干燥綜合征（SS）是一種以口干和眼干為特征的慢性、全身性自身免疫性疾病，好發于絕經期女性。口干癥是一種臨床常見的由唾液分泌不足引起的疾病，可導致吞咽困難、齲齒、牙周病等。隨著疾病發展，約2/3的SS患者出現全身免疫功能紊亂。外泌體是一種直徑40~150nm的細胞外囊泡，攜帶多種生物分子，可以轉移到受體細胞。據報道，間充質干細胞來源的外泌體（MSC-Exos）有助于細胞間通訊，已顯示出治療包括SS在內的各種炎癥性疾病的潛力。牙髓干細胞（DPSCs）是從牙髓組織中分離得到的一種間充質干細胞，具有高度增殖和較低的免疫原性。過去幾年中，研究人員主要利用DPSCs來源的外泌體（DPSC-Exos）來治療系統性疾病，因為它們具有抗凋亡、抗炎和再生等特性。然而，DPSC-Exos在緩解SS患者口干和恢復涎腺功能方面的療效尚不明確。該研究發表在《Journal of Translational Medicine》，IF：7.4。
技術路線

示意圖

主要研究結果
1. 牙髓干細胞（DPSCs）的分離、培養和鑒定
       分離人DPSCs，并在倒置相差顯微鏡下觀察不同代次的培養和細胞膜片培養（圖1A）。DPSCs呈成纖維樣細胞形態。DPSCs高表達MSCs表面標志物CD29（99.9%）、CD90（99.9%）、CD105（99.9%）和CD44（99.5%）。造血細胞標志物CD34、CD45、CD19和HLA-DR表達<1%（圖1B），表明DPSCs具有低免疫原性。多譜系分化實驗顯示了DPSCs的成骨（圖1C）、成脂（圖1D）和軟骨分化（圖1E）潛能。作者的結果證實了該研究中使用的DPSCs的MSC表型。

圖1 DPSCs的分離和鑒定

2. DPSC-Exos的分離和鑒定
       采用超速離心法從DPSCs細胞片層條件培養基中分離DPSCs-exos。透射電鏡顯示，DPSC-Exos呈現典型杯狀形態的雙層膜結構（圖2A）。NTA顯示了DPSC-Exos在30-150nm的粒徑分布（圖2B）。DPSC-Exos表達典型的外泌體標志物ALIX、TSG101和CD63（圖2C）。在共培養的4小時內，DPSC-Exos很容易在SGEC中內化（圖2D）。總之，這些數據表明成功分離出了可內化于SGEC中的DPSC-Exos。

圖2 DPSCs膜片釋放外泌體（DPSC-Exos）的分離和鑒定

3. DPSC-Exos部分恢復了IFN-γ誘導的SGEC死亡和AQP5的下調
       浸潤淋巴細胞分泌的IFN-γ可誘導SS相關的導管細胞凋亡，從而損害腺體分泌功能。因此，IFN-γ通常在體外用于模擬SS期間唾液腺的炎癥條件。在這項研究中，IFN-γ處理12 h顯著抑制了SGEC的增殖（圖3A）。為驗證DPSC-Exos對IFN-γ誘導SEGC死亡的影響，在SGEC中分別加入不同濃度(5、20、80 g/ml）的DPSC-Exos處理24、48、72 h。與IFN-γ組相比，20、80μg/ml DPSC-Exos處理組在48、72 h增殖逐漸增加（圖3A）。這些結果表明，DPSC-Exos具有減輕SS期間炎癥抑制的SGEC增殖的潛力。
       RT-qPCR檢測不同濃度DPSC-Exos處理SGEC 48 h后內源性AQP5轉錄水平的變化。IFN-γ組AQP5 mRNA相對表達量顯著降低。DPSC-Exos恢復了IFN-γ對AQP5表達的抑制作用（圖3B）。在蛋白質印跡分析中，與IFN-γ處理組相比，DPSC-Exos（20 μg/ml）處理組AQP5表達較高（圖3C，D）。在免疫熒光分析中，與IFN-γ處理組相比，DPSC-Exos（20 μg/ml）組AQP5的熒光強度顯著增加（圖3E，F）。這些數據表明，在SS期間，DPSC-Exos具有上調SGEC中AQP5表達的潛力。

圖3 DPSC-Exos挽救了IFN-γ引起的唾液腺上皮細胞（SGEC）死亡和AQP5下調

4. IFN-γ預處理的SGEC和DPSC-Exos的轉錄組分析
       在IFN-γ預處理的SGEC中加入或不加入DPSC-Exos（20 μg/ml）進行RNA測序，以鑒定差異表達基因（DEGs）。首先，主成分分析（PCA）顯示了組間數據的獨立性，說明數據具有可比性（圖4A）。與IFN-γ組相比，DPSC-Exos組共發現304個DEGs，其中142個上調，162個下調。GPER是DPSC-Exos組中上調的DEGs之一（圖4B）。根據基因本體（GO）富集分析，GPER在SGEC中的雌激素16-α-羥化酶活性中起作用（圖4C）。根據京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，GPER在cAMP信號通路、唾液分泌和雌激素信號通路中起作用（圖4D）。DEGs與STRING數據庫的交互關系分析顯示，唾液分泌、cAMP信號通路、雌激素信號通路之間存在相互作用（圖4E）。此外，重疊分析顯示GPER是參與這3條信號通路相互作用的關鍵DEG（圖4F）。這些數據表明，DPSC-Exos組過表達的GPER可能在改善SGEC活性中發揮作用。

