水平沒有變化(圖1E)。這些結果表明,表達的增加是由于成熟的miR-92a-1-5p通過miR-92a-1.5p+EVs的轉移。
2)富含miR-92a-1-5p的EVs促進破骨細胞分化
我們之前的研究報告稱,前列腺癌EVs可以促進破骨細胞分化和減弱成骨細胞分化,兩者至少部分通過轉移miR-92a-1-5p介導。在這里,我們打算研究miR-92a-1-5p+EVs在骨穩態中的作用。在不存在RANKL的情況下,將Raw264.7細胞與對照EVs或miR92a-1-5p+EVs孵育24和48小時,然后進行qPCR分析,結果顯示miR-92a-1-5p+EVs顯著誘導了細胞中Ctsk和Trap的mRNA表達(圖2A-B)。此外,在不存在RANKL的情況下,共培養6天后,通過Trap染色,miR-92a-1-5p+EVs在Raw264.7細胞和骨髓巨噬細胞(BMM)中顯著促進破骨細胞分化(圖2C-D)。
3)MAPK1是miR?92a?1?5p的直接靶標
為了闡明上述作用的分子機制,我們通過生信分析確定miR-92a1-5p的靶基因是MAPK1。qPCR分析顯示,當miR-92a-1-5p過表達時,Raw264.7細胞中的MAPK1 mRNA表達顯著降低(圖3A),并且蛋白質印跡結果顯示,在Lv-92a-1-5p處理的Raw264-7細胞中,MAPK1的水平降低,而不是磷酸化的MAPK1(pMAPK1)的水平降低(圖3B)。通過使用免疫標記進一步證實了這些結果(圖3C)。通過計算機分析,我們發現MAPK1 3′-UTR區域包含miR-92a-1-5p的匹配位點(圖3D)。使用雙熒光素酶報告基因分析,我們發現miR-92a-1-5p共轉染的MAPK1 wt組的酶活性顯著較低(圖3E)。這一結果表明miR-92a-1-5p直接靶向MAPK1。
4)MAPK1下調促進破骨細胞分化
為了闡明MAPK1下調如何影響破骨細胞分化,我們將MAPK1 siRNA轉染到Raw264.7細胞中,并使用qPCR證實MAPK1表達降低(圖4A)。值得注意的是,用Mapk1 siRNA轉染Raw264.7細胞上調了Ctsk和Trap mRNA的表達(圖4B-C),并在RANKL存在的情況下增加了Trap+破骨細胞(圖4D-E)。此外,在RANKL存在的情況下,通過用Mapk1 siRNA轉染后6天的免疫標記證實了Ctsk和Trap水平的增加(圖4F-G)。
5)FoxO1抑制在MAPK1下調促進破骨細胞分化中的潛在作用
在過表達Lv-92a-1-5p的Raw264.7細胞中,我們還無意中通過蛋白質印跡發現FoxO1下調(圖5A)。然而,在使用TargetScan進行的生物信息學分析中,FoxO1未被鑒定為miR-92a-1-5p的潛在靶標。因此,我們構建了FoxO1 siRNA,以確定FoxO1是否在破骨細胞分化中發揮作用。盡管用Mapk1 siRNA轉染后FoxO1 mRNA表達降低(圖5B),但Mapk1 mRNA表達不受FoxO1 siRNA的影響,這表明FoxO1可能是破骨細胞分化中Mapk1的下游分子。在Raw264.7細胞中,用FoxO1 siRNA轉染上調了Ctsk和Trap mRNA的表達(圖5C-D),并增加了Trap+破骨細胞(圖5E-F)。此外,通過免疫標記證實了Ctsk和Trap水平的增加(圖5G-H)。Mapk1和FoxO1 siRNA誘導的破骨細胞分化也通過測量Trap活性得到證實(圖5I)。接下來,我們研究了Mapk1 siRNA介導的破骨細胞分化是否依賴于FoxO1。無論FoxO1融合蛋白存在與否,破骨細胞的分化都得到促進(圖5J)。這一發現表明,盡管FoxO1的表達在對Mapk1 siRNA的反應中被抑制,并且FoxO1下調影響破骨細胞分化,FoxO1對于由Mapk1 siRNA誘導的破骨細胞的分化不是必需的。
6)富含miR-92a-1-5p的EVs在體內促進骨溶解
最后,我們研究了miR-92a-1-5p+EVs在體內的作用(圖6A)。微計算機斷層掃描(micro-CT)的結果顯示,miR-92a-1-5p EVs組每骨體積骨表面積(BS/BV)增加,小梁厚度(Tb.Th)減少,兩者均表明骨中存在骨溶解(圖6B-C)。此外,Trap染色顯示miR-92a-1-5p+EVs組中破骨細胞增加(6圖D),同時MAPK1和FoxO1減少(圖6E-F)。
結論
總之,我們報道了一種富含miRNA的EVs構建系統,以構建富含miR-92a-1-5p的PCa-EVs亞群。進一步,我們闡明了這種設計的EVs在骨溶解中的作用和機制:富含miR-92a-1-5p的PCa EVs通過MAPK1和FoxO1介導破骨細胞分化,這可能有利于未來成骨細胞性骨病的治療。
實驗方法
細胞外囊泡分離,WB,qPCR,熒光素酶報告試驗,動物研究,Micro?CT。
參考文獻
Yu L, Sui B, Zhang X, Liu J, Hao X, Zheng L. miR-92a-1-5p enriched prostate cancer extracellular vesicles regulate osteoclast function via MAPK1 and FoxO1. J Exp Clin Cancer Res. 2023 May 2;42(1):109. doi: 10.1186/s13046-023-02685-2.