圖4 經或不經DPSC-Exos處理的唾液腺上皮細胞的轉錄組分析

5. DPSC-Exos組GPER表達量較高
       熱圖顯示DPSC-Exos處理的SGEC中GPER上調（圖5A）。相關熱圖顯示GPER與唾液分泌相關的DEGs密切相關（圖5B）。免疫熒光分析顯示，IFN-γ組中GPER表達下調，DPSC-Exos恢復了IFN-γ抑制的SGEC中GPER表達（圖5C，D）。蛋白質印跡分析分析證實，與IFN-γ組相比，DPSC-Exos組中GPER表達較高（圖5E，F）。這些數據表明，DPSC-Exos具有上調IFN-γ處理的SGEC中GPER表達的潛力。

圖5 DPSC-Exos誘導唾液腺上皮細胞GPER表達

6. DPSC-Exos治療減輕了NOD/ltj小鼠的口干癥并恢復了唾液腺功能
       作者使用NOD/ltj小鼠作為初級SS模型，該模型獨特地表現出唾液腺功能障礙，伴有外分泌腺中白細胞浸潤的出現和許多已知遺傳差異的同源品系。按照圖6A中所示進行動物研究。16周齡NOD/ltj小鼠的唾液流率較6周齡NOD/ltj小鼠降低。10周的DPSC-Exos治療穩健地促進了NOD/ltj小鼠的唾液流率（圖6B）。DPSC-Exos治療對唾液流率的影響甚至比羥氯喹治療（陽性對照組）更明顯。HE染色顯示，NOD/ltj小鼠腺管周圍腺泡空泡化明顯，腺體嚴重萎縮。與PBS處理的NOD/ltj小鼠相比，在HCQ和DPSC-Exos處理的NOD/ltj小鼠中，唾液腺中淋巴細胞浸潤灶的數量和面積顯著減少（圖6C）。基于DPSC-Exos改善了NOD/ltj小鼠的唾液分泌障礙，作者接下來研究了參與唾液分泌的關鍵蛋白AQP5和GPER在下頜下腺中的表達。免疫組織化學（圖6D，E）顯示，與PBS組相比，DPSC-Exos組腺泡細胞膜上的AQP5免疫染色，特別是頂端膜上的AQP5免疫染色強增強。與PBS組相比，DPSC-Exos組的GPER表達也上調（圖6F，G）。相反，GPER常在基底膜中著色，這與AQP5免疫染色不同。抗SSA/Ro和抗SSB/La抗體與SS患者較高的發病率相關。因此，對SS的臨床診斷具有重要價值。DPSC-Exos和HCQ處理可下調NOD/ltj小鼠的抗SSA/Ro和抗SSB/La血清水平（圖6H）。作者進行了蛋白質印跡測定（圖6I，J）和RT-qPCR實驗（圖6K）來檢測AQP5在小鼠下頜下腺中的表達水平。與PBS組相比，DPSC-Exos組和HCQ組AQP5的mRNA和蛋白表達水平均上調。這些數據表明，DPSC-Exos可上調下頜下腺中AQP5和GPER的表達。

圖6 DPSC-Exos治療減輕了NOD/ltj小鼠的SS樣癥狀

7. DPSC-Exos通過GPER介導的cAMP/PKA/CREB信號通路上調SGEC中AQP5的表達
       GPER的激活刺激cAMP的產生和細胞內鈣動員。作者分析了不同處理條件下SGEC中cAMP/PKA/CREB信號通路中AQP5、GPER、PKA（p-PKA）和CREB（p-CREB）4種顯著蛋白的表達。與IFN-γ組相比，DPSC-Exos組AQP5、GPER、PKA和CREB表達量較高（圖7A-E）。這一作用可被G15（GPER抑制劑）消除。不同處理條件下SGEC中cAMP水平的結果與蛋白質印跡分析結果一致（圖7F）。AQP5在非刺激條件下存在于脂筏中，當細胞內鈣離子濃度升高時，AQP5可以移動到頂端質膜。因此，鈣信號是AQP5短期調控的核心信號。流式細胞術結果顯示，DPSC-Exos組的細胞內Ca²⁺水平比IFN-γ組高約4倍，而G15處理消除了DPSC-Exos對細胞內Ca²⁺水平的影響（圖7G）。這些結果表明，DPSC-Exos通過GPER介導的cAMP/PKA/CREB信號通路恢復了IFN-γ對SGEC的抑制功能。

圖7 DPSC-Exos通過GPER介導的cAMP-PKA-CREB通路減輕了IFN-γ引起的唾液腺上皮細胞（SGEC）中AQP5的表達下調

結論
       DPSC-Exos部分挽救了SS相關的炎癥誘導的SGEC死亡。SS相關炎癥降低了SGEC中唾液分泌標志物AQP5的表達，而DPSC-Exos逆轉了這一作用。DPSC-Exos治療減輕了NOD/ltj小鼠的腺體炎癥并增加了唾液流率。DPSC-Exos處理上調SGEC中的GPER，進一步激活cAMP-PKA-CREB信號通路，促進唾液分泌。該研究結果表明DPSC-Exos可能用于SS治療。

實驗方法
動物實驗，免疫組織化學，CCK-8檢測，實時定量PCR（RT-qPCR），蛋白質印跡，免疫熒光，mRNA測序，生物信息學分析，酶聯免疫吸附測定（ELISA）
參考文獻
Hu S, Chen B, Zhou J, Liu F, Mao T, Pathak JL, et al. Dental pulp stem cell-derived exosomes revitalize salivary gland epithelial cell function in NOD mice via the GPER-mediated cAMP/PKA/CREB signaling pathway. J Transl Med. 2023 Jun 3;21(1):361.